هذا البروتوكول يتيح للقارئ لتحليل تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية باستخدام نهج متعدد الأوجه لالتقاط الطابع الدينامي للأغشية الحيوية البكتيرية بتقييم التقيد بتشكيل المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر، والتشتت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية: تقنيات لتحديد وتقدير حجم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية ومتعددة المراحل التي تحدث في البكتيريا تحت ظروف بيئية قاسية أو أوقات الشدة. لمسببات الأمراض المعوية، هو فعل استجابة كبيرة من إجهاد أثناء العبور الجهاز الهضمي وعند التعرض الصفراء، عنصرا عادياً من الهضم البشرية. للتغلب على آثار جراثيم الصفراء، تشكل العديد من مسببات الأمراض المعوية بيوفيلم العينة للسماح بالبقاء على قيد الحياة عندما تمر عبر الأمعاء. وهنا يقدم منهجيات تحديد تشكيل بيوفيلم عن طريق فحوصات الالتزام المرحلة الصلبة، فضلا عن كشف المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر (EPS) والتصور. وعلاوة على ذلك، يرد بيوفيلم تشتت التقييم لتقليد تحليل الأحداث التي تسبب إطلاق سراح بكتيريا أثناء عملية العدوى. صبغة الكريستال البنفسجي يستخدم للكشف عن البكتيريا ملتصقة في مقايسة التزام الفائق 96-جيدا لوحة. تقييم إنتاج EPS يتحدد بفحوصات اثنين، هما مجهرية تلطيخ مصفوفة EPS وتحليل شبه كمي مع يكتين ملزمة السكاريد مترافق فلوريسسينتلي. وأخيراً، وتشتت بيوفيلم يقاس من خلال التهم مستعمرة والطلاء. بيانات إيجابية من فحوصات متعددة دعم توصيف الأغشية الحيوية، ويمكن أن تستخدم لتحديد تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في السلالات البكتيرية الأخرى.
المقدمة
تشكيل بيوفيلم استراتيجية بقاء بكتيرية هامة التي يسببها خلال الظروف البيئية القاسية. التعرض لمركبات جراثيم مثل المضادات الحيوية أو التغييرات في المغذيات أو توافر الأوكسجين يدفع دولة أكد في البكتيريا التي يمكن تخفيفها من خلال تشكيل بيوفيلم. بيوفيلم يتسم بمرفق البكتيرية إلى سطح أو غيرها البكتيريا ومصحوبا بإفراز مصفوفة EPS تتألف أساسا من السكريات1،،من23. تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية الذي يتوج سلسلة أحداث في تشكيل مجتمع ناضج بكتيرية ملتصقة1،2،3. البكتيريا تنتج أدهيسينس لتيسير مرفق المبك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد الكواشف
- الأملاح الصفراء المتوسطة: إعداد مرق الصويا تريبتيك (TSB) التي تحتوي على أملاح الصفراوية 0.4% (الوزن/الحجم)، ريسوسبيند 200 ملغ أملاح الصفراوية في 50 مل TSB يعقم. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل متوسطة جديدة أسبوعيا.
الملاحظات: أملاح الصفراء التي تستخدم بشكل روتيني خليط 1:1 كوليت الصوديوم والصوديوم ديوكسيتشولاتي معزولة عن جالبلاديرس الأغنام والأبقار. كما هو موضح سابقا4، كان وجود الجلوكوز المطلوب لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية. وقد أضيف TSB الجلوكوز بالنسبة مرق لوريا بيرتاني (رطل)؛ ولذلك ليس كافياً للحث على تشكيل بيوفيلم دوسنتاريا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى تحليلها. قد يلزم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في الشكل 1، هو فعل تشكيل بيوفيلم في معظم نمو مسببات الأمراض المعوية ستة التالية تم اختبارها في الوسائط التي تحتوي على أملاح الصفراء. زيادة كبيرة في البكتيريا ملتصقة بعد أن لوحظ أن التعرض لأملاح الصفراء في ما يقرب من جميع سلالات اختبارها. والاستثناء انتيرواجريجاتيفي كولاي (الجماعة)؛ بيد الملاحظة المستحث متحولةالمنتدى الآسيوي 4Δ. وتشير النتائج إلى أن آليات الانضمام الإضافية هي الناجمة عن التعرض لأملاح الصفراء .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحليل تكوين بيوفيلم يشكل تحديا نظراً للطابع الدينامي للأغشية الحيوية والتباين بين السلالات، والمواد والمختبرات وفحوصات. هنا، يتم عرض عدة استراتيجيات لتحديد تكوين بيوفيلم في مسببات الأمراض المعوية عقب التعرض لأملاح الصفراوية مع البصيرة التجريبية المقدمة لتعزيز إمكانية تكرار نتائج. هناك اعتبارات إضافية لضمان إمكانية تكرار نتائج. أولاً وقبل كل شيء، نوصي بإجراء مستقل على الأقل ثلاث تجارب مع تريبليكاتيس التقنية لتأكيد الملاحظات ودلالة إحصائية بسبب التباين الذي يمكن أن يحدث كل. ثانيا، استخدام عناصر إيجابية وسلبية أمر حيوي لضما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا الكشف.
شكر وتقدير
ونحن نشكر راشيل باء كنين واليخاندرو يانوس-شيا للمساعدة التقنية. ونحن نشكر أنطوني ت. مورلي، هيرلي ص بريان، اليسيو Fasano، سويركزيوسكي هاء بريت وشيريل بوبي للسلالات المستخدمة في هذه الدراسة. كان يدعمها هذا العمل "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية منحة K22AI104755 (C.S.F.). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرق الصويا الترابتي | سيجما ألدريتش | 22092-500 جرام | |
| كريستال بنفسجي | سيجما | C6158-50 | |
| كونكانافالين - إيه فيتك | سيجما | C7642-10 ملغ | |
| جلوكوز | سيجما | G7021-1 كجم | |
| أملاح صفراوية | سيجما | B8756-100G | |
| رطل أجار | سيجما | L7533-1KG | |
| أنابيب استزراع 14 مل ، 17 × 100 مم ، بلاستيك ، معقم | فيشر | 14-959-11B | |
| Vectashield المضاد للبهتان الصلب مع | مختبرات ناقلات | H-1500 | |
| الفورمالديهايد | سيجما-ألدريتش | F1635-500 | |
| غلوتيراالديهايد | سيجما-ألدريتش | G6257 | |
| ألواح 96 بئر مسطحة القاع (شفافة) | TPP | 92696 | |
| ألواح مسطحة القاع 96 بئرا (أسود) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| ألواح مسطحة القاع 24 بئرا (شفافة) | TPP | 92424 | |
| أغطية زجاجية 12 مم ، مستديرة | فيشر | 08-774-383 | |
| قارئ لوحة 96 بئر | Spectramax | ||
| قارئ لوحة فلورسنت | Biotek Synergy 2 | ||
| متحد البؤر أو الفلورسنت مجهر | نيكون A1 مجهر | ||
| البؤر 37 درجة ؛ C حاضنة الاهتزاز | نيو برونزويك Scientific Excella E25 | ||
| 37 درجة ؛ حاضنة الألواح C | سلسلة Thermolyne 5000 |
المراجع
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
