كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Summary

يصف لنا بروتوكول للكشف عن المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء استخدام ربط لمستقبلات الفرز، سورتيلين، إلى حلقة لومينال الأولى من البروتين الناقل الجلوكوز، GLUT4، على سبيل مثال.

Abstract

أن قدرتنا على استكشاف تفاعلات البروتين البروتين هو المفتاح لفهم الاتصالات التنظيمية في الخلية. ومع ذلك، الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في كثير من الحالات يرتبط مع تحديات تجريبية كبيرة. على وجه الخصوص، الفرز مستقبلات تتفاعل مع حمولتها البروتين في التجويف المقصورات الغشاء غالباً بطريقة حساسة للمنظفات، مما يجعل co-إيمونوبريسيبيتيشن من هذه البروتينات غير قابلة للاستخدام. ملزمة من سورتيلين مستقبلات الفرز لنقل الجلوكوز GLUT4 قد تخدم كمثال على ضعف تفاعلات البروتينات الغشاء لومينال. وهنا يصف لنا مقايسة سريعة وبسيطة وغير مكلفة للتحقق من صحة التفاعل بين سورتيلين و GLUT4. لذلك، قمنا بتصميم وتصنيعه كيميائيا الببتيد معلم حركة المقابلة حانمه ملزمة سورتيلين المحتملة في الجزء لومينال من GLUT4. سورتيلين المفتاحية هيستيدينيس ست المعرب عنها في خلايا الثدييات، ومعزولة عن ليساتيس الخلية باستخدام قشور حبات. سورتيلين المعطل تداولها على الخرز كان المحتضنة مع الحل الببتيد في قيم الأس الهيدروجيني مختلفة، وكان تحليل المواد الوتيد بواسطة النشاف الغربية. هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لدراسة تفاعلات أخرى حساسة للمنظفات البروتين-بروتين.

Introduction

هو GLUT4 بروتين الناقل جلوكوز التي يعبر عنها غالباً في خلايا العضلات والدهون والهيكل العظمى حيث أنه يتوسط تأثير الأنسولين على إزالة جلوكوز الدم بعد prandial¹. يجري بروتين مستقرة جداً، وينظم GLUT4 عند مستوى بوستترانسلاشونال. نظراً لغياب الأنسولين، GLUT4 مستبعد إلى حد كبير من غشاء البلازما (ومن ثم انخفاض نفاذية القاعدية الجلوكوز) وهو مترجم أساسا داخل الخلية في حويصلات تستجيب للأنسولين الصغيرة (إيرفس) وشبكة ترانس-غولجي (TGN) التي من المحتمل أن تمثل حجرة المانحة ايرف. لدى الإدارة الأنسولين، إيرفس الصمامات مع غشاء البلازما وتسليم GLUT4 إلى موقع عمله. وهذا يزيد من نفاذية غشاء البلازما للسكر، حيث أن امتصاص الجلوكوز من الدم في adipocytes والهيكل العظمى myocytes يرتفع 10 إلى ضعفا. بعد سحب الأنسولين، مستوعبة في اندوسوميس المبكر/الفرز GLUT4 واستعادتها ثم إلى TGN حيث إيرفس إعادة تشكيل. فرز كل الخطوات في المسار GLUT4 واسترجاع أي من اندوسوميس المبكر الطرفية إلى بيرينوكلير TGN وتشكيل إيرفس على الجهة المانحة TGN الأغشية هي تمكين أفراد الأسرة Vps10p، سورتيلين، الذي يمثل نوع أنا بروتين ترانسميمبراني ومستقبل فرز. ووفقا لنموذج واحد، يعمل سورتيلين بروتين سقالة transmembrane: يربط GLUT4 في التجويف اندوسوميس و TGN، والمجندين محولات ريترومير أو كلاثرين إلى جانب هيولى المانحين الغشاء عن طريق المحطة ج^{2، 3}-وهذا يسهل توزيع GLUT4 إلى الناقلين حويصلية ترانسلوكاتي GLUT4 بين الأقسام داخل الخلايا.

التفاعل بين هيولى ذيل سورتيلين مع ريترومير ومختلف البروتينات محول توثيقاً جيدا. ومع ذلك، قد تم تحدي ربط سورتيلين إلى GLUT4 (والعديد من أن يغاندس البروتين الأخرى) لإثبات. على وجه الخصوص، محاولات لشركة إيمونوبريسيبيتاتي سورتيلين و GLUT4 لم تنجح ربما بسبب طبيعة التفاعل بين هذه البروتينات هما المراعية للمنظفات. وبالإضافة إلى ذلك، بروتين الناقل نموذجي، قد GLUT4 مجالات transmembrane 12 و 6 حلقات لومينال أية تركيبة من التي يحتمل أن تكون قد تمثل موقع سورتيلين-ملزمة. في الوقت نفسه، تقترح مجموعة كبيرة من الأدلة غير المباشرة، مثل كبير التعريب المشارك في الخلية، العابرة للربط مع نفاذية الغشاء حزب اليسار الديمقراطي، والتفاعل في نظام هجين اثنين الخميرة يمكن ربط هذا سورتيلين إلى GLUT4. وعلاوة على ذلك، باستخدام هذا النهج الأخير في تركيبة مع ألانين مسح الطفرات، سابقا قررنا أن المجال Vps10p من سورتيلين بربط أساسا الحلقة الأولى لومينال من GLUT4. بيد أن الدليل على مثل هذا التفاعل في خلايا الثدييات كان مفقوداً. هنا، نحن قد عزلت سورتيلين صاحب معلم من الخلايا transfected 3T3-L1 استخدام الراتنج الكوبالت، وأثبتت أنها يمكن أن تتفاعل مع الببتيد مركباً كيميائيا المقابلة للحلقة الأولى لومينال من GLUT4 على درجة الحموضة 6 ودرجة الحموضة 8 التي تشبه الوسط الحمضي في اندوسومال التجويف وبيئة محايدة في التجويف الأغشية TGN. تم الكشف عن لا ربط الببتيد في تجارب التحكم حيث تم تحميل استخراج إعداد من الخلايا غير ترانسفيكتيد على نفس الخرز.

Protocol

1-تناول الببتيد

1. تصميم وترتيب الببتيد
   1. اختر التسلسل المطلوب من الببتيد، وإضافة علامة، مثل حركة حانمه (اقكليسيد) في أما ن-أو ج-نهايته.
   2. التحقق من قابلية الذوبان المتوقع من الببتيد في الماء، واستخدام http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php آلة حاسبة الذوبان الببتيد. إذا كان منخفضا الذوبان، في محاولة لإضافة علامة أخرى للذوبان في الماء تغيير التوازن المسؤول.
      ملاحظة: كنا الببتيد المقابلة للحلقة الأولى لومينال (fll) من GLUT4 المفتاحية حانمه حركة (خط غامق) في المحطة N (حركة-fll-GLUT4): لنابقكفيقسيناتولجرقجبجبسيبجتلتلوا اقكليسيديحتوي على الذوبان المتوقع "جيدة" في المياه .
   3. الببتيد مخصصة مع 75 في المائة على الأقل من أجل النقاء وهي كافية للمقايسة، ونسأل الموفر لاختبار قابلية الذوبان. فصل النظام إلى مختبرين اثنين على الأقل في حالة حدوث مشاكل غير متوقعة مع تذويب الببتيد.
      ملاحظة: قد أمرت حركة-fll-GLUT4 في مختبرين اثنين. ذوبانه المبلغ عنها في الماء عالي النقاوة دي وان زيرو ملغ/مل.
2. حل الببتيد
   ملاحظة: الماء عالي النقاوة هو المذيب أفضل. إذا لم يظهر الببتيد لتكون للذوبان في الماء، الرجوع إلى http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html للحصول على إرشادات.
   1. إعداد 100 × حل عملي من الببتيد في الماء عالي النقاوة أو في المخزن المؤقت للاختيار، مع تركيز 100 ميكروغرام/مل.
   2. فصل الحل إلى 50-100 ميليلتر مختبرين، وتخزينها في-20 درجة مئوية.

2-التعامل مع الخلايا

1. خلية ثقافة
   1. استخدام خلايا نوع البرية (WT) كعنصر سلبي، وخلايا معربا عن البروتين المستهدف معلم مع ستة هيستيدينيس (حسب).
      ملاحظة: كنا 3T3 L1 قبل adipocytes ستابلي transfected مع سورتيلين-حركة/صاحب⁵.
   2. تنمو الخلايا في تعديل النسر المتوسطة (دميم) ارتفاع السكر دولبيكو، وتستكمل مع 10% مصل العجل البقري، الجلوتامين (2 مم) والبنسلين/ستربتوميسين (5 ميكروغرام/مل) في 37 درجة مئوية في 10% CO₂.
   3. الجلوس أربعة أطباق 10 سم الخلايا وترانسفيكت اثنان منهم بحسب ترانسفيكت الأخريين مع مراقبة بلازميد (وزن). 48 ساعة بعد تعداء، ينبغي التوصل إلى خلايا كونفلوينسي 80-90%.
2. إعداد ليساتيس خلية
   1. إعداد تحلل المخزن المؤقت (10 ملم حبيس، 30 ملم كلوريد الصوديوم، الجلسرين 5%، 10 مم ايميدازول، 0.5% Triton X-100 ومبطلات المانع كوكتيل دون يدتا لعزل البروتينات له معلم، ودرجة الحموضة 7.4) وإبقائه في 4 ° c:
   2. يغسل خلايا ثلاث مرات مع 10 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية.
   3. وضعت الأطباق على الجليد وإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل لكل طبق. حصاد ليساتيس الخلية باستخدام مكشطة خلية.
   4. وضع الخلية ليستي من كل طبق في أنبوب مختلفة 1.5 مل. قم بتسمية أنابيب WT-pH6، WT pH8، حسب pH6، حسب pH8.
   5. تمرير ليساتيس الخلية عن طريق حقنه بإبرة ز 26 خمس مرات صعودا وهبوطاً، تحلل كاملة.
   6. الطرد المركزي ليساتيس الخلية في ز س 16,000 لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
   7. نقل سوبيرناتانتس إلى أنابيب نفس المسمى الجديد.
   8. تحليل تركيز البروتين باستخدام "أدوات مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي" أو مجموعة أخرى.
   9. استخدام المخزن المؤقت لتحلل، مساواة تركيز البروتين من جميع ليساتيس الأربعة.
   10. فصل قاسمة صغيرة (ca. 20 ميليلتر) لكل وإبقائه في-20 درجة مئوية لتجارب التحكم المحتملة و/أو مشكلة إطلاق النار.

3-ربط البروتينات صاحب معلم الخرز الكوبالت هيسبور

1. استخدام المخزن المؤقت ليغسل متوفرة تجارياً أو إعداد واحد (50 مم نا₂هبو₄/NaH₂ص₄، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 20 مم، درجة الحموضة 8) وإبقائه في 4 درجات مئوية.
2. تعد المياه والصرف الصحي المخزن المؤقت مع الرقم الهيدروجيني 6 بدرجة الحموضة العازلة أغسل تيتيرينج 8 مع HCl. تبقى أنه في 4 درجات مئوية.
3. بلطف دوامة زجاجة الخرز الكوبالت جعل التعليق متجانسة.
4. الاستغناء عن 40 ميليلتر من تعليق الخرز الكوبالت إلى أربعة أنابيب 1.5 مل وضع علامة على النحو المبين أعلاه (الخطوة 2.2.4).
5. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل لكل أنبوبة، والطرد المركزي هذه الأنابيب في 1000 x ز للمادة طافية 5 س. أسبيراتي، وإضافة 40 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل الخرز تمت تسويتها.
6. إضافة ليساتيس الخلية إلى أنابيب المقابلة.
7. احتضان هذه الأنابيب لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية في المدورة أنبوبة 20 لفة في الدقيقة.
8. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 1000 × ز 5 s وجمع المادة طافية. تبقى المادة طافية في 4 درجات مئوية.
9. إضافة 500 ميليلتر لدرجة الحموضة 8 أو الرقم الهيدروجيني 6 يغسل المخزن المؤقت إلى أنابيب المقابلة وإعادة تعليق الخرز بلطف.
10. الطرد المركزي هذه الأنابيب في ز 1000 x 5 s وتجاهل سوبيرناتانتس.
11. كرر الخطوات من 3، 9 و 3، 10 لأربع مرات.

4-الربط بين الببتيد للبروتين صاحب معلم معطلة في الخرز

1. باستخدام حل العامل x 100 الببتيد (الخطوة 1.2.1)، إعداد 1 × حلول العامل في الأس الهيدروجيني 6 أو درجة الحموضة 8 أغسل المخزن المؤقت (مختبرين اثنين 100 ميليلتر لكل، 1 ميكروغرام/مل).
2. إضافة 100 ميكروليتر 1 x الببتيد حل الخرز غسلها مع درجة الحموضة المقابلة.
3. احتضان الخرز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في المدورة أنبوبة 20 لفة في الدقيقة.
4. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 1,000 ز خ لل 5 s، جمع المادة طافية وإبقائه في-20 درجة مئوية.
5. كرر الخطوات من 3، 9 و 3، 10 لأربع مرات.
   ملاحظة: بغية تقليل الخلفية ممكن، يمكن استبدال الخطوات التالية خطوات 4.4 و 4.5.
6. تأخذ أربعة أعمدة صغيرة مع 30 ميكرو المسام وتسميتها كما هو الحال في الخطوة 2.2.4 ووضع الأعمدة في أنابيب جمع.
7. بعد انتهاء خطوة 4-3، نقل الخليط حضانة في الأعمدة، السماح لحل يمر بالجاذبية. الحفاظ على تدفق من خلال عند-20 درجة مئوية.
8. تمرير 500 ميليلتر يغسل المخزن المؤقت مع الرقم الهيدروجيني 6 أو درجة الحموضة 8 من خلال الأعمدة المطابقة بالجاذبية. تجاهل في التدفق من خلال.
9. كرر الخطوة 4، 8 أربع مرات.
10. بعد الغسيل الأخير، الطرد المركزي الأعمدة في 1,000 ز س لمدة 15 ثانية.

5-شطف من قشور حبات

1. الاستخدام التجاري تريسيني عينة من المخزن المؤقت (200 ملم تريس-HCl، والغليسيرول 40%، 2% الحزب الديمقراطي الصربي، 0.04% أخذ الأزرق، الأس الهيدروجيني 6.8) وإضافة β-ميركابتوثانول بتركيز نهائي 2%.
2. إضافة 40 ميليلتر من المخزن المؤقت لنموذج تريسيني (مع β-ميركابتوثانول) بغسلها الخرز ودوامه العينة.
3. الحرارة العينات لمدة 10 دقائق عند 100 درجة مئوية، دوامة العينات مرة أخرى، والطرد المركزي هذه الأنابيب في 1,000 ز خ لل 5 s.
   ملاحظة: سعيا لتخفيض ممكن ملزمة غير محدد في شطف، يمكن استبدال الخطوات التالية خطوات 5.1 5.3.
4. إضافة 40 ميكروليتر من "شطف ايميدازول المخزن المؤقت" (مم 50 غ₂هبو₄/NaH₂ص₄، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 0.25 م) إلى يغسل الخرز، الدوامة، واحتضان هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
5. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 3,000 س ز لمدة 30 ثانية، جمع المادة طافية (عينات التيد) وتحويلها إلى أنابيب المسمى الجديد.
6. إضافة 40 ميكروليتر من المخزن المؤقت لنموذج تريسيني لكل أنبوبة، وتسخين العينات لمدة 10 دقائق في 100 درجة مئوية، ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في 1,000 ز خ لل 5 s.
   ملاحظة: إذا استخدمت الأعمدة الدقيقة، إضافة المخزن المؤقت شطف الخرز غسلها، احتضان لمدة 20 دقيقة وجمع شطف بالطرد المركزي في 8,000 س ز 2 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن الاحتفاظ عينات في-20 درجة مئوية حتى يتم إجراء التفريد.

6-التفريد والنشاف الغربية

ملاحظة: النماذج جاهزة للفصل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية اللاحقة. اتبع البروتوكول من هلام استشراد (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) مع إدخال التعديلات التالية.

1. استخدام المتاح تجارياً 10-20% تريسيني الهلامية المتدرجة.
2. على الجل، تحميل 20 ميليلتر من عينات التيد و 20 ميليلتر من ليساتيس (الخطوة 2.2.10). لمشكلة إطلاق النار، من المستحسن تحميل 20 ميليلتر من المواد غير منضم (الخطوة 3.8) و 10 نانوغرام الببتيد؛ قبل التحميل، إضافة مبلغ مساو من المخزن المؤقت لنموذج تريسيني لهذه العينات.
3. الاضطلاع بالتفريد في التجاري تريس/تريسيني/الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت (100 ملم تريس، 100 مم تريسيني، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، pH 8.3).
4. نقل المواد من الجل على غشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر استخدام نقل المخزن المؤقت (قاعدة تريس 25 مم، 192 مم جليكاين، pH 8.4) تستكمل مع 20 ٪ الميثانول.
5. كتلة الغشاء مع 3% ألبومين المصل البقري (BSA) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. استخدام علامات الوزن الجزيئي ملطخة مسبقاً كأدلة، قص الغشاء أفقياً ولطخة في الجزء العلوي مع جسم مضاد ضد حسب ولطخة الجزء السفلي مع جسم مضاد ضد حانمه حركة تحديد الببتيد معلم حركة.
   ملاحظة: في حالتنا الخاصة، قطع الغشاء غير مطلوب حيث يمكن الكشف عنها بحسب وحركة-fll-GLUT4 مع جسم حركة مناهضة.

7-تحليل النتائج

1. قياس كثافة جميع إشارات لطخة غربية باستخدام برنامج محطة الصورة أو إيماجيج.
2. تطبيع الإشارة من الببتيد معلم حركة ضد الإشارة من حسب في قيم الأس الهيدروجيني على حد سواء.

Results

أعدت ليساتيس من 3T3 الخلايا L1 ستابلي transfected مع سورتيلين-حركة/صاحب⁵ ومن وزن 3T3 L1 الخلايا، واستخدامها كعنصر سلبي. كلا ليساتيس المحتضنة مع قشور حبات على درجة الحموضة 6 أو 8 درجة الحموضة وغسلها جيدا. ثم كانت المحتضنة الخرز مع البروتينات المعطل تداولها في حل حركة-fll-Glut4. بعد يغسل حذراً، كانت الوتيد البروتينات التي ترتبط الخرز مع 0.25 م ايميدازول. تعرض عينات، جنبا إلى جنب مع ليساتيس الأصلي، للحزب الديمقراطي الصربي صفحة في تريسيني 10-20% تليها هلام التدرج النشا...

Discussion

سورتيلين هو مستقبلات بروتين يجند متعدد مصانة تطورية التي تشارك في كل إشارة في غشاء البلازما وفي داخل الخلية فرز الأحداث^6،7. ومع ذلك، البحث عن يغاندس في سورتيلين أصيلة (بعضها من البروتينات الغشاء لومينال أو لا يتجزأ) معقد كما يظهر تفاعل سورتيلين مع بعض شركائها الملزم لتكون حساسة للمنظفات. ولذلك، وسيلة سهلة واتباع نهج واسع النطاق لدراسة تفاعلات البروتين البروتين، co-إيمونوبريسيبيتيشن، لا يمكن أن تطبق على سهولة. واستخدمت بعض المجموعات البحثية co-إيمونوبريسيبيتيشن لإ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
كوكتيل مثبط البروتياز	Sigma	P8849	للاستخدام في تنقية بروتين علامة الهيستيدين
محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛	Corning	21-040-CV	PBS
1 مل حقنة الأنسولين U-100	BD	329652	26 جم × 1/2
BCA مجموعة فحص البروتين	بيرس	23228
عازلة غسيل	بوسطن بيو بروكوتسز	BP-234	لتنقية البروتين
HisPur Cobalt Resin	Thermo Scientific	89964
Tricine عينة Buffer	Bio-Rad	161-0739	مع SDS ، يجب إضافة bMercaptaethanol
Elution  ؛ Buffer	Boston BioProducts	BP-236	لتنقية البروتين الخاص به مع 250 ملي مولار Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine جل مسبقة الصب 10-20٪   ؛	Bio-Rad	456-3115	لفصل الببتيد والبروتين الصغير
Tris / Tricine / SDS تشغيل العازلة   ؛	Bio-Rad	161-0744
نقل العازلة	Boston BioProducts	BP-190	إضافة 20٪ غشاء الميثانول
النيتروسليلوز  0.45 مم	Bio-Rad	1620115
مصل الأبقار الألبومين	Sigma	A9647	BSA
الأجسام المضادة	الخلايا	2272	Rabbit
Peptide	Genscipt		تخصيص طلب
Precision Plus Protein Dual Color Standarts	BioRad	161-0374