نقدم هنا بروتوكولا لعزل خلايا البنكرياس جزيرة الماوس لفحص عروض توضيحية روس قبل xenobiotics بغية تحديد المواد الكيميائية إكسينوبيوتيك ديابيتوجينيك المحتملة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
لفحص يستند إلى الخلية جزيرة البنكرياس مورين للمواد الكيميائية البيئية ديابيتوجينيك
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم العثور على التعرض لبعض المواد الكيميائية البيئية في الإنسان والحيوان تسبب الأضرار الخلوية للخلايا β البنكرياس مما يؤدي إلى تطوير نوع 2 السكري (T2DM). على الرغم من أن آليات تلف الخلايا β الناجمة عن المواد الكيميائية غير واضح ومن المرجح أن تكون معقدة، إحدى النتائج المتكررة هي أن هذه المواد الكيميائية تحدث الأكسدة مما يؤدي إلى توليد الأنواع الأكسجين التفاعلية المفرط (روس) الذي حمل الأضرار التي لحقت خلية بيتا. لتحديد المواد الكيميائية البيئية المحتملة ديابيتوجينيك، نحن معزولة خلايا البنكرياس جزيرة ليلى من الفئران C57BL/6 وجزيرة مثقف الخلايا في خلية 96-جيدا لوحات الثقافة؛ ثم، كانت جرعتي الخلايا جزيرة ليلى مع المواد الكيميائية وتم الكشف عن توليد روس قبل 2 '7'-ديتشلوروفلوريسسين (دكفه-دا) صبغة الفلورسنت. باستخدام هذا الأسلوب، وجدت أن bisphenol A (BPA)، بنزو [أ] بيرين (BaP)، وثنائي الفينيل متعدد الكلور (PCBs)، يمكن أن تحفز مستويات عالية من روس، مما يوحي بأنها يحتمل أن تكون قد الحث على الأضرار في الخلايا من جزيرة ليلى. ينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيداً لفحص ديابيتوجينيك xenobiotics. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون الخلايا المستزرعة جزيرة ليلى أيضا تكييف للتحليل في المختبر للسمية الناجمة عن المواد الكيميائية في خلايا البنكرياس.
المقدمة
أصبحت الزيادة في انتشار T2DM أزمة صحية عالمية في السنوات الأخيرة، مما يشكل تهديدا خطيرا للصحة العامة1. تم العثور على العديد من العوامل ارتباطاً سببياً تنمية T2DM، بينها، توحي النتائج المتكررة أن نقطة تلاقي مشتركة واحدة من هذه العوامل هو تنظيم دورات تعريفية للأكسدة مما يؤدي إلى توليد المفرط روس2 , 3.
تم العثور على مجموعة واسعة من المواد الكيميائية البيئية بما في ذلك ثنائي الفينيل متعدد الكلور والديوكسين و BaP للحث على الأكسدة، مما قد يضعف وظيفة خلايا بيتا في البنكرياس وتؤدي إلى مقاومة الأنسولين و T2DM4. على الرغم من أن مستوى الفسيولوجية روس دوراً هاما في الوظائف الخلوية، التعرض لروس الذي يتجاوز قدرة المنظومة المضادة للأكسدة ينتج الضرر لخلايا/الأنسجة ويؤدي إلى الأمراض5. الخلايا β البنكرياس التعبير عن مستوى منخفض من الإنزيمات المضادة للأكسدة، وهكذا هي هدف حساسة لأن الضرر عنصر مؤكسد الإجهاد بوساطة6،7. التعرض المزمن لمستويات عالية من روس قد ثبت أن تسبب الخلل في خلايا البنكرياس الناجمة عن الإجهاد5 فضلا عن مقاومة الأنسولين في الكبد والأنسجة الدهنية8.
الهدف العام لهذا المشروع تطوير تحليل يستند إلى الخلية للمواد الكيميائية الشاشة لإمكاناتها ديابيتوجينيك تستند على تحريض روس في خلايا البنكرياس. يفتقر إلى إزالة السموم الأيضية البنكرياس وهو هدف حساسة للأضرار التي يسببها إكسينوبيوتيك6،7. هذا التحليل بقياس روس المتولدة في الخلايا البنكرياس مباشرة، ولذلك ينبغي أن تقدم تقريب مباشرة من الضرر الناجم عن المواد الكيميائية في البنكرياس. لتطوير هذا الأسلوب، ونحن معزولة جزيرات البنكرياس الماوس ومثقف جزيرة معزولة تحت شرط الثقافة الخلية مع المواد الكيميائية وتستخدم الجيل روس الناجمة عن المواد الكيميائية كقراءات. ويتم هذا الإجراء البسيط والفعال في تحديد المواد الكيميائية الذي يحفز روس في جزيرة معزولة؛ فإنه يمكن تطوير لتحقيق آليات السمية الخاصة بالبنكرياس في المختبر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أعدم جميع التجارب على الحيوانات امتثالا لجميع المبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح والوكالات التنظيمية. وأجرى في بروتوكول يتم شرحها تحت التوجيه والموافقة على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) من تكساس أية آند أم معهد "الطب الجينومي".
1-حل إعداد
- تمييع حل هانك x 10 للملح متوازن إلى س 1 مع مزدوجة المقطر ح2س، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد الحل العزلة عن طريق إضافة هيبيس (10 ملم)، مجكل2 (1 ملم)، والسكر (5 ملم). ضبط ال pH إلى 7.4 والحفاظ على الجليد.
- إعداد الحل كولاجيناز من كولاجيناز نوع 4.
ملاحظة: على وجه التحديد، كولاجيناز 4 نوع يحتوي على 160 ش كل مغ وزن الجاف. ز 1 من 4 نوع كولاجيناز هو المخفف في 5 مل مزدوجة المقطر ح2س بتركيز من 200 مغ/مل. 2 مل كولاجيناز المخفف يضاف إلى 30 مل الجليد الباردة من العزلة الحل، ويتم نقل 6 مل من محلول كولاجيناز إلى أنبوب 50 مل لكل الماوس. - إعداد الحل أغسل بإضافة 1 مم كاكل2 إلى الحل العزلة.
- إعداد الحل تنقية مع الحل دياتريزواتي بوليسوكروسي الباردة/الصوديوم (1.1119 غ/مل، 5 مل).
- إعداد 500 مل من جزيرة الثقافة المتوسطة عن طريق إضافة لام الجلوتامين (20 ملم) والبنسلين (100 U/mL)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) ومصل الدم البقري الجنين (FBS) (10%) في المتوسط ربمي.
- إعداد الحل دا دكفه الأسهم بتذويب المسحوق في ماء مقطر في 200 ميكرومتر ومخزن في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: روس تلطيخ الحل هو طازجة بتمييع الحل دا دكفه الأسهم إلى التركيز النهائي من 5 ميكرومتر في ربمي. وينبغي حماية هذا الكاشف من الضوء.
2-العمليات الجراحية التحضير
- حقن إينترابيريتونيلي (القائمة) ماوس مع أفيرتين (2.5% أفيرتين، 0.4 مل/20 g). بعد الماوس يتم تخديره كلياً ولم يعد يستجيب لهند القدم القرصات، euthanize الماوس ونقل إلى هود البيولوجية.
- ضع الماوس euthanized مع الجانب البطن مواجهة والرش الجلد مع الإيثانول 70% للتعقيم.
- فتح تجويف البطن مع يو-شق 1 سم على الجزء العلوي من البطن، وسحب الجلد في اتجاه روسترال على صدره لفضح تجويف البطن.
3-البنكرياس نضح وإزالة
- كما هو موضح في الشكل 1، ابحث عن موقع ampulla. استخدام زوج من منحنى ملقط المشبك العفج القرب من موقف المصرة العاصرة. استخدام زوج آخر من منحنى ملقط المشبك الجدار العفج إعاقة مسار الصفراوية في العفج.
ملاحظة: لم تم إدراج في ampulla في هذه الخطوة. هذه الخطوة تهدف إلى عرقلة مسار الصفراوية في العفج. - تغيير موضع الماوس مع الرأس الدانية والقدمين القاصي فيما يتعلق بالباحث.
- العثور على القناة الصفراوية المشتركة وحقن 3 مل من محلول كولاجيناز ببطء بحقنه إبرة ومل 5 ز 30. تأكد من القناة الصفراوية المشتركة والبنكرياس مبالغ فيها بعد الحقن.
- إزالة البنكرياس منتفخة باستخدام منحنى ملقط ومقص غرامة فصل تنازلي القولون والأمعاء والمعدة والطحال. ضع البنكرياس في أنبوب 50 مل يحتوي على 3 مل من محلول كولاجيناز وإبقائه على الجليد.
4-البنكرياس الهضم
- ضع كل أنبوب 50 مل في حمام مائي 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 15-20 دقيقة (يتباين الوقت مع السلالة والعمر من الفئران).
- يهتز الأنبوبة باستخدام دوامة.
- تجمع 4-5 البنكرياس هضمها في مصفاة كبيرة بالوعة عقيمة واستخدم المجرفة جعل البنكرياس ينهار تماما. استخدام ز 23 إبرة و 10 مل حقنه تحتوي على الحل أغسل بقوة "الماصة؛" الخلايا الهضم خارج الشاشة. جمع الحل أغسل في أنبوب 50 مل.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 97 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وصب المادة طافية.
- إضافة 25 مل من محلول الغسيل للأنابيب وإعادة تعليق الأنسجة التي فورتيكسينج لطيف. وتدور أسفل الأنسجة في 97 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة صب المادة طافية. كرر 3 مرات. احرص على عدم إزاحة الأنسجة الأعلاف.
5-تنقية للجزر الصغيرة
- إضافة 10 مل من محلول تنقية لبيليه الأنسجة غسلها وريسوسبيند برفق المحتويات.
- تراكب 5 مل من محلول العزلة على الحل تنقية بلطف. كن حذراً للحفاظ على واجهة سائل حاد بين الحلين.
- الطرد المركزي الأنبوب في 560 × ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع تسارع بطيء ولا الفرامل. إدراج الماصة في الواجهة وجمع طبقة الجزر الصغيرة في أنابيب 50 مل جديدة.
- أغسل الجزر الصغيرة كما هو موضح في الخطوة 3، 5.
6-طلاء ومعاملة الخلايا جزيرة ليلى
- ريسوسبيند الجزر الصغيرة في 10 مل من محلول الثقافة الجزيرات ولطف مزيج جيد ومكان 100 ميليلتر/جيدا مع ماصة متعددة القنوات لصفيحة 96-جيدا. ضع حوالي 5 الجزيرات الواحدة 96 جيدا.
- ضع اللوحة في الحاضنة زراعة الأنسجة ح 12.
- الطرد المركزي (112 س ز) لوحة 96-جيدا وإزالة الثقافة المتوسطة.
- تمييع المواد الكيميائية البيئية في الأجلين المتوسط وثقافة الجزر الصغيرة. إضافة 100 ميليلتر من كل من منظفة الكيميائية في آبار منفصلة من اللوحة. ريسوسبيند الجزر الصغيرة في كل بئر واحتضانها ح 12 في 37 درجة مئوية (يتغير التركيز المواد الكيميائية البيئية المختلفة).
7-روس تلطيخ والقياس
- بعد العلاج الجزر الصغيرة، وتغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x (200 ميليلتر لكل بئر-96).
ملاحظة: تركيز المواد الكيميائية على النحو التالي: AFB1: 3 ميكرومتر، والاترازين: 100 ميكرومتر، BaP: 10 ميكرومتر، منهاج عمل بيجين: 100 ميكرومتر، β-الإستروجين، PCB126: 10 ميكرون، وايثوكسيلات، ومنهاج عمل بيجين: 100 ميكرومتر. - استخدام ن-أسيتيل سيستين (NAC) كمضاد للأكسدة لإخماد روس. إضافة 5 مم الائتلاف إلى منظفة الكيميائية الناجمة عن روس واحتضانها ح 12 عند 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي لوحة 96-جيدا في ز 112 x واحتضان مع 5 ميكرومتر الحل المسبار الفلورسنت (H2--دكفه--دا حله في وسائط الإعلام ربمي) عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- تغسل الخلايا المعالجة جزيرة ليلى 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وقياس الأسفار مع قارئ ميكروسكوبية في 488 نانومتر.
ملاحظة: ويمكن قياس تراكم المخصوم في الخلايا بزيادة في الأسفار في 530 نيوتن متر عند العينة هو متحمس في 488 نانومتر. - تنفيذ المقايسة إفراز (نظام خدمات التأمين الحكومية) حفز الجلوكوز الأنسولين9 على إكسينوبيوتيك الذي يحفز روس تعامل الجزر والجزر الصغيرة غير المعالجة لقياس آثار إكسينوبيوتيك على الوظيفة الفسيولوجية جزيرات البنكرياس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد صورة مجهرية من جزيرة معزولة صحية في الشكل 2، التي يكون للجزر الصغيرة مستديرة أو بيضاوية شكل مع الزي الحجم نسبيا (على الرغم من أن حجم التوحيد يمكن أن تختلف من سلالة إلى سلالة). نحن التحقيق التالية وظائف البنكرياس جزيرة ليلى في فحص في المختبر بعزل جزيرة ليلى وحفز إفراز الأنسولين في الجزيرات الثقافة. ويبين الشكل 3 تحليلنا نموذجية لفحص نظام خدمات التأمين الحكومية من الجزيرات الماوس معزولة C57BL/6 الناجم عن الجلوكوز 3.3 ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تتراكم الأدلة تشير إلى أن التعرض للمواد الكيميائية البيئية دوراً هاما في تنمية T2DM. اعترف روس المستحثة xenobiotics عاملاً مسببا محتملة المساهمة في تنمية T2DM. ويتعرض البشر لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية إكسينوبيوتيك وهناك حاجة كبيرة لتقنيات البحث رواية لتحديد فعالية سميات البنكرياس والتحقيق إليه السمية الخاصة بخلايا البنكرياس.
في هذه الدراسة، استناداً إلى إجراءات نشر14، قمنا بتطوير بروتوكول لعزل جزيرات البنكرياس من الماوس والشاشة في الخلايا التي تحتوي على المواد ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل بمنحه مشروع تجريبي من مركز كريه برعاية نييهس ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (رقم 31572626).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 وأقات. هانك محلول ملح متوازن | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| محلول بولي السكروز / دياتريزوات الصوديوم | سيجما | 10771 | |
| 2',7'-ثنائي كلورو فلورسين (DCFH-DA) | سيجما | D6883-50MG | |
| قارئ الألواح الدقيقة الفلورية | بيوتيك | ||
| إل جلوتامين | سيجما | G8540-25G | |
| ستربتومايسين | جيبكو | 15140148 | |
| FBS | جيبكو | 26140079 | |
| RPMI 1640 | جيبكو | 11875-085 | |
| أفرتين | سيجما | T48402-25G | |
| جرذ / فأر أنسولين ELISA Kit | ميليبور | EZRMI-13K | |
| جهاز الطرد المركزي | Sorval | Sorval RT7 | لجهاز الطرد المركزي ذو 96 بئر |
| الألواح الدقيقة قارئ | Biotek | Epoch 2 | لقراءة التألق |
المراجع
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival? Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538(2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
