مقالة منهجية

اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

10.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57191

⸱

فبراير 6, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

قمنا بإنشاء بروتوكول جراحية رواية لتصوير اثنين-فوتون من كبد الفئران حية مع الحد الأدنى من الغزو. مع هذا الأسلوب، حددنا الهيكل التفصيلي للكبد خلال اندوتوكسيميا الناجمة عن lipopolysaccharide. ونحن نتوقع أن يمكن استخدام هذا الأسلوب تحديد مدى فعالية العلاج الكواشف المختلفة لهجرة الكريات البيض الكبد.

الملخص

تعفن الدم هو نوع من العدوى الحادة التي يمكن أن تتسبب في فشل الأعضاء والأنسجة، والضرر. على الرغم من أن معدلات الوفيات والإصابة بالأمراض المرتبطة الانتان هي العلاج مرتفعة للغاية، لا مباشرة أو الآلية المتصلة بالجهاز وقد درست بالتفصيل في الوقت الحقيقي. الكبد هو الجهاز الرئيسي الذي يتحكم بالسموم والالتهابات في جسم الإنسان. هنا، نحن بهدف القيام بتصوير إينترافيتال للكبد الماوس بعد تحريض اندوتوكسيميا من أجل تتبع الحركية الخلايا المناعية، مثل العَدلات والكبد الضامة الحافظة (LCMs). وبناء على ذلك، قمنا بتصميم طريقة جراحية رواية للتعرض للكبد مع الحد الأدنى من جراحة. تم حقن الفئران إينترابيريتونيلي lipopolysaccharide (LPS)، الذيفان مشتركة. استخدام النهج الجراحية رواية للتعرض والتصوير إينترافيتال لتعيين الماوس الكبد، وجدنا أن العَدلات في المعالجة بلبس ليسم-أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) والماوس الكبد زيد مقارنة مع ذلك في مخزنة الفوسفات الكبد المعالجة بالمياه المالحة. بعد العلاج لبس، زيادة عدد العَدلات كبيرة مع مرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام الفئران CX3Cr1-التجارة والنقل، ونحن بنجاح تصور الضامة المقيم الكبد تسمى لكمس. ولذلك، للتحقيق في كفاءة الكواشف الجديدة للتحكم في التنقل محصنة في فيفو، تحديد حركية ومورفولوجيا العَدلات ولكمس في الكبد قد تسمح لنا بتحديد التأثير العلاجي في الجهاز فشل والأنسجة، والأضرار التي تسببها تنشيط الكريات البيضاء في الانتان.

المقدمة

الكبد هو الجهاز الأيضية الرئيسية في الثدييات؛ أنها بمثابة برج مراقبة ل الطاقة والهرمونات والسموم1. نظراً لأهميته، وقد أجرى الباحثون العديد من التجارب في المختبر و في فيفو توضيح التغيرات في الكبد أثناء التهاب. وقد استخدمت الفحص المجهري إينترافيتال لالتقاط صور حية من الكبد2 . وفي الواقع، قدم الكبد مختلف أساليب التصوير منذ2،،من34،،من56. ومع ذلك، بغية وضع نهج مبسطة أكثر العمليات جراحية وتحقيق الاستقرار للجهاز المستهدف والخلايا المناعية، قمنا بتصميم بروتوكول بسيطة التي يمكن أن توجه الباحثين التقليل من جهودهم لتصوير إينترافيتال.

في هذه الدراسة، ونحن أدخلت غرفة التصوير مستقرة والرواية وتقنية جراحية يمكن استخدامها للتقليل من الإصابات نزيف وممكن. وأكد نحن أن الكبد لا تزال سليمة لأكثر من 2 ح. مع هذا الأسلوب، وحددنا بنجاح مورفولوجيس لكمس7 والعدلات تحت ظروف الصرف الصحي. حيث يقلل هذا الأسلوب عوامل الخلط الفيزيائي والبيولوجي مثل التهاب يرتجف وغير متوقعة أثناء إجراء العمليات الجراحية، ونتوقع أنه يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة ردود فعل حادة من الخلايا المناعية في الكبد ردا على مثل الكواشف لبس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة يونسي جامعة كلية الطب، كوريا. بروتين فلوري أخضر ليسم (التجارة والنقل؛ التجارة والنقل/+) الفئران8 و CX3Cr1-التجارة والنقل (التجارة والنقل/+)9 الفئران في الأسابيع 8-12 من العمر كانت تستخدم للتصوير إينترافيتال. وكانت جميع الأدوات الجراحية يعقم وتطهيرها بالكحول 70%.

1-مصممة خصيصا الماوس الكبد التصوير الدائرة مع الأدوات الداعمة

  1. الكبد الماوس التصوير تصميم الدائرة
    1. جعل غرفة لحجم التالية للكبد الماوس التصوير (الشكل 1): الدائرة الداخلية (120 مم × العرض 160 مم × 30 مم الطول)، الدائرة الخارجية (100 مم × 100 مم عرض × 24 مم الطول)، مسامير (Ф 3 مم × 30 مم ارتفاع)، والمكسرات (Ф 4 ملم) ، والمكسرات على شكل الجناح (Ф 4 مم).
    2. قياس عامل التجفيف والاستومر الأساسي بنسبة 1:9 جعل إجمالي 120 جرام من السيليكون.
    3. وضع خليط السيليكون السائل 250 مل قارورة Erlenmeyer ومزجها جيدا. ثم وضع في قارورة في مجفف وإزالة فقاعات الهواء لحوالي 1 ح تحت الفراغ من خلال المضخة.
    4. صب المزيج السائل سيليكون في دائرة خصيصا ماوس تصل إلى ارتفاع 10 ملم والسماح لها علاج لبضعة أيام (الشكل 1A).
  2. إعداد شرائح الغطاء والكبد تحديد السرير
    1. في الإطار المعدني، وأرفق تغطية الزجاج باستخدام غراء السيليكون. اتركها تجف لمدة يوم واحد (الشكل 1B).
    2. من أجل فعالية عقد الماء المقطر لعدسة غمر المياه، بنية حجب المياه سيميبيرمانينت ضروري. 1 ملم التقريب غراء السيليكون وتتصلب بين عشية وضحاها.
    3. مزيج علاج عامل وقاعدة الاستومر وثم صب ذلك في لوحة 6-جيدا في ارتفاع من حوالي 8-10 مم-إجراء عملية تصلب كما هو موضح في 1.1.2-1.1.4.

2-إعداد لبس

  1. إعداد العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) تمييع مسحوق لبس من انتيريكا السالمونيلا الملهبة النمط المصلي المسيطر. (1 × برنامج تلفزيوني: 137 مم كلوريد الصوديوم، بوكل 2.7 مم، 10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4).
  2. قبل الحرارة برنامج تلفزيوني في حوض ماء في 37 درجة مئوية، وفتح زجاجة مسحوق لبس (25 ملغ) بعناية.
  3. باستخدام وسيلة مساعدة بيبيت، صب PBS العقيمة (5 مل) في زجاجة مسحوق لبس ويقلب بلطف أو تعليق الحل بإعداد الحل الأسهم.
    ملاحظة: بعد هو مسيل مسحوق لبس، فورتيكسينج قاسية يمكن أن يسبب فقاعات. تجنب الوقوع في فقاعات لتقليل الخسائر عند صنع مختبرين في أنابيب 1.5 مل.
  4. تخزين حل لبس الأسهم في −20 درجة مئوية، وتمييع في حل لبس 1 ملغ/مل للحقن.
  5. حقن الحل لبس 1 ملغ/مل (20 مغ/كغ) في الصفاق بالماوس تخديره من عدم استخدام المحاقن 1 مل. للحيوان، والتحكم بحقن نفس الحجم من برنامج تلفزيوني.
  6. انتظر ح 2 لاستجابة كافية من الالتهابات.

3-إعداد "ديكستران" تكساس الأحمر وصمة عار الأوعية الدموية

  1. إعداد اثنين أنابيب مخروطية الشكل 15 مل و 10 مل من PBS العقيمة.
  2. تمييع مسحوق "ديكستران" تكساس الأحمر (25 ملغ) في 3 مل من برنامج تلفزيوني ومزجها جيدا. نقل الخليط إلى أنبوب مخروطي 15 مل فارغة.
  3. نقل برنامج تلفزيوني المتبقية (7 مل) إلى الأنبوبة المخروطية 15 مل يحتوي على خليط ديكستران (3 مل).
  4. قم بتوصيل عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرومتر غيض من حقنه 10 مل. ينبغي أن يحل محل عامل التصفية حقنه الإبرة.
  5. قم بتصفية الخليط ديكستران (10 مل). اضغط المحاقن بالتساوي لتجنب تسرب.
  6. الاستغناء عن 500 ميليلتر من 2.5 ملغ/مل ديكستران الحل في أنبوب 1.5 مل حظر الضوء وتخزينها في −20 درجة مئوية. بمجرد إذابة، احفظها في 4 درجات مئوية.

4-العمليات الجراحية العملية

  1. تطهير الجدول جراحة وجميع الصكوك باستخدام الكحول 70% قبل الجراحة. ثم، مجموعة أدوات لجراحة الكبد وضبط لوحة التدفئة إلى 37 درجة مئوية (الشكل 2 أ، ب).
  2. للتخدير، إينترابيريتونيلي حقن الفئران مع 30 ملغ/كغ من تيليتاميني/زولازيبام و 10 مغ/كغ من إكسيلازيني. هذه الحلول يمكن مختلطة وتضعف في برنامج تلفزيوني لحقن المتزامنة. تأكيد أنيسثيتيزيشن بالضغط بلطف على إصبع القدم الماوس.  تابع الخطوة التالية عندما يكون هناك لا رد فعل.
  3. تطبيق كمية صغيرة من مرهم العين لمنع جفاف الشبكية للماوس.
  4. إزالة شعر الجسم حول منطقة البطن باستخدام كريم لإزالة الشعر (الشكل 2).
  5. ضخ 200 ميليلتر لحل "ديكستران" تكساس الأحمر (تركيز 2.5 ملغ/مل) عن طريق الوريد الذيل أو حقن الرجعية-المداري حقنه الأنسولين (الشكل 2D) باستخدام.
  6. علامة منطقة سوبكوستال الحق مع علامة. وينبغي استخلاص الخط من عملية الرهابه إلى نهاية الأضلاع. قطع البشرة مع ملقط ومقص (الشكل 2 هاء، واو).
  7. فتح تجويف البطن باستخدام مايكرو-مقص وملقط، وفضح الكبد بعناية. وينبغي أن توالت الفص الجانبي الأيسر استخدام مسحات القطن (الشكل 2، ح).
  8. من أجل 500 ميليلتر من PBS العقيمة في تجويف البطن لمنع جفاف في الكبد.
  9. ضع الماوس في وضع استلقاء الحق في غرفة مصممة خصيصا، وتنطبق على كمية صغيرة من الغراء الأنسجة على السرير السليكون. ثم قم بإرفاق بعناية في الكبد باستخدام مسحات القطن (الشكل 2 طاء).
    ملاحظة: نظراً لأن نسيج الكبد غاية قابلة للتفتيت، لا ميكانيكيا سحب الكبد. لفة بلطف أنه مع مسحات القطن.
  10. بضع ثوان في وقت لاحق، الرطب في الكبد مرة أخرى مع 500 ميليلتر من PBS العقيمة لتجنب التجفيف خارج الكبد. ضع إطار معدني في الكبد وإصلاحه بشدة مع المكسرات (2J الشكل).

5-تصوير إينترافيتال في الكبد مع اثنين-فوتون مجهرية

  1. قم بتشغيل برنامج زين (كارل زايس) تشغيل الليزر، وتعيين الطول الموجي إلى 880 نانومتر، ومجموعة الأخضر، وقنوات الأحمر. ضبط السلطة الليزر وفقا لكثافة الفلورية (الشكل 3A). الانبعاثات تصفية المعلومات على النحو التالي: الأخضر/Alexa488، وشمال البحر الأبيض المتوسط 500-550، والأحمر/أليكسا 555، 575-610 نيوتن متر.
  2. ضع الدائرة على مرحلة التصوير ومكان 20 X عدسة الهدف غمر المياه القريبة من الزجاج غطاء.
  3. إصلاح سخان المطاط سيليكون تحت الجسم الماوس للاحتفاظ درجة حرارة الجسم (الشكل 3B).
  4. قطره 500 ميليلتر من الماء المقطر في الإطار المعدني، ومن ثم سحب العدسة الهدف قريبة من الكبد (الشكل 3).
  5. ضبط التركيز وتحديد العمق والوقت في مجال التصوير.
  6. القيام بالتصوير.
  7. لتصوير طويلة الأجل، حقن نصف جرعة من خليط تيليتاميني/زولازيبام وإكسيلازيني كل ساعة أثناء التصوير. من الضروري الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الفئران في 37 درجة مئوية خلال هذه المرحلة. تبقى دائماً على العين للماوس، منذ وقت أنيسثيتيزيشن يختلف عن كل الماوس.
    ملاحظة: هذا الأسلوب غير مناسب للإنعاش بعد الجراحة، والتصوير. نحن أخلاقيا التضحية الماوس مباشرة بعد عملية جراحية.
  8. فحص دواسة ردود الفعل لكل 30 دقيقة أنيسثيتيزيشن مستقرة.

6-بيانات التحليل

  1. فتح برنامج تحليل البيانات فولوسيتي ثم قم باستيراد البيانات الخام في المكتبة في البرنامج.
  2. إزالة الضجيج من الصورة لتناسب الحالة وأخذ لقطة.
    ملاحظة: للحصول على الصور سلس، استخدم عامل التصفية 'جيد' أو 'الوسيط'. وعلاوة على ذلك، استخدام ميزة 'تعزيز النقيض' لجعل الصور المظلمة أو ضبابية أكثر وضوحاً.
  3. تناسب العناصر المحررة إلى 100% والتصدير كملفات JPEG أو TIFF للقطة صور وملفات AVI للأفلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد وضعت دائرة تصوير بسيط ومستقر جداً. تمت تغطية الجزء السفلي من الدائرة مع السيليكون، مما حال دون الانزلاق للجسم الماوس والأجهزة. بالإضافة إلى ذلك، بسبب السيليكون كمية مناسبة من مرونة، فإنه يمكن منع الأضرار المتوقعة الناجمة عن الضغط لغطاء الشريحة (الشكل 1 أ، ج). تم تطبيق الغراء ثانيا، آمنة للأنسجة (التعليم والتدريب المهني بوند) من أجل إصلاح الكبد المستخرج على السرير سيليكون على شكل دائرة. هذا الأسلوب مكنتنا من تجنب يرتجف بسبب ضربات القلب أو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ودرست بنشاط الكبد بالعديد من المجموعات3،10، نظراً لأهمية وظيفتها. على سبيل المثال، اقترح هيمان وآخرون طريقة حساسة باستخدام [اغروس]. على الرغم من أن هذا الأسلوب عثر على وجه الدقة العالية، الإعداد [اغروس] يستغرق وقتاً طويلاً. بيد مع منهجيتنا، جميع الإجراءات يمكن أن تنفذ خلال 30 دقيقة، التقليل من العوامل الأخرى المؤثرة الأخرى. وثانيا، استقرار الكبد أمر بالغ الأهمية لأن نبضات القلب يمكن أن تخل بالفيديو. للقضاء على هذه الظاهرة، علينا إعادة تحديد موضعها الفئران في المو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

كان يؤيد هذه الدراسة بمنحه مقدمة من الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله حكومة كوريا (مسيب؛ ومنحة رقم 2016R1A2B4008199 Y-م. حاء)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (منح رقم: HI14C1324).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غرفة مصممة خصيصاالخليةالحية حجم مصمم خصيصا
شريحة غطاء معدنيالخليةالحية حجم مصمم خصيصا
غطاء زجاجيعلوم المجهرالإلكتروني # 72204-03
سيلجارد 184 طقم مطاط أسطوانة سيليكونداو كورنينج
إرلينماير قارورةDURAN21 216 36
لوحة زراعة الخلية (النوع المسطح) شركةهيونداي مايكروH31006
مجففADARSH55204
High Q BOND SE 5 مل لترمختبرلصنع سد شبه دائم
سخانات مطاط سيليكون مرنةسلسلة أوميغاSRFR / SRFG ، M1250 / 0800
DC مزود طاقةToyotechDP30-03A
ملحيمحلي الصنع
عديدات السكاريد الدهنية (LPS) من السالمونيلا المعوية النمط المصلي المعويسيجما ألدريتشL6011
تكساس ريد ديكسترانثيرمو فيشر العلميD1830
15 مل بولي بروبيلين عالي الوضوح
أنبوب مخروطي		الشكل FALCON14-959-49B
0.45 & mu ؛ مرشح m (مرشح حقنة Minisart)Sartorius16555k
1.5ml Micro Tube ، AmberAxygenMCT-150-Xلحجب الضوء
1 مل حقنةكورياKV-S01
حقنة 3 مللقاح كورياKV-S03
حقنة 10 مللقاح كورياKV-S10 0.3
مل حقنة الأنسولينBecton Dickinson324900
كريم إزالة الشعر 100 ملقطنية للجسم
ABDI
Zoletil 50 5 ملVirbac
Rompun 10 ملتسخين باير
الخلية الحيةPH-S-10بحجم مصمم خصيصا
الخليةالحيةCU-301
مقص Microdessectionهارفارد72-5418
مقصRobozRS-5882
ملقطRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN (إصدار أسود)Carl Zeissل LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
برنامج تحليلVolocityPerkinElmer
أدوات أدوات BJM محلول مخزن بالفوسفات مسحة لوحة أدوات وحدة تحكم DC أدوات جهاز برنامج

المراجع

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LPS

مقالات ذات صلة