يتم عرض طريقة لزرع أومينتال من الجزر الصغيرة في ماوس. الجزر الصغيرة المعزولة مختلطة مع المائية ويوضع الخليط داخل الحقيبة أومينتال بالماوس السكري. ثم يتم رصد الجلوكوز في الدم، وإجراء التحليل المناعية histochemical.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة لزرع جزيرة ليلى إلى الثرب في الماوس
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
واقترح زرع جزيرة ليلى يكون علاج محتمل لمرض السكري من النوع 1. الأخيرة أدلة مقنعة تشير إلى أن ضخ جزيرة منتثر داخل الأوعية بعيدة عن المثالية وبالتالي، عادت إلى الظهور كموقع يحتمل أن تكون قيماً لزرع جزيرة ليلى الثرب. وتتطلب هذه التجربة عزلة الجزر الصغيرة ذات جودة عالية وغرس الجزر إلى المستلمين السكري. زرع الأعضاء الثرب يتطلب الخطوات الجراحية التي يمكن تحسين أداءهم بصريا. هنا، يتم عرض خطوات تفصيلية لهذا الإجراء. ويرد هنا طريقتين لخلط الجزر المنعزلة مع hydrogel قبل وضع الخليط في الحقيبة أومينتال من الفئران السكري. الهلاميات المائية المختلفة المستخدمة لمختلف الظروف. وتم رصد مستويات السكر في الدم من المستلمين الماوس السكري من الجزر سينجينيك في الثرب مدة تصل إلى 35 يوما. تم التضحية ببعض الحيوانات بعد 14 يوما لإجراء تحليل histochemical المناعية. يمكن استخدام هذا النهج زرع قبل الإكلينيكية كالبيانات الأولية المؤدية إلى الترجمة إلى زرع السريرية.
المقدمة
حسب الدولية السكري الاتحاد (جيش الدفاع الإسرائيلي)، مرض البول السكري يؤثر حاليا 382 مليون شخص، مع زيادة المتوقعة إلى 592 مليون شخص قبل 20351. في زرع جزيرة متمكنة وإكسينوجينيك على حد سواء، ضروري العلاج كآبته الجهازية. دون الكبت المناعي، الرفض المناعي سببا رئيسيا ل فقدان الفساد2. وهناك أيضا مشكلة كبيرة من جزيرة زرع خسارة بسبب أن الدم الفورية بوساطة تفاعل (إيبمير)3،4. ومع ذلك، حتى في حالة عدم استجابة مناعية مثل سينجينيك أو نماذج السيارات-زرع الأعضاء، والخلايا جزيرة ليلى التي زرعها في الكبد عن طريق الوريد البابي يتم فقدها بسبب التهاب و/أو للظروف البيئية غير المواتية، مثل ضعف الدم توريد مع انخفاض الأوكسجين و/أو المواد الغذائية5،6. كنتيجة لذلك، بغية ضمان وظيفة التمثيل الغذائي الطويل الأجل، أعلى جزيرة الأرقام اللازمة للتعويض عن فقدان الخلية الأولى التي تقلل من انجرافتمينت7.
في محاولة لتحسين انجرافتمينت جزيرة ليلى، العديد من المواقع التشريحية بديلة تم التحقيق تجريبيا، فضلا عن سريرياً، مع واعدة، ولكن لا نهائي يؤدي إلى8. بينما بعض المواقع البديلة التي توفر الوصول السهل والأمن (على سبيل المثال.، والجلد، كبسولة الكلي والمعدة سوبموكوسا والغرفة الأمامية للعين) أو على سطح أوسع لأكبر جزيرة الجماهير (مثلاً.، التجويف الصفاقى)، البقاء على قيد الحياة والفسيولوجية أداء الأيضية الجزر زرع لا تزال محدودة، ويظل قلق9. ويجري البحث عن موقع مناسب أكثر لجزيرة انجرافتمينت.
الثرب كان من بين العديد من المواقع التشريحية التي تم التحقيق في التطور المبكر لزرع جزيرة ليلى، وأثبت بيئة ناجحة للجزر الصغيرة10،11،،من1213، 14. ومع ذلك، ضخ جزيرة إينترابورتال أصبح الواجب خيار السريرية في جزء منه إلى البساطة النسبية للإجراء ونماذج النجاح المبكر في الحيوان6. أيضا، في جزء منه، السلبيات المرتبطة بهذا الموقع، خسائر فادحة لا سيما في جزيرة ليلى مبكرا، كانت أقل تقييد مفهومة وأقل في الأيام الأولى لزرع جزيرة التجريبية كالحقل نضجت. مع أدلة دامغة أكثر الأخيرة مشيراً إلى أن ضخ منتثر داخل الأوعية جزيرة بعيدة عن مثالية، الثرب عادت إلى الظهور كموقع يحتمل أن تكون قيماً لزرع الخلايا.
الثرب (في شكل الحقيبة omental) يوفر مزايا نسبية على الكبد15،16. وفاسكولاريزيد جيدا والوصول إليها بسهولة. أنها تسمح لاسترجاع الاختلاس (إذا لزم الأمر) و/أو خزعة. هو تخفيض فترة الدماغية من ذوي الخبرة بالجزر الصغيرة مقارنة بالكبد، ويمكن أن يقبل الثرب نسبيا الجماهير الكبيرة من جزيرة ليلى التي لا يمكن إينترابورتالي، حيث ارتفاع في الضغط المدخل يمكن أن تسبب مضاعفات.
تم استخدام نموذج ماوس سينجينيك لزرع الأعضاء في البروتوكول باختبارها في الدراسة، وتوظيف C57BL/6 الفئران الذكور بين 6 – 8 أسابيع من العمر مع وزن جسم من 20 – 25 زاي جزيرة المستلمين صدرت السكري بحقنه واحدة من بالستريبتوزوتوسين مع جرعة من 250 الملكية الفكرية مغ/كغ. التعريفي مرض السكري يمكن أن تعتبر ناجحة إذا كان مستوى السكر في الدم من الماوس هو أكبر من 24 مليمول/لتر 48 ساعة بعد الحقن، ويظل فوق هذا المستوى لمدة 5 أيام على الأقل.
الجزر سينجينيك بمعزل عن البنكرياس المانحين مطابقة العمر اتباع أساليب سبق نشرها مع بعض التعديلات. وباختصار، كان حقن كولاجيناز المرارة بدلاً من القناة الصفراوية. وقد تم ذلك كتحسين لتيسير سهولة الحقن. وكان ضخ كولاجيناز متبوعاً بالحضانة، واختلال الأنسجة، كثافة الفصل التدرج واليد-الانتقاء للحصول على الجزر نقية. الجزر الصغيرة كانت مثقف بين عشية وضحاها في كمرل-1066 المتوسطة وتستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) في قوارير T175 في 37 درجة مئوية، تحت الهواء-5% 95% CO2 قبل الزرع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتم الحصول على جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من المقاطعة "مركز قوانغدونغ الحيوان الطبية". وأقر استخدام الحيوانات في الأخلاقيات استعراض اللجنة من شنتشن الثانية مستشفى الشعب، وفقا لمبادئ الرفق بالحيوان.
1-جزيرة الزرع الثرب
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول 2 أشخاص لإنجاز.
- تجميع المواد الجراحية التي يتم سردها في الجدول 1. إعداد الميدان العقيم في المجال الجراحي مع مواد معقمة مثل الستائر ومرة واحدة والحفاظ على ظروف معقمة طوال عملية جراحية. تعقيم الأدوات الجراحية كافة. ارتداء العباءات العقيمة.
- اختيار الجزر الصغيرة استخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر تحت ستيريوميكروسكوبي. وسيتلقى كل الماوس 450 – 500 جزيرة يعادل (إيك) كل تانسبلانت. لكل الحيوانات، ضع الجزر ما يكفي لعملية زرع واحدة إلى أنبوب معقم 1.5 مل أعلى الأداة إضافية مع 100 ميليلتر من المتوسطة كمرل-1066.
ملاحظة: يمكن أن تكون معزولة الجزيرات اليوم من زرع، لكن من الأفضل لعزل لهم قبل يوم واحد للسماح باسترداد لعملية العزل. - الحفاظ على أنابيب أعلى الأداة الإضافية مع الجزر الصغيرة على الجليد حتى جاهزة زرع الأعضاء.
- ذوبان الجليد المائية مصفوفة الغشاء وإبقائه على الجليد بعد إزالته من الثلاجة-20 درجة مئوية. المائية السائلة في 4 درجات مئوية إلى 10 درجات مئوية ويتصلب في درجات حرارة أعلى.
- تزن والوسم جميع الفئران المستفيدة السكري. حقن 60 ملغ/كغ بينتوباربيتال الصوديوم إينترابيريتونيلي. اختبار عمق التخدير بإدارة قرصه أخمص القدمين. تعطي صوديوم بينتوباربيتال إضافية 10 مغ/كغ إذا الحيوان يتفاعل مع رشة. إذا كان هناك لا سحب العاكسة، ومستوى التخدير الصحيح لإجراء عملية جراحية.
- مسحه موقع الجراحية في البطن باستخدام الإيثانول 70%. حلاقة الشعر من الموقع مع شفرة الماسح وتطهير المنطقة مع إيودوفور. إدارة البيطري مرهم للعين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- استخدام مقص العيون لفتح البطن على طول خط الوسط البطن مع شق من 4 إلى 5 سم. تحرك الأمعاء إلى الجانب الأيسر وتغطي بشاش غارقة المالحة منع الجفاف المفرط أثناء إجراء عملية جراحية.
- استخدام مسحات القطن لفضح المجال البصري المعدة تماما وموقع الثرب (أسفل المعدة). استخدام اثنين من زوج من الملقط غرامة إلى انتفخ في الثرب. العناية لمنع الضرر من تمزق.
- تماما هو مذاب المائية عند هذه النقطة. تدور الأنبوب مع الجزر لمدة 30 ثانية في 200 × ز وإزالة المادة طافية. نضح 50 ميليلتر من المائية، إضافة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الجزر، وريسوسبيند هذا المزيج بلطف تجنب تشكيل فقاعات. تبقى هذه الأنابيب على الجليد أثناء الإجراء.
- استخدام اثنين من زوج من الملقط لالتقاط حواف الثرب ورفعه برفق لتشكيل أخدود بين جدار المعدة والأمعاء التي يمكن أن تستوعب كمية صغيرة من السائل مع الاختلاس جزيرة ليلى.
- واسمحوا الشخص الثاني مساعدة في الإجراء ونضح الخليط حراكه ايميا-المائية (كامل محتويات الأنبوب) مع تلميح ماصة 200 ميليلتر، تسليم المحتوى في الاخدود.
- ضمان أن الخليط هو في وضع جيد في الاخدود بلطف رفع أو خفض حواف الثرب. استكمال وضع الخليط داخل 3 دقيقة قبل المائية يتصلب كأثر لدرجة حرارة الجسم. بعد تعيين المائية، أمثال الثرب لتغطية الفساد.
ملاحظة: الثرب ستلتزم بالجدار المعدة المحيطة بها كما يقوي المائية. - بعد تماما هو توطد المائية، استخدام مسحات القطن لتغيير موضع الأمعاء مرة أخرى في تجويف البطن، مع الحرص على عدم لمس الموقع لزرع الأعضاء.
- إضافة 20 ميليلتر من السيفالوسبورينات (5 ~ 10 ملغ) في تجويف البطن للوقاية من العدوى، ثم استخدم خياطة 4-0 لإغلاق البطن.
- العودة الماوس إلى قفصة وكرر جميع الخطوات لكل مستلم الماوس. الدفء في الفئران ورصد بصريا حتى أنهم تماما يستعيد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. تبقى الفئران منفصلة عن غيرها من الحيوانات حتى أنهم شفوا تماما.
- حقن 50 ميليلتر من سيفازولين صوديوم (0.05 مغ/مل) كل يوم لمدة أسبوع اتقاء ما بعد الجراحة. إدارة بوبيفيكايني + البوبرينورفين، أي تطبيق 1-3 قطرات من 0.25% بوبيفيكايني في موقع شق موضعياً قبل وضع مقاطع الجرح. إدارة Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) عن طريق (IP) داخل.
- قياس مستوى الجلوكوز في الدم غير الصيام من عينة دم الوريد ذيل باستخدام مقياس جلوكوز دم مرة واحدة في يوم بعد عملية الزرع. عندما زرع الثرب، الاختلاس جزيرة ليلى فقد وظيفة تأخر ولا تصل إلى مستوى جلوكوز دم طبيعي تماما لمدة 2 – 3 أسابيع.
- للأنسجة، إزالة الفساد أومينتال من الماوس في نهاية التجربة بعد زرع الأعضاء. إصلاح الأنسجة وفقا للبروتوكولات النسيجي. يمكن تحليلها الاختلاس للدراسات إيمونوستينينج أو الفلورة.
2-الأسلوب البديل لزرع الأعضاء الثرب
ملاحظة: يمكن الاستعاضة المائية بديلة-فيبرينوجين ثرومبين الذي يستخدم عند درجة حرارة الغرفة للمائية مصفوفة الغشاء. وهو يتألف من مكونات 2، حل بروتين السدادة فيبرينوجين (50 ثرومبين يو/مليلتر والفيبرينوجين 10 ملغ/مل). عندما يتم خلط المكونات، فإنها تشكل جلطة أن يحمل الجزر في مكان.
- استخدام هيدروجيل فيبرينوجين-ثومبين مجمع في درجة حرارة الغرفة. كما هو الحال في الخطوة 1، 2، سوف تتلقى كل الماوس 450 – 500 جزيرة مكافئات (إيك) كل زرع. مكان في الجزر الصغيرة في أنبوب معقم 1.5 مل أعلى الأداة إضافية مع 100 ميليلتر من المتوسطة كمرل-1066. فورا قبل الزرع، نضح في الجزر الصغيرة في أنابيب PE50 عقيمة لطول 10 سم والطرد المركزي بلطف (30 ثانية في 200 س ز) لتشكيل بيليه فضفاضة.
- إعداد الحيوانات كما ذكر أعلاه (خطوات 1.5-1.8) مع الثرب انتشرت. خلط المكونات المائية (10 ميليلتر/كل) وعلى الثرب. (الشكل 3D)
- فورا طرد الجزيرات من الأنبوب إلى المائية. المائية تشكل جلطة حول الجزر. (رقم 3E)
- إضعاف في الثرب المائية والجزر الصغيرة لتشكيل حقيبة. (الرقم 3F) تابع مع الخطوات 1.13 إلى 1.18.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1Aالدولة بوستديجيستيفي في البنكرياس. ويبين الشكل 1Bالجزيرات المنقي. تلطيخ ديثيزوني واختبار صلاحية للجزر الصغيرة تظهر في الشكل 2. الخطوات الأساسية لزرع جزيرة ليلى الثرب مبينة في الشكل 3. وترد في الشكل 4مستويات السكر في الدم للمستلمين بعد زرع أومينتال. ويبين الشكل 5التحليل النسيجي الطعوم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
زرع جزيرة ليلى إلى الكبد عن طريق الوريد البابي هو الأكثر استخداماً طريقة لزرع جزيرة ليلى في البشر، ولكن لا تزال هناك شواغل السلامة والكفاءة مثل الوريد البابي تجلط الدم والكبد ذلك17. وتظهر الدراسات الأخيرة أن الثرب قد تكون بديلاً مناسباً للكبد، ولكن أكثر الاحتياجات البحثية تجري قبل الترجمة السريرية12،14،،من1819.
الفأر نموذج مناسب للاختبار في ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
واضعي التقرير لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
بعض الكتاب هذا العمل تدعمها جزئيا المنح المقدمة من الوطنية المفتاح R & د البرنامج الصيني (2017YFC1103704)، ومشروع سانمينغ الطب في شنتشن (SZSM201412020)، صندوق "ارتفاع المستوى الطبي الانضباط البناء من شنتشن" (2016031638)، شنتشن مؤسسة للعلوم والتكنولوجيا (JCJY20160229204849975، GJHZ20170314171357556، JCYJ20160425110110658)، مؤسسة شنتشن للصحة ولجنة تنظيم الأسرة (SZXJ2017021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>معدات< / قوي> | |||
| 5 بوصة (12-13 سم) مقص | RWD علوم الحياة ؛ | S12030-11 | |
| ملقط ناعم | RWD Life Science | F11010-13 | |
| مقاطع الجرح الصغيرة | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 زوج ملقط الأنسجة | RWD علوم الحياة | ؛ F13023-10 | |
| 4-0 خياطة بإبرة | تشنغهي ، الصين | 17094 | |
| 200 مو ؛ L ماصة ونصائح | جيلسون | PN11 | |
| بلمسة واحدة فائقة السهولة نظام مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم الأساسية | جونسون & أمبير جونسون | 33391713 | |
| شفرة الحلاقة | فيليبس | HC1099 / 15< | |
| قوي>المواد< / قوي> | |||
| بنتوباربيتال الصوديوم | Sigmaaldrich.com | P3761 | للتخدير ؛ |
| هيدروجيل | bdbiosciences.com | 356234 | مصفوفة الغشاء القاعدي |
| الفيبرين الثرومبين هيدروجيل ؛ | Baxter.com | 1501250 | تتجلط المكونات عند خلطها |
| 70٪ إيثانول | Yingniu الطبي ، آنهوي ، الصين | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang Medical Technology ، Shangdong ، الصين | 170521 | |
| المحلول الملحي العادي | 2B1324 | ||
| Cephalosporin | Lukang Medical ، Shangdong ، الصين | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| مرهم العين التشحيم | كبرى المستحضرات الصيدلانية | 203964 | |
| الستربتوزوتوسين | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| كولاجيناز النوع الخامس | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 وسائل الإعلام | celltrans ، ونتشو ، الصين | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | أنابيب PE50 المتدرجة الكثافة |
| Braintreesci.com | PE50 100 FT | البولي إيثيلين .023 "× .038 | |
| الكالسين AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| يوديد البروبيديوم | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) | Tissue-Tek ؛ مايلز ، نابرفيل ، إلينوي | 4583 | تضمين |
| الأجسام المضادة للأنسولين | المتوسطة تقنية إشارات الخلية ، دانفرز ، ماساتشوستس 01923 | 8138S | |
| تلطيخ الهيماتوكسيلين | تقنية إشارات الخلية ، دانفرز ، ماساتشوستس 01923 | 14166S | |
| وسائط تلطيخ اليوزين | Beyotime Biotech ، الصين | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. ؛ | D1306 | |
| C57Bl / 6 | مركز الطبية للفئران بمقاطعة قوانغدونغ | / | |
| مصل الأبقار الجنيني | GE Healthcare Life | Sciences SH30084 | |
| T175 قوارير | Falcon | 353112 | |
| 1.5 مل أنابيب Snap-top | Axygen | MCT-150-C |
المراجع
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
