مقالة منهجية

تضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة للتحليل المجهري

DOI:

10.3791/57196

⸱

مارس 23, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Biology, Barnard College, Columbia University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا التثبيت وتضمين البارافين وتقنيات تقطيع رقيقة للأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. في إعداد العينات، يمكن تصور أنماط التعبير محيطة ومراسل بيوفيلم بالفحص المجهري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقطيع عن طريق تضمين البارافين أسلوب المنشأة على نطاق واسع في نظم حقيقية النواة. هنا نقدم طريقة لتثبيت البرنامج، التضمين، وتمزيقها للأغشية الحيوية سليمة مستعمرة الميكروبية باستخدام شمع البارافين perfused. للتكيف مع هذا الأسلوب للاستخدام في مستعمرة الأغشية الحيوية، تطوير تقنيات للحفاظ على كل عينة على الركيزة النمو وتغليف شفاف فإنه مع أوفيرلايير أجار، وإضافة يسين للحل مثبت. هذه التحسينات تحسين الاحتفاظ بعينه والحفاظ على ميزات ميكرومورفولوجيكال. نماذج إعداد بهذه الطريقة قابلة رقيقة تمزيقها والتصوير بالمجهر الإلكتروني الضوء، والأسفار، وانتقال العدوى. نحن طبقت هذه التقنية على مستعمرة الأغشية الحيوية الزائفة الزّنجاريّةPseudomonas سينكسانثا ونجحت عصية، و الكوليرا. ارتفاع مستوى التفاصيل التي تظهر في العينات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع مراسل سلالة الهندسة أو استخدام الأصباغ محددة، يمكن أن توفر أفكاراً مثيرة في علم وظائف الأعضاء وتنمية المجتمعات الميكروبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معظم الميكروبات لها القدرة على شكل الأغشية الحيوية، الذي عقد مجتمعات خلايا معا بالذات المنتجة المصفوفات. الأغشية الحيوية يمكن زراعتها في أنواع عديدة من الأجهزة المادية، مع مختلف النظم لتوفير المواد الغذائية والركيزة. فحوصات محددة لتشكيل بيوفيلم تميل إلى أن تسفر عن هياكل متعددة الخلايا استنساخه، وملاحظة أبنية مشتركة بالنسبة للأنواع المتنوعة فيلوجينيتيكالي على المجتمع أو على مستوى العيانية. عندما تزرع الميكروبات كمستعمرات في المتوسطة الصلبة تحت جو، ينقل المعلومات حول القدرة على إنتاج مصفوفة مورفولوجيا العيانية وكثيراً ما يرتبط مع سائر الصفات 1،2،3. البنية الداخلية للمستعمرات الميكروبية يمكن أيضا أن توفر أدلة بخصوص بيوفيلم-خاصة بالكيمياء وعلم وظائف الأعضاء، ولكن كان من الصعب تميز. تمكين التطبيقات الحديثة لتقنيات كريومبيدينج وكريوسيكتيونينج للمستعمرات البكتيرية التصوير والتصور من السمات المحددة في قرار لم يسبق له مثيل 4،،من56. ومع ذلك، أظهرت الدراسات مع الأنسجة الحيوانية أن التضمين البارافين يوفر الحفاظ على تفوق مورفولوجيا بالمقارنة مع كريومبيدينج 7 ، وقد استخدمت لتصور البكتيريا في أنسجة 8،9. ولذلك قمنا بتطوير بروتوكول للتثبيت، وتضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة. وهنا، نحن سوف تصف إعداد الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 بيوفيلم مستعمرة مقاطع رقيقة 10،11، ولكن نحن أيضا بنجاح تطبيق هذا الأسلوب للأغشية الحيوية التي شكلتها البكتيريا سينكسانثا pseudomonas، ونجحت عصية، و الكوليرا12.

تتبع عملية التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة الأغشية الحيوية منطق بسيط. أولاً، يتم المغطى الأغشية الحيوية في طبقة من أجار للحفاظ على مورفولوجيا أثناء المعالجة. ثانيا، المغطى-الأغشية الحيوية مغمورة في مثبت للجزيئات التشعب والحفاظ على ميكرومورفولوجي. هذه هي المجففة ثم مع الكحول، وتطهيرها بالمذيبات غير قطبية أكثر، وثم تسللت مع شمع البارافين السائل. مجرد تسلل، يتم تضمين العينات إلى كتل الشمع لتمزيقها. قطع المقاطع، شنت على الشرائح، وثم امهاء بغية إعادتها إلى دولة أصلية أكثر. من هذه النقطة، يمكن الملون أو المشمولة في وسط تصاعد للتحليل المجهري.

وينتج هذا البروتوكول مقاطع رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مناسبة للتحليل النسيجي. مستعمرة بيوفيلم هياكل فرعية مرئية عندما يتم تصويرها رقيقة أقسام المعدة باستخدام هذا الأسلوب بالفحص المجهري الخفيفة. الأغشية الحيوية يمكن أيضا نمت على البقع الفلورسنت التي تحتوي على وسائط محددة للسمات الفردية أو الملون في خطوة الإماهة، مباشرة قبل تصاعد (خطوات 9.5-9.6). وأخيراً، يمكن إجراء هندسة عكسية الميكروبات لإنتاج البروتينات الفلورية بطريقة التأسيسي أو التنظيم مما يسمح في الموقع إبلاغ الخلية التعبير التوزيع أو الجينات داخل هذه المجتمعات. وقد استخدمنا هذه الأساليب لتحديد عمق بيوفيلم مستعمرة وتوزيع الخلايا وتوزيع مصفوفة، وأنماط النمو والتعبير الجيني الزمانية المكانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-نمو الزائفة الزّنجاريّة "مستعمرة الأغشية الحيوية"

  1. إعداد لوحات متوسطة-بلير
    1. إعداد تريبتوني 10 غرام/لتر، 10 غرام/لتر أجار الحل (انظر الجدول للمواد) في المياه.
    2. اﻷوتوكﻻف ل 20 دقيقة كول إلى 50-60 درجة مئوية في حمام مائي.
    3. صب 45 مل الحل تريبتوني أجار في صحن مربع 100 ملم × 100 ملم (انظر الجدول للمواد) باستخدام أنبوب مخروطي 50 مل. تسمح أجار ترسيخ (~ 20-30 دقيقة). صب طبقة الثانية، 15 مل فوق الطبقة الأولى. إزالة التكثيف من أغطية اسمحوا يصلب بين عشية وضحاها، إذا لزم الأمر بالمسح مع أنسجة خالية من الوبر.
  2. اكتشاف مستعمرة الأغشية الحيوية
    1. متتالية سلالات الفائدة من الأرصدة المجمد إلى رطل أجار لوحات13 واحتضانها في الظلام ح 12-16 في 37 درجة مئوية و 80-100% من الرطوبة النسبية.
    2. لكل سلالة أو تكرار، استخدم مستعمرة واحدة لتطعيم 2 مل رطل واحتضان في الظلام ح 12-16 في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
    3. الثقافة الفرعية بتمييع 1: 100 رطل الطازجة وتفرخ في الظلام ح 2.5-3 في 37 درجة مئوية مع الهز 250 لفة في الدقيقة.
    4. قياس الكثافة البصرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي وضبط مع رطل العقيمة لتحقيق تعليق خلية مع التطوير التنظيمي500 نانومتر ~ 0.5.
    5. اعتماداً على هذه المستعمرة المنشودة الحجم، بيبيت 2.5-10 ميليلتر من تعليق خلية على صفيحة متوسطة-بلير (تم إعداده في الخطوة 1، 1) والسماح على الفور لتجف ليمكن تيسير ~ 20 دقيقة ترك غطاء بيتري أجار القرب من لهب المكشوف تجفيف.
    6. احتضان المستعمرات بقعة في 25 درجة مئوية و 80-100% من الرطوبة النسبية، في الظلام لمدة تصل إلى 4 أيام.

2-إعداد الحل مثبت

  1. إعداد الحل مثبت في يوم الحصاد عينة. تمييع 37% فورمالدهيد (اتحاد كرة القدم) في برنامج تلفزيوني 1 x إلى تركيز نهائي من 4% اتحاد كرة القدم.
    تنبيه: اتحاد كرة القدم متقلبة والسامة. ارتداء معدات الوقاية ويعملون في غطاء دخان جيد التهوية.
  2. فورا قبل الاستخدام، حل هيدروكلوريد L-يسين في 4% فا (إعدادها في الخطوة 2، 1) في درجة حرارة الغرفة إلى تركيز نهائي من 50 مم L-يسين HCl.

3-توجيه تطبيق مثبت على بيوفيلم مستعمرة [اختياري]

ملاحظة: لقد وجدنا أن مورفولوجيا بيوفيلم هو الحفاظ على أفضل عندما تتم إضافة تراكب أجار قبل التثبيت. بيد أن هذه الخطوة تشكل أيضا تغييرا في الظروف البيئية التي يمكن أن تؤثر على التعبير الجيني. أنماط التعبير مراسل الفلورسنت ينبغي بالتالي التحقق منها باستخدام بروتوكول منفصل الذي ينفذ خطوة التثبيت قبل إضافة تراكب أجار، كما هو موضح هنا.

  1. في اليوم من التثبيت، والعامل في غطاء دخان جيد التهوية، "الماصة؛" مثبت إعدادها في الخطوة 2 مباشرة إلى السطح أجار حول حافة المستعمرة، يسمح لها بالوصول إلى محيط المستعمرة دون غمر أنه. تنطبق فقط بكثير مثبت كما هو مطلوب بالكامل تحيط المستعمرة، حوالي 500 ميليلتر. تسمح مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها.
  2. وبمجرد مثبت قد تم استيعابها تماما في مستعمرة والمحيطة بها وسائل الإعلام، حوالي 20-30 دقيقة، واتحاد كرة القدم المتبقية لم تعد مرئية في اللوحة، كرر الخطوة 3.1. يسمح هذا مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها.
  3. وبمجرد مثبت قد تم استيعابها تماما في المستعمرة ووسائل الإعلام المحيطة كرر الخطوة 3.1، هذه المرة تطبيق مثبت على سطح المستعمرة مباشرة. يسمح هذا مثبت منتشر في المستعمرة واجار المحيطة بها، والشروع في الخطوة 4 فقط بعد كل شيء مثبت وقد تم استيعابها ولم تعد مرئية في اللوحة.

4-تتراكب المستعمرات مع أجار

  1. في يوم التثبيت، إعداد 10 غرام/لتر أجار الحل في المياه والاوتوكلاف لمدة 10-20 دقيقة لحل. بارد في حمام مائي ل 50 ˚C.
  2. بلطف من أجل 15 مل الحل أجار فوق المتوسطة النمو ومستعمرة. تسمح أجار تشكل جل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (الشكل 1B).
  3. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع تشاك مربعة، 3-طبقة مع مستعمرة مغلفة بين طبقتين أعلى. إذا كان إعداد عينات متعددة، تأكد من أن كل تشاك هو قطع بحجم مماثل.
  4. إزالة بلطف أجار الزائدة من تشاك المحتوية على مستعمرة.
  5. رفع الطبقات العليا اثنين من أجار (تحتوي على المستعمرة) بعيداً عن الطبقة السفلي من تشاك (الشكل 1)، ويت رئيس مسطح ملعقة في 1 x برنامج تلفزيوني أو المياه وإدراج بلطف بين الطبقات العليا والسفلي. وينبغي فصل مستعمرة مغلفة من الطبقة السفلي. احرص على عدم تشويه أو ثني مستعمرة مغلفة عند رفعه من قاعدته.

5-التثبيت

  1. العامل في غطاء دخان جيد التهوية، نقل على الفور مستعمرة مغلفة (أي تشاك 2-طبقة) في كاسيت تضمين (انظر الجدول للمواد)، المسمى بقلم تمييز مقاومة للمواد كيميائية. ضع الكاسيت التضمين في الإرسال شرائح زجاجية (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على مثبت أعد الخطوات 2.1-2.2. تأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء محاصرين داخل الكاسيت التضمين.
  2. احتضان العينة في مثبت بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

6-نموذج المعالجة: المخزن المؤقت يغسل الجفاف، والمقاصة، وتسلل

  1. بعد التثبيت بين عشية وضحاها، تغسل العينة مرتين في برنامج تلفزيوني 1 x لكل 1 ح. للحصول على أفضل النتائج، أتمتة كاشف التجانس وتدور باستخدام دالة معالج الأنسجة التلقائي (انظر الجدول للمواد) تعيين إلى إعداد منخفض. إذا كان المعالج لا متوفراً، يمكن تشغيل المعالجة يدوياً.
  2. اتبع الغسيل المخزن المؤقت بالجفاف من خلال سلسلة متدرجة من تخفيف الإيثانول (EtOH) في برنامج تلفزيوني 1 x (25%، 50%، 70%، 95%) 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. يذوي في يغسل ثلاث من 100% EtOH عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. مسح العينة المجففة في يغسل ثلاث من عامل البرتقالي المقاصة القائم على النفط 100% (انظر الجدول للمواد) على 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. ساخنة ارتشاح العينة تم مسحها مرتين مع البرافين المنصهر الشمع (انظر الجدول للمواد)، إلى 55˚C، لكل 2 ح.

7-عينة التضمين

  1. ملء قالب شمع شمع البارافين المنصهر يسخن إلى 55 ˚C. استخدام ملعقة ساخنة، شقة بسرعة نقل تشاك تسلل من الكاسيت التضمين في القالب الشمع، ضمان أن تشاك تقع موازية لقاعدة للعفن. تجنب الضغط المفرط على تشاك. قوالب الشمع قد يكون ثلاثي الأبعاد مخصص المطبوعة، أو هي متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
  2. السماح بالشمع على ترسيخ بين عشية وضحاها في 4 ˚C. قد يتم تخزين العينات مصبوب في الشمع الصلبة إلى أجل غير مسمى في 4 ˚C.
  3. مرة واحدة وقد وطدت الشمع، المكوس العينة من العفن وتقليم الشمع الزائد من حول العينة مع شفرة حلاقة. اترك الشمع الزائد تمتد من نهاية واحد من العينة، موازية للطائرة من تمزيقها، التي يمكن استخدامها المشبك إلى مبضع (انظر الجدول للمواد). كما ترك غمد سميكة الشمع، 1 ملم تقريبا، حول العينة وأوجهه على نحو سلس.

8-تقطيع

  1. الحرارة حمام مائي ل 42 ˚C. المشبك العينة إلى مبضع مع سطح المستعمرة الموجهة عمودياً إلى حافة النصل (انظر الجدول للمواد).
  2. تقليم العينة في فترات 50 ميكرون حتى تم التوصل إلى الطائرة المطلوب للمستعمرة، التي سيتم تجميع المقاطع.
  3. قص شريط للعدد المطلوب من 10 ميكرون سميكة الأقسام باستخدام مبضع تعيين سرعة تقطيع 75-80 لفة في الدقيقة وزاوية التخليص من 6-10˚. استخدام الرسام غرامة يميل إلى فصل الشريط من الشفرة.
  4. برفق باستخدام قطره من الماء على طرف ماصة باستور (يفضل) أو الملقط، نقل الشريط إلى حمام الماء. كن حذراً لتجنب فقاعات الهواء الملائمة تحت القسم.
  5. فورا إدراج شريحة في حوض ماء ووضعه أسفل الشريط بزاوية 45˚.
  6. اللمس على حافة ضيقة على الشريط إلى الشريحة، أسفل التسمية متجمد. ينبغي أن يتقيد الشريط.
  7. اسحب الشريحة خارج حوض ماء، ضبط الزاوية ليصبح عمودياً على سطح الماء، والسماح للشريط إلى وضع مسطح ضد الشريحة على طوله. تجنب محاصرة المياه الزائدة أسفل الشريط.
  8. بلطف تقف الشريحة على أنسجة خالية من الوبر ماصة، فتل المياه الزائدة من القسم.
  9. تخطيط الشريحة على منشفة ورقية، والسماح لها جاف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها في الظلام. ويمكن تخزين الشرائح إلى أجل غير مسمى في ˚C 4 في الظلام.

9--تحديد حرارة الإماهة وتصاعد

  1. الحرارة صفيحة الساخنة تعادل 45 ˚C. الحرارة الشريحة لمدة 30-60 دقيقة. سوف تصبح شبه المنصهر الشمع وتتسطح ضد الشريحة.
  2. رفع الشريحة من صفيحة برفق ووضع شقة على سطح ناعمة، تعادل، في درجة حرارة الغرفة، باستخدام الرعاية لضمان أن لا سحب الشمع المنصهر على جانبي الشريحة، حتى يتصلب الشمع (~ 1 دقيقة).
  3. استخدام الإرسال شرائح زجاجية، إزالة الشمع الشرائح في يغسل أربعة من مسح عامل لمدة 5 دقائق في كل منها باستخدام الشافطة [بشنر] إزالة الحل بين يغسل.
  4. يغسل الشرائح ثلاث مرات في 100% EtOH لمدة 1 دقيقة.
  5. ترطيب الشرائح في سلسلة متدرجة من الإيثانول في ترتيب عكسي لتجهيز (95% و 70%، 50% و 25%) لمدة 1 دقيقة ويعقب اثنين 1-مين يغسل في برنامج تلفزيوني 1 x.
  6. مباشرة تحميل المقاطع في وسط تصاعد مخزنة تريس (انظر الجدول للمواد)، وتنطبق ساترة، تجنب الأخذ بفقاعات الهواء. تسمح المتوسطة المتصاعدة بلمرة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  7. وبمجرد بلمرة، ختم ساترة للشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة. قد يتم تخزين الشرائح مختومة إلى أجل غير مسمى في الظلام في 4 ˚C.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينشئ هذا الأسلوب بيوفيلم رقيقة-الأقسام حيث يمكن تصويرها السمات المورفولوجية المميزة والمناطق للتعبير الجيني DIC والفحص المجهري fluorescence تيم. بينما DIC التصوير باستخدام 40 × الهدف الغمر النفط يمكن أن تكون كافية لإظهار بعض الخصائص المورفولوجية (الشكل 2E)، وقد وجدنا أن الأسفار يوفر الفحص المجهري سلالات هندسيا للبروتين الفلورسنت مؤثرا صريح المحسن التصور لتوزيع الخلايا ضمن العينة (الشكل 2D). صور مقاطع الفردية يمكن مخيط معا لإنشاء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عينات الأنسجة التضمين البارافين وتمزيقها رقيقة هو أسلوب النسيجي كلاسيكية التي يمكن تصوير هياكل المورفولوجية الدقيقة ويستخدم عادة على أنسجة حقيقية النواة، وقد طبقت بنجاح بعض العينات الجرثومية8 ،9. بينما كريومبيدينج يسمح للقوى الاحتفاظ بإشارة الذاتية وإيمونوفلوريسسينت، تضمين البارافين يفضل عموما حيث أنه يوفر أفضل الحفاظ على مورفولوجيا16. في التكيف مع هذا الأسلوب للتطبيق للأغشية الحيوية الميكروبية، ركزنا على الخصائص التي تنفرد بها نظامنا. مص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل NSF الوظيفي جائزة 1553023 وجائزة المعاهد الوطنية للصحة/نييد R01AI103369.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5 3/4 "ماصة باستورفيشر Scientific13-678-6Aتم شراؤها من المخازن الحيوية الجامعية   ؛
أجار تكنوفا A7777
شفاط Buchner (فراغ) قارورة Pyrex5340تم شراؤها من المخازن الحيوية الجامعية 
قلم الوسم المقاوم كيميائياVWR103051-182الشركة المصنعة: Leica
Clear Fingernail Polish تم شراء المتجر
الكونغو الأحمر مؤشردرجة VWRAAAB24310-14الصانع: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWREM-3340الشركة المصنعة: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w / DAPI)  فيشر ساينتفيك50 247 04الشركة المصنعة: علوم المجهر الإلكتروني
تضمين القالب  3D المطبوعة في المنزل
تضمين القالب (تجاري)  علوم المجهر الإلكتروني70182
الإيثانول 200PDecon Labs, Inc. 2701تم شراؤها من المخازن الحيوية الجامعية 
الفرشاةالدقيقة ، فرشاة الطلاء
أغطية زجاجية 60x22mmفيشر Scientific12-519-21C
بريد تجفيف الزجاج   ؛تيد بيلا2104320 بريد شرائح 
Histoclear-II ، عامل مقاصة زيت برتقالي   ؛فيشر ساینتفيك50 899 90150الشركة المصنعة: National Diagnostics 
Histosette, تضمين كاسيتفيشر Scientific15 182 701A
L-lysine hydrochloride فيشر ScientificBP386 100
شفرات ميكروتوم منخفضةالمستوى فيشر Scientific22 210 048الشركة المصنعة: Sturkey 
الماصة الدقيقة VWR89080-004
نصائح ماصة دقيقة انظر قسم التعليقاتانظر قسم التعليقاتص 10 (فيشر العلمي ، 02 707 469) ، ص 200 (VWR ، 89079-474) ، ص 1250 (VWR ، 89079-486)
Microtome  ؛فيشر Scientific905200U / 00016050الموديل: HM355S ، الشركة المصنعة: ميكروم ، غير كتالوج ، كتالوج البائع # 905200U / 00016050
الفورمالديهايد ، 37٪ مائي (فورمالين)ريكا كيميكالRSOF0010-500A
بارابلاست إكسترا (شمع البارافين)VWR15159-486الشركة المصنعة: ماكورميك العلمية   ؛
أطباق بتري مربعة 100x100x15mmمنتجات مختبرية يمكن التخلص منها D210-16
كلوريد البوتاسيوم EMD للكيماويات PX1405-1مكون من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، محضر داخليا   ؛
فوسفات البوتاسيوم فيشر ساينتفيكP380-500مكون من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، محضر داخليا   ؛
شفرات الحلاقة VWR55411-050تم شراؤها من المخازن الحيوية الجامعية   ؛
Slide Warmmer فيشر NC0865259 العلميغير كتالوج ، كتالوج البائع # 12857D
كلوريد الصوديوم   ;VWR0241-1KGمكون من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، محضر داخليا   ؛
فوسفات الصوديوم VWRBDH9296.500، مكون من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، محضر داخليا   ؛
الأنسجة فوق الصقيعية فيشر ساينتفيك12-544-2
حمام مائي تعويم الأنسجة فيشر NC0815797 العلميالصانع: تيد بيلا ، كتالوج البائع # 28156-B
معالج الأنسجة الأوتوماتيكي  فيشر Scientific813160U / Q # 00009061الموديل: STP120 معالج الأنسجة
Tryptone   ؛تكنوفا T9012
مستخلص الخميرةTeknova   ؛Y9010
تم شراء متجر ذات الرؤوس حزمة ترويجية شرائح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836(2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538(2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة