مقالة منهجية

محددة و "دقيقة كشف" spp. "الحمضيات تخضير الممرض" ليبيريباكتير Candidatus استخدام PCR التقليدية على "عينات الأنسجة أوراق الحمضيات"

DOI:

10.3791/57240

⸱

يونيو 29, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina, 2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, 3Department of Instructions and Teacher Education, University of South Carolina

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخضير الحمضيات مرض لا سيما مدمرة التي تؤثر على المحاصيل الحمضيات على الصعيد العالمي. المقدمة هنا هو طريقة بسيطة باستخدام PCR واستخراج الحمض النووي الجينومي أنسجة أوراق الحمضيات لتحديد مسببات المرض تخضير الحمضيات، Candidatus ليبيريباكتير spp. صحيحة ودقيقة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخضير الحمضيات، المعروف أيضا هوانجلونجبينج، مرض الحمضيات مدمرة يجتاح مزارع الحمضيات على الصعيد العالمي. يسبب هذا المرض فالفليورايد ليف أصفر غير متناظرة الوريد اصفرار وتساقط الأوراق، تسوس الجذر، وفي نهاية المطاف، موت النبات الحمضيات. عند إصابة، قد توقف نمو النباتات الحمضيات وإنتاج الزهور خارج الموسم. هذه الزهور نادراً ما تعطي ثمارها، وتلك التي تدر الحمضيات الصغيرة، والمريرة، وشكل غير منتظم على شكل غير مرغوب فيه. وينتشر هذا المرض بسيليد الحمضيات الآسيوية، سيتري ديافورينا، وتطعيم الأنسجة الحمضيات المصابة. مسببات المرض بفترة حضانة طويلة ومتغير داخل المصنع الحمضيات – أحياناً سنوات، قبل أن تظهر الأعراض. محاولات للثقافة هذا الممرض في المختبر لم تكلل بالنجاح، ربما بسبب الانخفاض وتركيز متفاوت من مسببات المرض داخل إصابة الأنسجة الحمضيات، أو لأنه من الصعب إجراء نسخ متماثل البيئية ظروف مواتية لنمو مسببات المرض. من الصعب جداً تحديد المرض قبل أن ينتشر، بسبب فترة الحضانة الطويلة وعدم قدرة الباحثين على ثقافة الممرض. نتيجة لذلك فقط يصبح المرض الظاهر بعد تدمير كامل الغلة مزارع الحمضيات فجأة. قدم هنا وسيلة للكشف عن مسببات المرض تخضير الحمضيات، Candidatus ليبيريباكتير spp. باستخدام أدوات استخراج الحمض النووي الجينومي وبكر دقيقة ومحددة. هذا الأسلوب بسيطة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف للتحليل الكمي. هذا الأسلوب يمكن تكييفها للاستخدام على أي أنسجة الحمضيات؛ ومع ذلك، يحتمل أن تكون محدودة بمقدار الممرض في الأنسجة. على الرغم من ذلك، هذا الأسلوب سوف تسمح لمزارعي الحمضيات على تحديد النباتات الحمضيات المصابة في وقت سابق، وكبح انتشار هذا المرض المدمر قبل فإنه يمكن زيادة انتشار.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخضير الحمضيات، يعرف أيضا باسم هوانجلونجبينج، تسببت في خسارة كبيرة من أشجار الحمضيات. حالة ممثلة واحدة هي ولاية فلوريدا، حيث المرض ومن المتوقع أن يسبب انخفاض بنسبة 70% في إنتاج مربعات فلوريدا البرتقال من مربعات 244 مليون في الموسم 1997-1998 إلى مربعات 70 مليون حتى موسم 2016-20171. ما يزيد على 90 في المائة أشجار الحمضيات في فلوريدا المصابة2، ويقدر أن صناعة الحمضيات في فلوريدا يفقد حوالي 1 بیلیون دولار أمريكي كل عام بسبب أمراض الحمضيات، حيث يلعب تخضير الحمضيات بدور رئيسي3. تخضير الحمضيات وينتشر أساسا عن طريق بسيليد الحمضيات الآسيوية الغازية سيتري ديافورينا، ولكن يمكن أيضا أن ينتشر بتطعيم الأنسجة المصابة. هذا المرض يسبب اصفرار عروق فالفليورايد ليف أصفر غير متناظرة، تساقط الأوراق قبل الأوان، وسقم غصين، تسوس الجذر والموت من المصنع. الأهم من ذلك، يتسبب المرض مصنع الحمضيات لإنتاج الزهور خارج الموسم، التي نادراً ما تنتج الفاكهة. الثمرة التي تنتجه مصانع الحمضيات المصابة غير ناضجة، والأخضر، ومريرة تذوق4.

والغرض من هذا الأسلوب هو دقة ودقة التعرف بكتيريا متحركة Candidatus ليبيريباكتير spp.، المسبّب تخضير الحمضيات، الذين يعيشون داخل لحاء أشجار الحمضيات المصابة5. يتم استخراج الحمض النووي من نبات كامل الأنسجة، والتي تحتوي على البكتيريا الحية. يتم استخدام هذا الحمض النووي المستخرج كقالب لبكر التقليدية، حيث تستخدم النوكليوتيد مكملة ل 16S المتاشب تسلسل هذه البكتيريا لتضخيم هذا التسلسل. وتستخدم كعنصر تضخيم داخلية النوكليوتيد مكملة لجين فب الحمضيات. لقد اخترنا لاستخدام هذا الأسلوب، لأنه قد ثبت نجاحها في البحوث السابقة6.

يحتوي هذا الأسلوب ميزة واضحة بسيطة وغير مكلفة نسبيا، وقادرة على القيام بها في أي مختبر الكيمياء الحيوية مجهز بشكل طبيعي. وبالإضافة إلى ذلك، يبقى PCR الأسلوب الأكثر دقة ودقيقة للكشف عن هذه العوامل الممرضة، نظراً لصعوبة استزراع هذا الممرض7، والممرض القدرة على البقاء على قيد الحياة وتتكاثر لسنوات داخل مضيف أعراض8. وقد استخدمت العديد من التخصصات المختلفة PCR فحوصات بنجاح الكشف عن مسببات هذا المرض؛ بيد أن بكر التقليدية لا تزال المقايسة أبسط للكشف دقيقة ومحددة، لا سيما داخل المضيفين أعراض8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-عزل الحمض النووي من الأنسجة النباتية باستخدام مجموعة أدوات استخراج الجينوم

  1. الحصول على أنسجة أوراق الحمضيات بقطع جديدة كل ورقة من شجرة الحمضيات باستخدام مقص نظيف، ووضع الورقة في كيس ساندويتش بلاستيكي نظيف.
    ملاحظة: يجب وضع الحقيبة التي تحتوي على أنسجة نبات في ثلاجة 4 درجة مئوية أو على الجليد في حاوية معزولة أقرب بعد جمع لتجنب التلف.
  2. إضافة كمية صغيرة من النيتروجين السائل لالبرد قذائف الهاون والمدقة. في حين أنها تقشعر لها اﻷبدان، استخدام مقص لقطع قطعة صغيرة من نسيج ليف، حوالي 1 بوصة مربعة في حجم. مكان قطع الأنسجة بقذائف الهاون لتجميدها على الفور. إضافة مزيد من النيتروجين السائل، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يجب أن تلبس قفازات معزول دائماً أثناء التعامل مع النتروجين السائل.
  3. بسرعة طحن الأنسجة النباتية إلى مسحوق ناعم باستخدام قذائف الهاون. يستمر طحن حتى يتبخر النيتروجين السائل تماما، ولا يزال أخضر مسحوق ناعم.
  4. بإيجاز البرد ملعقة معدنية في النتروجين السائل عن 10-15 ثانية، ثم حلج القطن النسيج الأرضي داخل الهاون في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، استخدام الملوق.
  5. إضافة 600 ميليلتر من "نويات تحلل الحل" باستخدام (انظر الجدول للمواد) 1000 ميليلتر "الماصة؛" ودوامه العينة s 1-3، ثم احتضانها في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. إضافة 3 ميليلتر من "حل رناسي" إلى ليستي باستخدام ماصة 10µL، عكس أنبوب 2-5 مرات مزجها، واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة مجلس الوزراء لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: السماح الخليط ليبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل المتابعة.
  7. إضافة 200 ميليلتر من "البروتين هطول الأمطار الحل"، دوامة في عالية السرعة عن 20 ثانية، ثم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 13,000 س ز لتشكيل بيليه راسخ. وبينما هو يجري تثفيل العينة، إضافة 600 ميليلتر من الايزوبروبانول درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة 1.5 مل.
  8. استخدام ماصة 1000 ميليلتر، بعناية إزالة المادة طافية من العينة سينتريفوجيد، نقلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 الطازجة التي تحتوي على الكحول. قد يتم الآن تجاهل بيليه.
    ملاحظة: تجنب تلويث المادة طافية مع البروتين بترك كمية ضئيلة من المادة طافية فوق بيليه.
  9. عكس الأنبوب حتى يصبح مرئياً ككتلة من الخيط تشبه خيوط الحمض النووي، ثم الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. صب المادة طافية، إضافة 600 ميليلتر من الإيثانول 70% لبيليه، وعكس الأنبوبة عدة مرات يغسل الحمض النووي، والطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  11. عناية نضح الإيثانول، تاركاً بيليه الحمض النووي فضفاضة، ثم فتح وعكس الأنبوب، يستريح على ورقة ماصة. الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  12. إضافة 100 ميليلتر من "الحمض النووي الإماهة الحل" إلى بيليه الحمض النووي المجففة، ثم احتضان الحمض النووي في حمام مائي 65 درجة مئوية ح 1، بينما خلط دورياً بالتنصت على الأنبوب.
  13. ضع 1 ميليلتر لتنقية المياه في ميكروكوفيتي، وأدخله في جهاز المطياف الضوئي لاستخدامه كقرص فارغ. حساب تركيز الحمض النووي الحالي بوضع 1 ميليلتر من العينة على ميكروكوفيتي، وإدراج جهاز المطياف الضوئي. ويمكن تركيز الحمض النووي (نانوغرام/ميليلتر) عامل تمييع المحسوب ك (260-320) × × 50 نانوغرام/ميليلتر.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين العينة في 4 درجات مئوية.

2-إجراء PCR على عينات الحمض النووي

  1. الجمع بين 10 ميليلتر 2 x PCR ماجستير المزيج (انظر الجدول للمواد)، 1 ميليلتر الأمام التمهيدي (10 م/ميليلتر)، 1 ميليلتر عكس التمهيدي (10 م/ميليلتر) (انظر الجدول 2 لمتواليات التمهيدي)، 100 نانوغرام من الحمض النووي المستخرج من العينة، وتنقية المياه (تصل إلى 20 ميليلتر الحجم النهائي) في 50 أنبوب بكر ميليلتر، ونفض الغبار لخلط، بإيجاز أجهزة الطرد المركزي.
  2. إدراج أنبوب بكر ثيرموسيكلير وتشغيل تبعاً لذلك (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. إذا لزم الأمر، تخزين العينة عند 4 درجة مئوية بعد الانتهاء من رد فعل.

3-اليكتروفوريسي تضخيم الحمض النووي في [اغروس] هلام

  1. وزن ز 0.4 [اغروس] مسحوق وإضافته جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت x TAE 1 إلى 200 مل نظيفة قارورة Erlenmeyer، ملء يصل إلى 50 مل.
  2. الموجات الصغرية عالية لمدة دقيقة 1.5، تهز كل 30 ثانية، حتى يذوب [اغروس] تماما.
    ملاحظة: يجب أن تلبس القفازات المعزولة أثناء التعامل مع سائل [اغروس] لمنع حروق.
  3. إضافة ميليلتر 2.5 10 ملغ/مل اثيديوم بروميد السائل [اغروس] ويهز لمزيج، ثم صب سائل [اغروس] هلام في جل مستوى العفن. إدراج كومز القياسية 12-الأسنان هلام بسرعة بعد سكب.
  4. السماح هلام بارد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة امشاط هلام، ووضع الجل في مربع مستوى جل مليئة بالمخزن المؤقت x TAE 1.
  5. استخدام ميكروبيبيتي، تحميل عينات الحمض النووي تضخيم مجموع الآبار. إضافة سلم 5 ميليلتر من الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) في بئر منفصلة من العينات الخاصة بك.
  6. اليكتروفوريسي العينات لمدة 35 دقيقة في ثابت 90 الخامس، ثم إزالة الجل ومكان في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية.
  7. تصوير وتحليل هلام النطاقات نمط أثناء استخدام تضوء الأشعة فوق البنفسجية في 302 نيوتن متر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نتيجة إيجابية تعطي فرقة مميزة المقابلة إلى 500 bp آسيوي Candidatus ليبيريباكتير، Las606/وظيفي6و/أو عصابة متميزة المقابلة إلى 700 شركة بريتيش بتروليوم ل Laa2/Laj5، إدراج في β ريبوسومال 16S مشغل9. كما يجب أن تظهر الفرقة الرقابة الداخلية التضخيم في 400 شركة بريتيش بتروليوم. هذه الفرقة تتوافق مع تضخيم الجين فب الحمضيات10، ويجب أن تظهر النتائج لأن تعتبر صالحة (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من الأهمية بمكان أن يتم اتباع جميع الخطوات بالضبط لتحقيق أفضل الظروف التجريبية. تم استخدام أنسجة نبات كامل خلال هذه التظاهرة؛ ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول نظرياً تضمين أي نوع من الأنسجة النباتية. سابقا، الباحثين استخراج الحمض النووي من نبات الوريد الأنسجة، بدلاً من أنسجة نبات كامل، وتحققت نتائج مماثلة11. في حال ظهور الفرقة المقابلة للجينات فب الحمضيات، النتيجة غير صحيح، وقد يكون هناك واحد أو أكثر من العديد من الأخطاء التقنية في إجراءات التشغيل. تتضمن الأخطاء الشائعة: استخدام المياه المل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشن هوان وإيان آرثر بالمر، وتشن جيان، تشانغ مينغ، ستيفن ل. تومسون، ليو فينجكوان وفو تشنغ تشينغ تعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وضع إطار مفاهيمي وم. ز. س. ف.؛ التحقيق وجيم حاء ج. ج. ز. س. و. الموارد، ف. س. ز.؛ كتابة-المشروع الأصلي، أولاً ألف ص؛ كتابة – المراجعة والتحرير، ص أولاً ألف وجيم ياء وجيم حاء، س. ل. ت. وز. س. ف.؛ التصور، وجيم حاء؛ الإشراف، ف. س. ز.؛ الحصول على التمويل، و س. ز. و. ل. س. ف.

مشروع يدعمه "ولاية كارولينا الجنوبية تحسين المعلم جودة التعليم العالي الدولة منحة" بعنوان وعمليات المعارف النباتية تعزيز الأوسط درجات العلوم للمعلمين، والهياكل والمهام من خلال المشاركة في "بحوث علوم النبات" (نبات العلوم)

الأموال التي تمنحها "المتحدة الولايات إدارة التعليم" (رقم كفدا 84.367B)

الكتاب أود أن أشكر الدكتور وانغ نيان من جامعة فلوريدا لتقديم عينات الحمض النووي الجينومي من إصابة فالنسيا سينينسيس الحمضيات .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تنقية الحمض النووي الجيني المعالجPromegaA1120مصدر تحلل النوى ، RNase ، ترسيب البروتين ، وحلول الجفاف
الحمض النووي منتجات الهواء النيتروجين السائلN / A
Mastercycler pro مع لوحة تحكمEppendorf6321000019
1250 واط ميكروويفباناسونيكN / A
5424 جهاز طرد مركزي أعلى الطاولةEppendorf05-403-93
Isotemp 215 حمام مائي رقميفيشر علمي15-462-15Q
ملعقة معدنيةسيجما ألدريتشZ283274
ملاط ومدقةسيجما ألدريتشZ247464
LSE خلاط دوامةكورنينج6775
2-بروبانولسيجما ألدريتشI9516
معقم 10 مو ؛ نصائح LTipOne1161-3730
معقمة 200 مو ؛ نصائح LTipOne1163-1730
معقمة 1250 مو ؛ نصائح LTipOne1161-1750
طقم ماصات متغير الحجمVWR75788-460
بروميد الإيثيديومسيجما ألدريتشE1510
AgaroseIBIScientific IB70041
EDTAThermo Fisher Scientific17892
حمض الخليكفيشر كيميائيA38-212
قاعدة تريسسيجما ألدريتش10708976001
& كوفيتEppendorf6138000018
صينية صب قابلة للتكديس وأمشاطكارولينا213655
PowerPac امدادات الطاقة الأساسيةBio-Rad1645050
Mini-Sub Cell GT SystemBio-Rad1704487EDU
مقياس الطيف الحيوي الأساسيEppendorf6135000009
0.2 مل أنابيب PCRفيشر العلميةAB-0620
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيThermo Fisher Scientific3439
2X Taq Green PCR Master MixPromegaM7122
ForwardPrimer Thermo Fisher ScientificN / A
Reverse PrimerThermo Fisher ScientificN / A
Water ، PCR الصفSigma-Aldrich3315953001
جل دوك XR +Bio-Rad1708195
1 كيلو بايت + سلم الحمض النوويثيرمو فيشر العلمي10787018
الدقيقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
  4. UICEP. Pathology. , (2013).
  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
  6. Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
  7. Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
  8. Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
  9. Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
  10. Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263(2012).
  11. Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة