ويصف البروتوكول المعروضة هنا منبر لتحديد الجزيئات الصغيرة لعلاج أمراض الكبد. ويرد وصف خطوة بخطوة تفاصيل كيفية التفريق بين إيبسكس في الخلايا التي تحتوي على خصائص تتمثل في لوحات 96-جيدا، واستخدام الخلايا للشاشة للجزيئات الصغيرة مع الأنشطة العلاجية المحتملة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القدرة على تمييز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (إيبسكس) إلى الخلايا مثل تتمثل (عملية) يوفر فرصاً جديدة لدراسة أخطاء فطرية في الأيض الكبدي. ومع ذلك، يتطلب الإجراء توفير منبر يعتمد تحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تستخدم لعلاج أمراض الكبد، ثقافة بتنسيق متوافق مع فحص آلاف مركبات. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام ثقافة محددة تماما الظروف التي تسمح للتفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل في زراعة الأنسجة 96-جيدا لوحات استنساخه. كما أننا نقدم مثالاً على استخدام المنصة لمركبات الشاشة لقدرتها على خفض الابوليبوبروتين ب (أبوب) تنتج من خلايا الكبد المتولدة من مريض الكوليستيرول عائلية المستمدة من اللجنة التوجيهية. توافر منصة متوافق مع اكتشاف المخدرات ينبغي السماح للباحثين التعرف على علاجات جديدة للأمراض التي تؤثر على الكبد.
المقدمة
ويعتمد النجاح في تحديد الأدوية التي يمكن استخدامها لاستهداف مرض نادر على تطوير الاختبارات التي يمكن استخدامها لفرز. الفرضية أو الشاشات المستندة إلى الهدف (عكس الصيدلة) مفيدة ولكن تحتاج إلى فهم تفصيلي للأساس الجزيئي للمرض. شاشات المظهرية (علم الصيدلة الكلاسيكي) تجنب الحاجة إلى فهم تفصيلي للمسارات البيوكيميائية، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تطوير النماذج التي تعكس بدقة الفسيولوجيا المرضية لهذا المرض. وعلى الرغم من الحماس للنهج المستندة إلى الهدف، تكشف التحاليل المخدرات إدارة الأغذية والعقاقير المعتمدة في الدرجة الأولى أن شاشات المظهرية كانت أكثر نجاحا بكثير1. والهدف العام لهذا الأسلوب إنشاء منبر للإنتاجية العالية الفحص التي يمكن استخدامها لتحديد ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-ثقافة الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent
-
طلاء الماشوب البشري ه-كادهيرين Fc الانصهار البروتين (E-كندي-Fc) أو المصفوفات الأخرى مناسبة للثقافة هبسك 6
- تمييع ه-كندي-Fc إلى 15 ميكروغرام/مل مع دولبيكو 's "فوسفاتيبوفيريد المالحة" التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (دببس (+)).
- معطف أطباق زراعة الأنسجة تعليق 100 ملم مع 5 مل من المخفف ه-كندي-Fc واحتضان في ˚C 37 على الأقل 1 حاء الركازة إزالة واستبدال مع 5 مل متوسطة (مثلاً، mTeSR1 يشار م والمتوسطة من الآن فصاعدا)7.
ملاحظة: أعد ثقافة الوسيلة المستخدمة في هذا البروتوكول عقب البروتوكولات المنشور....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الجيل تتمثل - مثل الخلايا: ويصف الشكل 1 الإطار الزمني للتغييرات التي تحدث أثناء التفريق بين إيبسكس البشرية إلى الخلايا مثل تتمثل. ثقافة إيبسكس في ه-كندي-نادي يوفر حوالي 2 مم قطر المستعمرات التي تعبر عن علامة pluripotent OCT4 (الشكل 1 أ-ب). مورفولوجيا الخلايا المزروعة في مصفوفة ه-كادهيرين ستكون مختلفة قليلاً إلى تلك المزروعة على الأسطح الأخرى. أنها تميل إلى أن تكو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الهدف على أساس اكتشاف العقاقير، حيث يتم تحديد الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على نشاط البروتين محددة، محط اهتمام العديد من الجهود فرز القائمة. رغم أن هذا النهج قد قدمت عديدة المستحضرات الصيدلانية، شاشات استناداً إلى عكس النمط الظاهري، علم الصيدلة الكلاسيكي، كانت أكثر نجاحا في تحديد المركبات في الدرجة الأولى التي كانت فعالة سريرياً1. وضع غير مؤات لاكتشاف المخدرات المظهرية أنها تعتمد على توافر نماذج المرض المناسب. وهذا يمكن أن يكون تحديا عندما تتوفر نماذج الخلية من المرض، أو عندما تفشل الأنواع الحيوانية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (DK55743، DK087377، DK102716، و HG006398 إلى احظ). ونود أن نشكر الدكتور بيهشاد بورنصر، والدكتور جيمس Heslop وجينغ ران لمساهماتها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق زراعة الأنسجة المعقمة 100 مم × 20 مم ؛ | أطباق ثقافة التعليق | المعقمة 430167 | |
| Corning | 430591 | ||
| 96 بئرا لوحة زراعة الأنسجة Corning ؛ | كورنينج | 3595 | |
| الألبومين المضاد | للإنسان داكو | أ 0001 | |
| مضاد للإنسان FOXA2 (6C12) | Novus البيولوجي | H00003170-M12 | |
| المضاد للإنسان HNF4 ألفا | سانتا كروز | SC-6556 | |
| الأجسام المضادة للإنسان Oct-3/4 | سانتا كروز | SC-9081 | |
| المضادة للإنسان SOX17 | R & D | AF1924 | |
| مضاد للإنسان TRA-1-60 FITC مترافق | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A بروتين بشري مؤتلف ؛ | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 ، ناقص الأنسولين ؛ | مكمل Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 ، خال من المصل ؛ | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 بروتين بشري مؤتلف ; | الخلايا PHC9533 | Invitrogen | |
| StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Proability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS + (كالسيوم ، مغنيسيوم) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS- (خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM / F-12 ، HEPES ؛ | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA البشرية APOB ELISA مجموعة التطوير | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| وسط ثقافة الخلايا الكبدية (HCM Bullet Kit) & nbsp ؛ | Lonza | CC-3198 | |
| عامل نمو خلايا الكبد (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine ؛ | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) البروتين البشري المؤتلف | Invitrogen | PHC5015 | |
| البنسلين الستربتومايسين ; | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات متوسطة: mTesR1 & nbsp ؛ | STEMCELL TECHNOLOGIES | 5850 | |
| مصفوفة الغشاء القاعدي لعامل النمو المنخفض | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemStick مصفوفة محددة ل hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate | Solution Thermo Scientific ؛ | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC مترافق | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02٪ | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 مثبط الصخور | STEMCELL Technologies | 72302 |
المراجع
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (20....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
