Method Article

المسائل الحجم: قياس "القطر كبسولة" في المرسلة بين

DOI:

10.3791/57171

⸱

February 27th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كبسولة السكاريد هو عامل الفوعة الأساسي بين المرسلة، وحجمه وترتبط بضراوة السلالة. قياسات قطرها كبسولة وتستخدم في اختبار المظهرية وقياس الفعالية العلاجية. ويرد هنا أسلوب قياسي لتحريض كبسولة، والمقارنة بين طريقتين لتلوين وقياس القطر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كبسولة السكاريد من المرسلة بين عامل الفوعة الأساسي وعادة من أهم درس جوانب من هذه الخميرة المسببة للأمراض. الحجم الكبسولة يمكن أن تختلف على نطاق واسع بين السلالات ولديها القدرة على النمو بسرعة عند عرض الظروف المغذيات المجهدة أو منخفضة، وقد تم ارتباطاً إيجابيا بضراوة سلالة. لهذه الأسباب، الحجم الكبسولة من اهتمام كبير للباحثين المرسلة جيم . هو الناجم عن نمو الكبسولة المرسلة جيم- أثناء اختبار المظهرية للمساعدة في فهم آثار المعالجات المختلفة على الخميرة أو حجم الاختلافات بين السلالات. هنا يصف لنا أحد الأساليب القياسية كبسولة التعريفي ومقارنة الأساليب المقبولة اثنين من تلطيخ وقياس القطر كبسولة: الهند الحبر (ط)، ووصمة سلبية، المستخدمة في الاقتران مع الفحص المجهري الخفيفة التقليدية و (ثانيا) تلطيخ يشترك مع الأصباغ الفلورية جدار الخلية وكبسولة تليها مجهرية [كنفوكل] على حد سواء. أخيرا، نحن إظهار كيف يمكن قياس القطر كبسولة من عينات الملطخة بالحبر الهند الآلي باستخدام تحليل الصور الحسابية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤثر على ربع مليون شخص كل عام، وأسفر عن وفاة أكثر من 180,000 سنوياً، المرسلة بين هو من خميرة المسببة للأمراض، وداخل الخلايا والمسبب للفطريات1،2، 3. الأكثر تضررا هم مرضى فيروس نقص المناعة البشرية في البلدان الفقيرة الذين ليس لديهم استعداد الحصول على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، ويجعلها شديدة عرضه ل المرض5،،من46. وتشير البيانات من مركز السيطرة على الأمراض إلى أن في أفريقيا جنوب الصحراء، والمرسلة جيم- يقتل المزيد من الناس من السل سنوياً وشهريا أكثر من أي تفشي فيروس إيبولا في سجل1. الطريق الأكثر شيوعاً للتعرض يحدث من استنشاق الجراثيم يهتمان التي شائعة في البيئة7. عند دخول الرئتين، وهناك عدة عوامل الفوعة التي تسهم في نجاح المرسلة جيم- ضمن الأفراد المصابين. ويعتبر الكبسولة السكاريد عامل الفوعة الأساسي الميكروب، سلالات أكابسولار لا ضراوة8.

كبسولة الفطري تتألف من ثلاثة عناصر هي المبدأ: جلوكورونوكسيلومانان (جكسم)، جالاكتوكسيلومانان (جالكسم)، ومانوبروتينس (MPs)9. بينما النواب عنصرا المرتبطة بجدار الخلية طفيفة نسبيا من الكبسولة، وهي مكسبه ويمكن تعزيز استجابة برو-التهابات معظمهم9،10. وفي المقابل، جكسم وجالكسم يشكلون الجزء الأكبر الكبسولة (> 90% بالوزن)، وقد آثار كآبته11. بالإضافة إلى إثارة إيمونومودولاتوري، إنشاء التوسيع السريع لكبسولة في فيفو حاجز ميكانيكية لابتلاع المضيف الخلايا البلعمية (أي، العَدلات والضامة)12. كبسولة المرسلة جيم وملخص معقدة، ولكن قطر كبسولة عموما، زيادة يرتبط مع ازدياد ضراوة6،،من1314. نظراً لهذا، من المهم للباحثين المرسلة جيم- لتكون قادرة بسرعة ودقة قياس قياسات كبسولة.

الخلية المرسلة C. وفي كبسولة السكاريد الهياكل الحيوية وإظهار التغييرات على مر الوقت15. يمكن تغيير الكبسولة في الكثافة والحجم، والجمعية العامة استجابة للتغيرات في البيئة المضيفة16،،من1718. الحديد منخفضة أو مستويات المغذيات، التعرض لمصل الدم ودرجة الحموضة الفيزيولوجية البشرية وزيادة أول أكسيد الكربون2 معروفة لبدء النمو كبسولة16،18،،من1920. علاوة على ذلك، أظهرت الباحثون التغييرات الهيكلية التي أسفرت عن وجود اختلافات كبيرة في إيمونوريكتيفيتي خلال عدوى، الإقراض ميزة جيم-المرسلة على المضيفة21،22. وهذا يعرف بهيكل الكبسولة المرسلة جيم- قد تم تحليلها في مجموعة متنوعة من الطرق. المجهر الإلكتروني، على سبيل المثال، قد كشفت أن الكبسولة قد مصفوفة متجانسة مع طبقة كثيفة إلكترون داخلية تحت طبقة الخارجي، نفاذية أكثر23. تشتت الضوء، واستخدام الملقط الضوئية مكنت الباحثين لتوضيح خصائص الجزيئات في24. تحليل النتائج من كل القياسات تشتت الضوء والدينامية، ونحن نعلم أن الكبسولة السكاريد له هيكل تفريعات معقدة23. وقد استخدمت ملاقط بصرية لاختبار صلابة الهيكل، فضلا عن تقييم بجسم مفاعليه24. ومع ذلك، تحليل العاملين أكثر في كثير من الأحيان الكبسولة المرسلة جيم- هو قياس حجمه.

لقياس الحجم الكبسولة، استخدم الباحثون ما ينبغي أن يكون قياس بسيطة: قطر خطي الكبسولة. وتستخدم المجاهر الرقمية لالتقاط صور متعددة الخلايا المرسلة جيم (عموما مئات) ملطخة بالحبر الهند أو صبغات الفلورسنت. ويقاس حجم كل خلية الجسم والكبسولة المحيطة بها. يتم تجميع البيانات، ويتم حساب متوسط قطرها الكبسولة عن طريق طرح قطر جسم الخلية من القطر كله خلية (خلية الجسم + كبسولة). حتى هذه اللحظة، تم تنفيذ هذه القياسات يدوياً. بينما عموما دقيقة، يحتوي هذا الأسلوب عيوب للباحثين. مجموعات كبيرة من البيانات يمكن أن تأخذ أيام أو حتى أسابيع لتحليل باليد. ونظرا لأن هذه القياسات تتم يدوياً، الذاتية والأخطاء البشرية قد تؤثر على النتيجة.

تحليل الصور الحاسوبية المؤتمتة أصبحت أداة لا غنى عنها للباحثين في كثير من مجالات بيولوجيا الخلية الجزيئية، تمكين تحليل الصور البيولوجية 25،،من2627أسرع وأكثر موثوقية. تقنيات تحليل الصورة الدقيقة ضرورية للمعلومات الكمية عن ما غالباً ما تكون معقدة وهائلة من مجموعات البيانات المتعلقة بالألغام. ومع ذلك، بعض القياسات، لا سيما قياس كبسولة المرسلة جيم ، كان من الصعب على أتمتة. دقة تحديد الواجهة بين جدار الخلية وكبسولة، الذي يظهر عادة كعصابة الظلام عند تصويرها بالفحص المجهري المرحلة-على النقيض، يمكن أن تكون مزعجة لحل باستخدام عتبة بسيطة. علاوة على ذلك، الخلايا المرسلة جيم في الثقافة تميل إلى أن تتجمع معا وتقسيم دقيق للخلايا اللازمة لقياسات دقيقة.

وكان الهدف من هذا المشروع (ط) توضيح أحد البروتوكولات القياسية لتحريض كبسولة في المرسلة جيم، (ثانيا) قارن وعلى النقيض الحبر الهند وتلطيخ الأسفار كما أنها تتصل بكبسولة قياسات القطر، (ثالثا) تطوير بسيط، الطرق الحسابية لقياس القطر كبسولة استخدام الصور للهند الحبر الملون الخلايا باستخدام برنامج تحليل صورة، و (رابعا) تقييم فوائد وتقييدات لقياس القطر كبسولة يدوياً واستخدام برامج التشغيل الآلي. أننا نجد أن الأسلوبين المصبوغة، فلوري وسم جدار الخلية وكبسولة، بينما أكثر استهلاكاً للوقت، وتقدم نتائج أكثر اتساقا بين التجارب. بيد أن كلا الأسلوبين مكن لنا أن نميز بنجاح بين مختبر والسريرية المرسلة جيم- كبسولة سلالات العارضة مختلفة الأحجام. علاوة على ذلك، كنا قادرين على أتمتة قياس القطر كبسولة من الهند الحبر الملون الصور، ووجدت أن هذا بديل قابل للتطبيق للقياس اليدوي من الكبسولة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: المرسلة جيم- ممرض 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2) والباحثون العاملون معها يجب اتخاذ الاحتياطات المناسبة. إجراءات مفصلة على كيف أن بأمان العمل مع الكائنات الممرضة BSL-2 يمكن الاطلاع على المركز مكافحة الأمراض (CDC) موقع على شبكة الإنترنت، لكن من المهم أن نلاحظ أن جميع الأشخاص ملامسة المرسلة جيم- ينبغي تدريب بشكل صحيح في التعامل مع العوامل المسببة للأمراض، وينبغي دائماً ارتداء المناسب معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، مطاط عموما أو قفازات النتريل. علاوة على ذلك، ينبغي أن مختومة الدوارات في أجهزة الطرد المركزي لمنع هباء العينات وأي انسكابات تنظيف فورا باستخدام حل التبييض 10%28.

1-كبسولة التعريفي

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة إلا إذا ذكر خلاف ذلك.

  1. الثقافة المرسلة جيم في الخميرة ببتون سكر العنب (YPD) مرق (درجة الحموضة 6.5 +/--0.2) واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز حتى وهم في مرحلة تسجيل (حوالي 18-36 ح).
  2. خلايا أجهزة الطرد المركزي في 870 x ز لمدة 5 دقائق في 21 درجة مئوية ويغسل ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  3. استخدام هيموسيتوميتير (أو عداد الآلي خلية) لحساب عدد الخلايا وريسوسبيند في 2 × 105 خلايا/2 مل في وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى في دولبيكو (دميم).
  4. للحث على الكبسولة، احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 18.
    ملاحظة: المزيج من غياب العناصر المغذية في وسائل الإعلام، ووجود CO2 يحفز نمو كبسولة المرسلة جيم .
  5. بعد انتهاء الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق سينتريفوجينج (كما هو مذكور أعلاه) وإزالة جميع ولكن 5-10 ميليلتر طافية. في الوقت نفسه، حصاد عينة خلايا المستحثة الأمم المتحدة مقابلة لكل سلالة يمكن قياسها. استخدام هذه كعناصر سلبية.
    ملاحظة: الكريات الخلية سوف تكون صغيرة جداً وقد يكون من الصعب أن نرى. كن حذراً عند يسفط المادة طافية.
  6. وصمة عار مع الهند الحبر (قسم 2.1) أو الأصباغ الفلورية (القسم 2-2).

2-تلوين

  1. التلوين باستخدام الحبر الهند فقط
    1. لوصمة عار الخميرة بالحبر الهند، ريسوسبيند بيليه في المادة طافية المتبقية وإضافة 4μL (حوالي النصف) من تعليق خلية و 4μL من الحبر الهند على شريحة الميكروسكوب زجاجية. بلطف المزيج وتجنب الإرغاء.
    2. تطبيق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.
  2. التلوين بالأصباغ الفلورية فقط
    1. لوصمة عار الخميرة مع صبغة فلورسنت، ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني ميليلتر 50 مع ألبومين المصل البقري 1% (BSA).
    2. احتضان الثقافة مع حجم متساوية من كالكوفلور الأبيض (CFW) (1 ميكروغرام/مل) و (انظر الجدول للمواد) مترافق ماب كبسولة 18B7 إلى AlexaFluor488 (AF488) (10 ميكروغرام/مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. الطرد المركزي خلايا في 870 x ز لمدة 5 دقائق في الحضانة بعد 21 درجة مئوية ونضح المادة طافية.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني ميليلتر 10 مع ألبومين المصل البقري 1% (BSA).
    5. "الماصة؛" ميليلتر 8 من تعليق خلية إلى شريحة الميكروسكوب زجاجية.
    6. تطبيق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.
  3. تلطيخ مع الهند الحبر والأصباغ الفلورية
    1. لمقارنة فعالية الحبر الهند تلطيخ بالأصباغ الفلورية أكثر مباشرة، شارك وصمة عار السكان الخلية نفسها مع كلا النوعين من وصمة عار. للقيام بذلك، أولاً احتضان الخلايا مع كبسولة الفلورسنت ووصمة عار جدار الخلية، وفقا للخطوات 2.2.1-2.2.3 على السواء.
    2. وبعد ذلك، "الماصة؛" كميات متساوية (4 ميليلتر) تعليق خلية فلوريسسينتلي الملون والحبر الهند على شريحة زجاجية. المزيج بلطف.
    3. تنطبق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.

3-صورة اقتناء/الفحص المجهري

  1. تصوير الخلايا ملطخة بالحبر الهند.
    1. الحصول على الصور باستخدام مجهر خفيفة قياسية (100 X التكبير).
    2. صورة الحد ني خلايا 50 في كل حالة.
      ملاحظة: سوف تختلف عدد الخلايا في كل حقل، وهذا أمر مقبول. ومن المهم، مع ذلك، أن تداخل الخلايا يوضع كحد أدنى، أن هذه صعوبة قياس (سواء يدوياً أو مع البرامج الآلية). لهذه التجارب، الصور تم الحصول عليها على عمق 16 بت مع أوقات التعرض الأمثل لزيادة تباين الصورة مع تقليل التمويه الناجم عن الحركات الصغيرة من الخلايا.
  2. تصوير الخلايا ملطخة بالأصباغ الفلورية
    1. صورة الخلايا بالميكروسكوب الأسفار، فتح المجهر برامج التصوير وحدد أطوال موجية الإثارة والانبعاثات المناسبة ل fluorophores المستخدمة (CFW و AF488 هي متحمس باستخدام 405nm و 488 نانومتر الأضواء، على التوالي). الحصول على الصور باستخدام مجهر الأسفار.
    2. صورة الحد ني خلايا 50 في كل حالة.
      ملاحظة: سوف تختلف عدد الخلايا في كل حقل، وهذا أمر مقبول. ومن المهم، مع ذلك، أن تداخل الخلايا أن تبقى على الأقل هذه هي صعوبة قياس (سواء يدوياً أو مع البرامج الآلية).
    3. الحصول على سلسلة صورة z-كومة من الخلايا لضمان الحصول على أقصى قطر كبسولة لكل خلية داخل حقل معين.
      1. في مجهر البرمجيات التحكم، وانقر فوق على شريط "z-مكدس" لفتح لوحة تحكم "z-المكدس"، ثم حدد الخيار "الأولى/الأخيرة" في الزاوية اليسرى العليا للوحة.
      2. استخدام عنصر تحكم التركيز غرامة على المجهر إلى التركيز على مستوى أقل من نقطة أوسع من خلية واحدة من خميرة وكبسولات للجميع داخل مجال الرؤية الحالية، وانقر فوق "تعيين أول".
      3. استخدام عنصر تحكم التركيز الجميلة بتركيز أعلى من النقطة أوسع من الجسم الخلية للخلية نفسها والكبسولة لكافة الخلايا الموجودة داخل مجال الرؤية الحالية، ثم انقر فوق "تعيين آخر".
      4. ثم انقر فوق "بدء التجربة" في علامة التبويب "حيازة" اكتساب z-المكدس للموضع الحالي. كرر العملية في مواقف متعددة حتى تم الحصول عليها من صور z-كومة من الخلايا 50 كحد أدنى.
        ملاحظة: لهذه التجارب، والثقب [كنفوكل] تم تعيين إلى 1.0 تم الحصول عليها الاتحاد الأفريقي وسلسلة z متداخلة من شرائح 10-20 تغطي كل 0.7 ميكرومتر في مواقع مختارة. الاتحاد الأفريقي = وحدة متجددة الهواء.
    4. بعد ذلك، تحويل كل سلسلة z-المكدس في أقصى شدتها الإسقاطات (MIP) استخدام برنامج تحليل الصور المناسبة.
      ملاحظة: المشروع MIPs كثافة أكبر في كل طائرة من صورة مكدسة29. إنشاء MIPs يسمح أحد لإنتاج تمثيل ثنائي الأبعاد للصور التي تتوافق مع الخلية كحد أقصى وقطرها كبسولة داخل المكدس ثلاثي الأبعاد الملتقطة.
  3. تصوير الخلايا ملطخة بالحبر الهند والأصباغ الفلورية
    1. الحصول على الصور باستخدام ويديفيلد (40 X التكبير) أو مجهر [كنفوكل] (63 X أو التكبير X 100). للخلايا ملطخة بالحبر الهند والأصباغ الفلورية، التقاط الصور باستخدام مجهر ويديفيلد مجهزة بالمرحلة التي تسيطر عليها الكمبيوتر والنفط الغمر الهدف.
      ملاحظة: يجب أن تسيطر المجهر في الاستخدام باستخدام برامج تصوير CFW. ينبغي أن يتم الكشف عن الأسفار التي هو متحمس من خلال عامل تصفية إثارة 340-380 نانومتر، وينبعث الضوء من خلال مرشح حاجز شمال البحر الأبيض المتوسط 435-485 تنعكس من مرآة مزدوج اللون 400 نانومتر. يمكن متحمس AF488 الأسفار من خلال عامل تصفية إثارة 465-495 نيوتن متر، ويمكن الكشف عن الضوء المنبعثة من خلال مرشح حاجز شمال البحر الأبيض المتوسط 515-555 تنعكس من مرآة مزدوج اللون 505-شمال البحر الأبيض المتوسط.
    2. صورة الحد ني خلايا 50 كل شرط لكل أسلوب المصبوغة.

4-دليل قياس كبسولة

  1. للخلايا ملطخة بالحبر الهند أو البقع الفلورسنت، استخدام برمجيات خلية قياس إلى يدوياً قياس القطر الكبسولة والخلية (انظر الجدول للمواد). للقيام بهذا، انتقل إلى "ملف" > "فتح الصورة" > "التدبير" واستخدام المؤشر لرسم خط مستقيم من خلال أوسع نقطة خلية كاملة (مجموع القطر).
  2. بعد ذلك، انقر فوق "إجراء" مرة أخرى، ورسم خط مستقيم من خلال خلايا الجسم (قطر جسم الخلية).
    ملاحظة: القياسات يتم حفظها تلقائياً على الخلايا.
  3. كرر هذه العملية لكافة الخلايا (الحد أدنى مجموعة/50).
  4. لحفظ الصور بمجرد أنها تقاس، انقر فوق "ملف" > "حفظ باسم" واسم الصور مناسب.
  5. حدد الملفات حديثا المقاسة وتصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات.
  6. حساب متوسط القطر كبسولة باستخدام المعادلة: ([مجموع القطر]-[قطر جسم الخلية]).

5-الآلي قياس كبسولة

ملاحظة: لقياس النجاح الآلي، استخدام الصور 16-بت مع درجة عالية من التباين والتي تتركز بشكل صحيح جنبا إلى جنب مع برنامج تحليل صورة مناسبة (انظر الجدول للمواد). عند التصوير جيم-المرسلة لقياس كبسولة، من المهم التركيز على الحلبة مظلمة في الحدود بين جدار الخلية بالكبسولة. يسمح هذا البرنامج بشكل صحيح تحديد الخلية والكبسولة.

  1. عكس وإنشاء نسخة من كل الهند الحبر الملون صور الخلية باستخدام برامج تحرير الصور مناسبة (انظر الجدول للمواد). للقيام بذلك، انقر فوق "ملف" > "فتح" لفتح الهند الحبر الملون الصور وثم "التحكم" + "الأول" لعكس الصورة. انقر فوق "ملف" > "حفظ باسم" لحفظ الصورة مقلوبة.
  2. لاستيراد الأصلي ومقلوب الصور إلى البرنامج انقر فوق "ملف" > "استيراد تسلسل" > "تحميل الصورة" > "تعريف تسلسل (يدوياً)" > "أبعاد (قناة)" > "استيراد" > "تطبيق".
    ملاحظة: الخلية المرسلة جيم- الهيئات وكبسولات يمكن تحديدها وملثمين باستخدام خوارزميات محددة-يشار إلى 'وصفات'-المدرجة في البرنامج.
  3. استخدام وصفه '"محلل مستعمرة"(الأسفار)' على الصورة المعكوسة لاكتشاف وقناع الجسم الخلية، ثم انقر فوق "تطبيق". في صورة مقلوبة، الحلبة مظلمة تعريف حد الخلية المرسلة جيم- يصبح أكثر إشراقا من الكبسولة المحيطة بها.
  4. استخدم الوصفة '"محلل مستعمرة"(الأسفار)' على الصورة المعكوسة للجزء الهيئات الخلية المرسلة جيم من كبسولات بها، ثم انقر فوق "تطبيق". وهذا يخلق قناع عد. إعادة تسمية هذا القناع العد "خلية الجسم" بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب المسمى "قناع حساب".
    ملاحظة: الوصفة تتكون من خطوات معالجة صورة متعددة: الخلفية، إزالة، والكشف عن الكائن، فصل الكائن، وتصفية مجموعة فرعية.
  5. بعد ذلك، استخدم وصفه '"انتشار الخلايا"' على الصورة الأصلية لكشف وقناع الكبسولة، وانقر فوق "تطبيق". وهذا يخلق قناع عد. إعادة تسمية هذا القناع العد "كبسولة" بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب المسمى "قناع حساب".
  6. استخدام الوصفة، '"كبسولة القسم"'، إنشاء قناع جديد على الصورة الأصلية لتقسيم كبسولات متجاورة من بعضها البعض. للقيام بذلك، انقر فوق "القسم كبسولة" من القائمة المنسدلة الوصفة. في "مربع التقسيم كبسولة"، اختر القناع العد أعيدت تسميته الآن "كبسولة" (5.5) "المنطقة كبسولة". اختر القناع العد أعيدت تسميته الآن "خلية الجسم" "تشفير خلايا" (5.4). اختر "الأصلي" لقناة الإدخال، و "إنشاء قناع لكبسولة المقسمة. انقر فوق "تطبيق
    ملاحظة: الوصفة يولد الخلية وقطرها كبسولة، يعرف بأنه متوسط المحاور الأطول والأقصر عبور مركز الخلية والكبسولة، وقياسات المجال من الكشف عن الأقنعة. العثور على الإخراج الموجود تحت علامة التبويب جدول بيانات في هذا البرنامج. كرر هذه العملية لجميع الصور (على الأقل 50/المجموعة خلايا). معلمات الوصفة يمكن ضبطها لتحسين الكشف عن الصور الفردية أو الأمثل للكشف عن مجموعة من صور متعددة. ويمكن حساب قياسات إضافية بوصفه لتوصيف شامل للخلية والمورفولوجيا في كبسولة.
  7. تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات الاختيار لمزيد من التحليل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوضيح التعريفي كبسولة وتلطيخ الخلية وتصوير وقياس التقنيات، استخدمنا ثلاث سلالات من جيم-المرسلة: سلالة المختبر مشتركة، تتميز جيدا، H99S30، والسلالات المعزولة سريرياً اثنين من سابقا قطر كبسولة غير معروف، B18 و B5231.

ويبين الشكل 1 ألفسير العمل التعريفي الكبسولة وتلطيخ، والحصول على الصور باستخدام الحبر الهند. صور مأخوذة من ثلاث سلالات من جميع مب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى عقود، كانت الكبسولة محاور تركيز رئيسية للبحوث لكل من ميكولوجيستس والأطباء مهتمة المرسلة جيم- وتأتي بسبب دورها كعامل فوعة رئيسية لمسببات المرض. استخدام الفحص المجهري لقياس الاختلافات بين السلالات في الحجم الكبسولة وتحت النمو مختلف الظروف يمكن أن توفر معلومات هامة حول مسببات المرض واستجاباته للمثيرات المختلفة (أي، والظروف البيئية المختلفة، إمكانية العلاج بالعقاقير، إلخ.) هنا، ذكرناها وسيلة لحفز نمو الكبسولة في المرسلة جيم، وكبسولة اثنين مقارنة مختلف البروتوكولات المصبوغة. وأخيراً...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صاحب البلاغ، لأي هوين، هو مدير المنتج في درفيسيون التي تنشر برمجيات تحليل الصورة الآلي، أيفيا.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر برنامج الدكتوراه في العلوم البيولوجية الجزيئية (موبي) وقسم الأحياء في جامعة الدولة تينيسي الأوسط (متسو) لتوفير التمويل اللازم لهذه الدراسة. كان أيضا تمويل المشروع جزئيا بمنحه "مشاريع خاصة" تمنحها "مؤسسة متسو" إلى D.E.N..

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > تحريض كبسولة< / قوي >
< > C. خلايا النيوفورمان < / em>كانت سلالة المختبر السريري ، H99S ، هدية لطيفة من الدكتور جون بيرفكت (جامعة ديوك). السلالات السريرية ، B18 و B52 ، كانت هدايا لطيفة من الدكتور جريج بيسون (جامعة بنسيلانيا). 
مرق سكر العنب بالخميرة (YPD)فيشر ساينتفيكDF0428-17-5
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)يتم تصنيعه في المختبر باستخدام الوصفة القياسية (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الكولينيوم ، 10 ملي Na2HPO4O ، 2 ملي مولار Kh2PO4O) DMEM
/ عالي الجلوكوز مع L-الجلوتامين ، بدون بيروفات الصوديومGE LifeSciences SH30022.01
6 آبار الصقرCL5335-5EA
حاضنة الاهتزازThermo Scientific MaxQ6000
CO2 حاضنةفيشر العلميةIsotemp
الطرد المركزيالحرارية ScientificLegend XTR
قوي > تلطيخ < / قوي >
طرددقيق الأسطورة العلميةالدقيقة Micro 21R
الهند الحبرفيشر العلمي14-910-56
كالكوفلور أبيضسيجما-ألدريتش18909-100ML-F
18B7 ماوس الأجسام المضادة المضادة ل GXM مقترنة ب Alexafluor 488هدية لطيفة من الدكتور أرتورو كاساديفال (جامعة جونز هوبكنز)  
PBS مع 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA)PBS هي نفس الوصفة المذكورة أعلاه (السطر 4) مع إضافة 1٪ BSA وتعقيمها بالترشيح.
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA9418
مجهر Superfrostفيشر Scientific12-550-143
أغطية زجاجيةCorning2855-18# 1.5 سمك
طلاء أظافر شفاف أو غيره من المواد
غير السامة < قوية > الحصول على الصورة   ؛ < / قوي>
زيت الغمرCargille 16484
مجهر ضوئي مع هدف زيتالغمر Zeiss ZeissAxio A1 مع خطة - NEOFLUAR 100x غمر الزيت NA 1.30 الهدف
كاميرا المجهر الخفيفZeiss ZeissAxiocam ErCD
مجهر متحد البؤر مع هدف الغمر بالزيتZeissLSM 700 المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر مجهز بخطة Apochromat 63X NA 1.4 غمر الزيت DIC M27 الهدف. نب سب.
برنامج المجهر متحد البؤرزين 2009
كاميرا مجهر متحد البؤرنيكوننيكون Ti-Eclipse مع إضاءة Intensilight epifluorescence (نيكون), كاميرا مجهر CoolSNAP MYO (القياسات الضوئية), خطة Apo 60x NA 1.40 هدف الغمر في الزيت (نيكون) ومغير التكبير 1.5x. 
برنامج التصوير واسعنيكون عناصر (نيكون)
<قوي>قياس الكبسولة
برنامج تحرير الصورفوتوشوب (أدوبي)
برنامج مجهر للقياس اليدويAxiovision (Carl Zeiss)
برنامج تحليل الصور للقياس الآليAivia (DRVision التقنيات)
برنامج جداول البياناتExcel (Microsoft)
محلول < جهاز مركزي شرائح المانعة للتسرب كاميرا المجال

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640(2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261(2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

Related Articles