استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

Jui-Tung Liu; Mary Paige Lamprecht; Stephen A. Duncan

doi:10.3791/57194

مقالة منهجية

استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

DOI:

10.3791/57194

⸱

مايو 19, 2018

Jui-Tung Liu¹ , Mary Paige Lamprecht¹ , Stephen A. Duncan¹

¹Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف البروتوكول المعروضة هنا منبر لتحديد الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد. ويرد وصف خطوة بخطوة تفاصيل كيفية التفريق بين إيبسكس في الخلايا التي تحتوي على خصائص تتمثل في لوحات 96-جيدا، واستخدام الخلايا للشاشة للجزيئات الصغيرة مع الأنشطة العلاجية المحتملة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على تمييز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) إلى الخلايا مثل تتمثل (عملية) يوفر فرصاً جديدة لدراسة أخطاء فطرية في الأيض الكبدي. ومع ذلك، يتطلب الإجراء توفير منبر يعتمد تحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تستخدم لعلاج أمراض الكبد، ثقافة بتنسيق متوافق مع فحص آلاف مركبات. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام ثقافة محددة تماما الظروف التي تسمح للتفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في زراعة الأنسجة 96-جيدا لوحات استنساخه. كما أننا نقدم مثالاً على استخدام المنصة لمركبات الشاشة لقدرتها على خفض الابوليبوبروتين ب (أبوب) تنتج من خلايا الكبد المتولدة من مريض الكوليستيرول عائلية المستمدة من اللجنة التوجيهية. توافر منصة متوافق مع اكتشاف المخدرات ينبغي السماح للباحثين التعرف على علاجات جديدة للأمراض التي تؤثر على الكبد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتمد النجاح في تحديد الأدوية التي يمكن استخدامها لاستهداف مرض نادر على تطوير الاختبارات التي يمكن استخدامها لفرز. الفرضية أو الشاشات المستندة إلى الهدف (عكس الصيدلة) مفيدة ولكن تحتاج إلى فهم تفصيلي للأساس الجزيئي للمرض. شاشات المظهرية (علم الصيدلة الكلاسيكي) تجنب الحاجة إلى فهم تفصيلي للمسارات البيوكيميائية، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تطوير النماذج التي تعكس بدقة الفسيولوجيا المرضية لهذا المرض. وعلى الرغم من الحماس للنهج المستندة إلى الهدف، تكشف التحاليل المخدرات إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة في الدرجة الأولى أن شاشات المظهرية كانت أكثر نجاحا بكثير¹. والهدف العام لهذا الأسلوب إنشاء منبر للإنتاجية العالية الفحص التي يمكن استخدامها لتحديد الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد الأيضية. وقد وصفت عدة نماذج في المختبر بما في ذلك خلايا الكبد الأولية والخلايا الكبدي و الخلايا السلف الكبد². ومع ذلك، معظم هذه النماذج على قيود، وهناك حاجة للنماذج الجديدة التي يمكن أن الخص بدقة الفسيولوجيا المرضية لقصور الكبد الأيضية في الثقافة. في الآونة الأخيرة، الخلايا الجذعية pluripotent البشرية جنبا إلى جنب مع تحرير الجينات قد أتاح فرصة لنموذج حتى أندر من الأمراض النادرة في الثقافة دون الحاجة إلى الوصول إلى المرضى مباشرة³. أثناء استخدام إيبسكس الخاصة بالمريض كما أداة لاكتشاف الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد نادرة معقولة من الناحية المفاهيمية، هناك فقط عدد قليل من التقارير التي تثبت جدوى هذا النهج⁴. ومع ذلك، أنشأنا مؤخرا منصة التي تستخدم خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية لتحديد الأدوية التي يمكن إعادة توجيه الغرض منه لعلاج أوجه القصور في الأيض الكبد⁵بنجاح.

ويوضح هذا البروتوكول عملية التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في لوحات 96-جيدا واستخدامهم للشاشة مكتبة جزيئات الصغيرة. فهو يصف أيضا تحليل نقطة النهاية باستخدام الكوليستيرول كمثال على أمراض الكبد الأيضية. ينبغي أن يكون هذا النهج مفيداً لدراسة دور والتطبيق من الجزيئات الصغيرة في سياق أمراض الكبد المعدية وأمراض الكبد الأيضية وسمية العقاقير وغيرها من اضطرابات الكبد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-ثقافة الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

طلاء الماشوب البشري ه-كادهيرين Fc الانصهار البروتين (E-كندي-Fc) أو المصفوفات الأخرى مناسبة للثقافة هبسك ⁶
1. تمييع ه-كندي-Fc إلى 15 ميكروغرام/مل مع دولبيكو 's "فوسفاتيبوفيريد المالحة" التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (دببس (+)).
2. معطف أطباق زراعة الأنسجة تعليق 100 ملم مع 5 مل من المخفف ه-كندي-Fc واحتضان في ˚C 37 على الأقل 1 حاء الركازة إزالة واستبدال مع 5 مل متوسطة (مثلاً، mTeSR1 يشار م والمتوسطة من الآن فصاعدا)⁷.
  ملاحظة: أعد ثقافة الوسيلة المستخدمة في هذا البروتوكول عقب البروتوكولات المنشورة⁷. بيد عدة الاستعدادات وسائل الإعلام الأخرى وقد وصف، أو متاحة تجارياً، التي يحتمل متوافقة مع الإجراء.
3. استرداد قنينة إيبسكس cryopreserved من النتروجين السائل. ذوبان الجليد في 37 ˚C حتى تبقى كريستال الثلج صغيرة. بلطف "الماصة؛" الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل عقيمة التي تحتوي على 4 مل م-المتوسطة.
4. الطرد المركزي في ز 300 x 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية ولطف إعادة تعليق الخلايا مع 5 مل المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون من Y-27632، مثبط انتقائي كيناز البروتين تحتوي المرتبطة رو، ولفائف ملفوف (روك).
5. إزالة م المتوسطة من الخطوة 1.1.2، ونقل 5 مل خلايا من الخطوة 1.1.4 إلى تعليق 100 ملم ه كاد-نادي-المغلفة بزراعة الأنسجة الأطباق.
الحفاظ على إيبسكس البشرية في الثقافة
1. وبمجرد التوصل إلى إيبسكس حول كونفلوينسي 80%، إزالة ثقافة متوسطة ويغسل مرة واحدة مع الكالسيوم والمغنيسيوم مجاناً دببس (-). نضح دببس (-) وإضافة كمية كافية من حل يدتا 0.02 في المائة لتغطية اللوحات، ثم احتضانها ليصل إلى 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  ملاحظة: ينبغي أن تتضمن اللوحة في التقاء 80%، حوالي 2 × 10⁷ الخلايا. من المهم عدم كسا الخلايا، ويضمن احتفاظ الخلايا التشكل غير متمايزة. يمكن تحديد بلوريبوتينسي للخلايا بواسطة تلطيخ مع الخلايا الجذعية علامة هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 أو ما يعادل⁸.
2. بمجرد أن تبدأ الخلايا لإطلاق سراح، إزالة الحل يدتا 0.02 في المائة والفيضانات الطبق مع 10 مل من م المتوسطة للإفراج عن الخلايا. المعونة مفرزة إيبسكس بلطف بيبيتينج.
  ملاحظة: وقت حضانة متوسط الخلايا لفصل حوالي 3 دقيقة، ولكن هذا يحتاج إلى يتحدد تجريبيا لكل خط اللجنة التوجيهية. ينبغي الإفراج عن الخلايا كمجموعات صغيرة تحتوي على حوالي 5-10 إيبسكس كل كتلة.
3. نقل 1/10 الخلايا المعلقة الواحدة الطازج ه-كندي-نادي المغلفة 100 ملم تعليق زراعة الأنسجة طبق يحتوي على 5 مل م-المتوسطة. احتضان الثقافات في 37 ˚C تحت 4% O_2%5 CO₂ والتغير المتوسط يوميا.
  ملاحظة: على الرغم من أن إيبسكس بشكل روتيني تستزرع الظروف الفسيولوجية الأكسجين لتعزيز بلوريبوتينسي، إيبسكس يمكن أيضا زراعتها باستخدام الأكسجين المحيطة.

2-التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في لوحات 96-جيدا

ملاحظة: يصف هذا القسم التفريق بين إيبسكس في تنسيق متوافق مع الفحص. باستخدام هذا النهج، من الممكن للحث على إيبسكس البشرية التفريق وشكل الخلايا مثل تتمثل في غضون 20 يوما. بينما هذا مناسبة لمعظم فحوصات، يمكن تمديد طول الثقافة لتحسين نضج الخلايا.

طلاء ألواح زراعة الأنسجة 96-جيدا مع انخفاض عامل نمو الغشاء مصفوفة
1. إعداد المخزون بتمييع المصفوفة إلى 2 مغ/مل مع DMEM/F12 العقيمة المثلج زراعة الأنسجة المتوسطة. تقسيم المصفوفة إلى 250 ميكروليتر مختبرين وتخزينها في-80 ˚C حتى المطلوبة. تشيل 10 مل من DMEM/F12 على الجليد ل 30 دقيقة استرداد 250 ميكروليتر قاسمة للأسهم مصفوفة 2 مغ/مل وذوبان الجليد على الجليد.
2. ضم المصفوفة مع 10 مل من البرد DMEM/F12 بالاختلاط بلطف باستخدام ماصة مبردة مسبقاً جعل التركيز النهائي 0.05 مغ/مل.
3. نقل 100 ميكروليتر من مصفوفة المخفف لكل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة 96-جيدا. احتضان في 37 ˚C، 4% O₂5% CO₂ على الأقل 1 حاء تجاهل المصفوفة واستبدال مع 50 ميكروليتر من M-المتوسطة الواحدة وكذلك. تخزين في 37 درجة مئوية، 4% O_2%5 CO₂ حتى حاجة.
لوحة خلايا للتمايز
1. الثقافة إيبسكس على ألواح 100 ملم حتى الاقتراب التقاء 80% من الخلايا. تأكد من أن اللوحة تحتوي على حوالي 2 × 10⁷ الخلايا. تحديد أرقام خلية بخلية تدفق سيتوميتير أو هيموسيتوميتير.
  ملاحظة: مع التجربة، يمكن الحكم على نوعية الخلايا إيبسكس بالفحص المجهري؛ ومع ذلك، ما يقرب من 98 في المائة الخلايا ينبغي التعبير عن علامات بلوريبوتينسي مثل حانمه هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 عند قياسه بنظام مراقبة الأصول الميدانية أو إيمونوستينينج. من المهم أن الخلايا تظل الفاصل بنشاط ولا هي متضخمة.
2. حصاد إيبسكس من كل لوحة 100 ملم، نضح المتوسطة الثقافة وشطف مع 5 مل دببس (-). استبدال الشطف مع 3 مل من محلول مفرزة الخلية (مثلاً، أككوتاسي) واحتضانها لحوالي 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 4% O₂5% CO₂.
  ملاحظة: من المهم أن تتبع مفرزة الخلايا بالفحص المجهري. لا لا على هضم مع أككوتاسي. والهدف الإفراج عن الخلايا كمجموعات صغيرة مع الحد الأدنى من العلاج.
3. بمجرد أن تبدأ الخلايا في فصل، الحصاد بإضافة 7 مل م-المتوسطة. "الماصة؛" عدة مرات أن تنأى مستعمرات الخلايا في مجموعات صغيرة في جميع أنحاء 3-6 خلايا (الشكل 1A).
4. جمع في إيبسكس إلى أنبوب 15 مل العقيمة أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في ز 300 x 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل م والمتوسطة.
5. توزيع بالتساوي الخلايا على لوحات المغلفة بمصفوفة 96-جيدا قبل بيبيتينج ميكروليتر 50 تعليق الخلايا في كل بئر. لإعداد كل لوحة 96، حسنا، استخدم لوحة 100 ملم واحد من إيبسكس مع الخلايا في حوالي 80% كونفلوينسي الذي يحتوي على حوالي 5 × 10⁶ خلايا التفريق بين الإعداد. استخدام ماصة متعددة القنوات لتسريع هذه العملية. ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في ˚C 37, 5% 4% O₂CO₂.
  ملاحظة: من المهم أن تودع عددا متساويا من الخلايا في كل بئر لضمان الاختلاف استنساخه.
الحث على التفريق بين الخلايا
1. دراسة لوحات 96-جيدا بالفحص المجهري التأكد من أن الخلايا تغطي 70 في المائة على الأقل من سطح كل فرد كذلك. إذا كانت التغطية أقل من 70%، يستعاض عن المتوسط بمتوسطة طازجة واحتضانها 24 ساعة إضافية في ˚C 37، 4% O₂5% CO₂.
  ملاحظة: حضانة الخلايا لأكثر من 48 ساعة بعد الطلاء دون الذي يحفز التمايز عادة يقلل من كفاءة التمايز. التمايز وستحدث أيضا استخدام الأكسجين المحيطة، على الرغم من أن قد تكون الكفاءة المتضررة.
2. ليوم 1 إلى 2 يوم من التمايز، استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي تكملة مع 2% B27 (بدون الأنسولين)، 100 نانوغرام/مليلتر أضافت A و 10 نانوغرام/مل BMP4 20 نانوغرام/مل FGF2. إضافة 100 ميكروليتر من المتوسطة كل بئر واحتضان في ˚C 37، في المحيط س₂5% CO₂ مع تغير متوسط يومي لمدة يومين.
  ملاحظة: التعامل مع عدد كبير من لوحات 96-جيدا تتطلب استخدام ماصة ساعد أو الروبوت. الممصات 12 قناة وقناة 96 مثالية للتغير المتوسط اليومي.
3. ليوم 3 إلى يوم 5 من التمايز، تستكمل استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي مع % 2 B27 (بدون الأنسولين) و 100 نانوغرام/مليلتر أضافت أ ثقافة الخلايا في ˚C 37، في المحيط س₂5% CO₂ مع تغير المتوسط اليومي لمدة 3 أيام.
4. في تمايز يوم 5، قبل استبدال مع الطازجة الثقافة المتوسطة، علاج كل جيدا مع 100 ميكروليتر 0.02% يدتا الحل 30 ثانية، ثم إزالة واستبدال مع الطازجة الثقافة المتوسطة.
  ملاحظة: إذا كان التفريق بين للأنسجة فعالة، أحادي الطبقة التفريق بين الخلايا عرضه لتقشير من اللوحة. علاج قصيرة مع 0.02% يدتا الحل يساعد على تخفيف مفرزة الخلية. لا يؤثر هذا العلاج التمايز إلى خلايا الكبد.
5. للتفريق بين 6 أيام إلى 10، استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي/2% B27 (مع الأنسولين) وتستكمل مع 20 نانوغرام/مل BMP4 و 10 نانوغرام/مل FGF2 واحتضان في ˚C 37, 5% 4% O₂CO₂ لمدة 5 أيام مع تغير المتوسط اليومي. هذه المرحلة يدفع الخلايا تفرق في الخلايا الكبدية السلف.
6. للتفريق بين 11 يوما إلى 15، استبدال المتوسطة الثقافة مع ربمي/2% B27 (مع الأنسولين) تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر هجف. احتضان في ˚C 37, 5% 4% O₂CO₂ لمدة 5 أيام مع تغير المتوسط اليومي.
7. للتفريق بين 16 يوما إلى 20، يستبدل المتوسطة الثقافة متوسطة ثقافة خلية تتمثل (HCM) وتستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من Oncostatin-M (OSM). احتضان الخلايا في ˚C 37، في المحيط س₂5% CO₂ مع تغير المتوسط اليومي لمدة 5 أيام.
  ملاحظة: إمكانية تكرار نتائج للتفريق بين الآبار الفردية يمكن تحديد كفاءة بقياس المستوى النسبي للزلال أو وكالة فرانس برس APOB يفرزها أليسا في المتوسط (انظر 3.2).

3-صغيرة جزيء الفرز

ملاحظة: فيما يلي وصف للإجراءات المستخدمة لتحديد المركبات التي يمكن استخدامها لتخفيض مستوى أبوب في الأجلين المتوسط وتتمثل مثل الخلايا المستمدة من الكوليستيرول الأسرية إيبسكس. وقد وصفت وصفاً للنموذج واستخدامها في التعرف على الكوليسترول تخفيض الأدوية بالتفصيل سابقا⁵^،⁹. في المثال الحالي، تم فحص المركبات 1,000 من مكتبة "جمع مجمع ولاية كارولينا الجنوبية" (³من اتفاقية استكهولم). تم اختبار كل مجمع بتركيز 2 ميكروغرام/مل.

المعاملة للجنة التوجيهية-المشتقة من خلايا الكبد مع جزيئات صغيرة
1. تمييع مكتبة المجمع الرئيسي لإنشاء لوحات مخزون العمل مع المركبات بتركيز 20 ميكروغرام/مل في [دمس] 2% ومخزن في ˚C-20.
2. إعداد لوحات 96-جيدا ما يكفي من خلايا الكبد المستمدة من اللجنة التوجيهية للسماح لكل مجمع لفحصها.
  ملاحظة: ستحدد عدد المركبات فحص عدد 96-جيدا لوحات المطلوبة. وبصفة عامة، واحد جيد ينبغي أن تعد لكل الآبار المجمع، بالإضافة إلى إضافية لأي عينات مراقبة. عادة يتم تجنب الآبار الأبعد من اللوحة تقليل احتمال وقوع تأثيرات الحافة التي يمكن الفاسدة التفسير. يمكن تحديد عدد الزيارات استخدام الأسلوب الحرز z دون الحاجة إلى استخدام replicates. في حالة تضمين replicates، أنها أكثر ملاءمة لاستخدام الاختبار t.
3. عند انتهاء التمايز (يوم 20، انظر 2.3.7)، تحل محل المتوسطة الثقافة مع 100 ميكروليتر من HCM جديدةوتستكمل مع 20 نانوغرام/مل م Oncostatin. احتضان في 37 ˚C، 4% O₂5% CO₂ للضبط 24 h. استرداد المتوسطة الثقافة إلى لوحة 96-بئر جديدة ومخزن في ˚C-20. استخدم هذا النموذج لحساب مستوى أبوب في المتوسط قبل الإضافة للمخدرات.
4. إضافة ميكروليتر 90 من HCM جديدة تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من Oncostatin-M في كل بئر. إضافة 10 ميكروليتر من كل مجمع من المخزون العامل بعد الاختلاط بيبيتينج. إضافة [دمس] إلى 0.2 في المائة السيطرة على الآبار تتطابق مع التركيز النهائي في العينات المعالجة واحتضان في 37 ˚C، جمع المتوسطة الثقافة المحيطة س₂5% CO₂ للضبط 24 حاء وتخزين في ˚C-20. استخدم هذا النموذج لتحديد مستوى أبوب بعد العلاج بالمركبات.
5. اختياري-يمكن معالجة الخلايا المتبقية إيمونوستينينج، وبقاء الخلية، أو تحليلات لمستويات مرناً باستخدام نهج قياسية.
  ملاحظة: تم تصميم هذه الشاشة لتحديد الأدوية التي كان لها أثر سريع على مستويات أبوب. ومع ذلك، اعتماداً على نموذج المرض، وفحوصات المصب، أو إليه عمل المخدرات، قد يكون من المفيد لعلاج العينة لعدة أيام.
تحديد مستويات APOB قبل أليسا
1. تحديد تركيز الابوليبوبروتين ب (أبوب) من كل ما قبل وما بعد المخدرات تعامل العينات باستخدام مجموعة تطوير أليسا APOB بشرية عقب البروتوكولات الخاص بالشركة المصنعة.
2. إعداد الحلول التالية
  1. المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، تتألف من 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. تخزين في 4 ˚C حتى الاستخدام.
  2. المخزن المؤقت للحضانة، تتألف من 0.05% 20 توين و 0.1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. تخزين في 4 ˚C حتى الاستخدام.
3. تحضير الأجسام المضادة أبوب (ماب 20/17) بإضعاف إلى 2 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. إضافة 100 ميكروليتر من جسم المخفف كل بئر واحتضان في 4 ˚C بين عشية وضحاها.
4. إزالة الضد من لوحات المقايسة وتغسل جيدا مرتين مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 كل.
5. إضافة 200 ميكروليتر/جيدا من 0.05% 20 توين، 0.1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 واحتضان على منصة تهتز ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
6. إعداد منحنى المعياري 8 نقطة استخدام 0.05% 20 توين و 0.1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 مع التركيزات التالية من أبوب: 300 نانوغرام/مل، 200 نانوغرام/مليلتر و 175 نانوغرام/مل، 150 نانوغرام/مليلتر، 125 نانوغرام/مل، 100 نانوغرام/مليلتر، 75 نانوغرام/مليلتر و 50 نانوغرام/مل.
7. تمييع عينات الاختبار 1:4 مع 0.05% 20 توين و 0.1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4.
8. بعد 1 ساعة من حجب مع المخزن المؤقت للحضانة، تجاهل المخزن المؤقت وغسل الأطباق بالانزيم خمس مرات مع 200 ميكروليتر من 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4.
9. تماما إزالة أي مخزن مؤقت الغسيل المتبقية ونقل ميكروليتر 90 من العينات مخففة والمعايير أبوب إلى لوحات المقايسة. احتضان في درجة حرارة الغرفة على شاكر ح 1.
10. تجاهل العينة وتغسل مع 200 ميكروليتر 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 كل بئر. كرر يغسل ما مجموعة 5 مرات. إضافة 100 ميكروليتر الواحدة من ماب LDL 11-البيوتين المخفف 1:1,000 جيدا في 0.05% 20 توين و 0.1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4. احتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة تهتز ح 1.
11. تجاهل الكاشف وتغسل مع 200 ميكروليتر الواحدة وكذلك الغسيل المخزن المؤقت 5 مرات. إضافة 100 ميكروليتر كل بئر جسم ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية (1:1، 000 تمييع استخدام المخزن المؤقت للحضانة)، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة على منصة تهتز ح 1.
12. تجاهل الكاشف وتغسل مع 200 ميكروليتر 0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 كل بئر. كرر يغسل ما مجموعة 5 مرات. تماما إزالة المخزن المؤقت غسيل المتبقية من لوحات المقايسة وإضافة 100 ميكروليتر كل من تيتراميثيلبينزيدين (TMB) الركيزة الحل جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق.
13. مباشرة دون إزالة الركيزة TMB، إضافة 100 ميكروليتر كل من وقف الحل (1N HCl) جيدا.
14. تحديد امتصاص 450 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
15. ويمكن إنشاء منحنى قياسي، باستخدام أسلوب "الانحدار اللوجستي المعلمة أربعة"، ثم يستخدم لتحديد تركيز أبوب في كل عينة¹⁰.
16. فحص المخدرات قبل: نسبة المخدرات بعد أبوب في كل عينة لتحديد المركبات مع احتمال انخفاض أبوب المستويات في الأجل المتوسط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجيل تتمثل - مثل الخلايا: ويصف الشكل 1 الإطار الزمني للتغييرات التي تحدث أثناء التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل. ثقافة إيبسكس في ه-كندي-نادي يوفر حوالي 2 مم قطر المستعمرات التي تعبر عن علامة pluripotent OCT4 (الشكل 1 أ-ب). مورفولوجيا الخلايا المزروعة في مصفوفة ه-كادهيرين ستكون مختلفة قليلاً إلى تلك المزروعة على الأسطح الأخرى. أنها تميل إلى أن تكو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف على أساس اكتشاف العقاقير، حيث يتم تحديد الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على نشاط البروتين محددة، محط اهتمام العديد من الجهود فرز القائمة. رغم أن هذا النهج قد قدمت عديدة المستحضرات الصيدلانية، شاشات استناداً إلى عكس النمط الظاهري، علم الصيدلة الكلاسيكي، كانت أكثر نجاحا في تحديد المركبات في الدرجة الأولى التي كانت فعالة سريرياً¹. وضع غير مؤات لاكتشاف المخدرات المظهرية أنها تعتمد على توافر نماذج المرض المناسب. وهذا يمكن أن يكون تحديا عندما تتوفر نماذج الخلية من المرض، أو عندما تفشل الأنواع الحيوانية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (DK55743، DK087377، DK102716، و HG006398 إلى احظ). ونود أن نشكر الدكتور بيهشاد بورنصر، والدكتور جيمس Heslop وجينغ ران لمساهماتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أطباق زراعة الأنسجة المعقمة 100 مم × 20 مم ؛	أطباق ثقافة التعليق	المعقمة 430167
Corning		430591
96 بئرا لوحة زراعة الأنسجة Corning ؛	كورنينج	3595
الألبومين المضاد	للإنسان داكو	أ 0001
مضاد للإنسان FOXA2 (6C12)	Novus البيولوجي	H00003170-M12
المضاد للإنسان HNF4 ألفا	سانتا كروز	SC-6556
الأجسام المضادة للإنسان Oct-3/4	سانتا كروز	SC-9081
المضادة للإنسان SOX17	R & D	AF1924
مضاد للإنسان TRA-1-60 FITC مترافق	Millipore	FCMAB115F
Activin A بروتين بشري مؤتلف ؛	Invitrogen	PHC9563
B-27 ، ناقص الأنسولين ؛	مكمل Invitrogen	0050129SA
B-27 ، خال من المصل ؛	Invitrogen	17504044
BMP4 بروتين بشري مؤتلف ;	الخلايا PHC9533		Invitrogen
StemPro Accutase	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo Luminescent Cell Proability Assay	Promega	7572
DPBS + (كالسيوم ، مغنيسيوم)	Invitrogen	14040-133
DPBS- (خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم)	Invitrogen	14190-144
DMEM / F-12 ، HEPES ؛	Invitrogen	11330057
ELISA البشرية APOB ELISA مجموعة التطوير	Mabtech	3715-1H-20
عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2)	Invitrogen	PHG0023
وسط ثقافة الخلايا الكبدية (HCM Bullet Kit) & nbsp ؛	Lonza	CC-3198
عامل نمو خلايا الكبد (HGF)	Invitrogen	PHC0321
L-Glutamine ؛	Invitrogen	25030081
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية	Invitrogen	11140076
Oncostatin M (OSM) البروتين البشري المؤتلف	Invitrogen	PHC5015
البنسلين الستربتومايسين ;	Invitrogen	15140163
Feeder خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات متوسطة: mTesR1 & nbsp ؛	STEMCELL TECHNOLOGIES	5850
مصفوفة الغشاء القاعدي لعامل النمو المنخفض	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES	Invitrogen	22400105
StemStick مصفوفة محددة ل hPSC (E-cad-Fc)	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA Substrate	Solution Thermo Scientific ؛	34022
Anti-TRA-1-60 FITC مترافق	Millipore	FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02٪	Lonza	17-711E
Y-27632 مثبط الصخور	STEMCELL Technologies	72302

مكمل كاشف تفكك

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15(2006).
Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة