Method Article

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن إظهار عملية إنشاء خط جهد كهربائي خلوية الزرد مراسل لتصور التنمية الجنينية، والحركة، والأسماك ورم الخلايا في الجسم الحي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنوعها والإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية، تلعب أدواراً هامة في إشارات العمليات منفعل من الخلايا العصبية والعضلات والعديد من العمليات البيولوجية الأخرى، مثل الجنينية الزخرفة التنموية. ومع ذلك، هناك حاجة لرصد النشاط الكهربائي في فيفو في embryogenesis الفقاريات. التقدم المحرز مؤشرات الجهد الفلورسنت المشفرة جينياً (جيفيس) مكنت لتوفير حل لمواجهة هذا التحدي. هنا، نحن تصف كيفية إنشاء الزرد مؤشر جهد المحورة وراثيا استخدام مؤشر الجهد المعمول، ASAP1 (تسارع جهاز استشعار لإمكانات العمل 1)، على سبيل مثال. يو بي أي، اختيرت كيت Tol2 ومروج الزرد في كل مكان، في هذه الدراسة. ونحن أيضا شرح عمليات استنساخ بوابة الموقع، Tol2 الزرد المستندة إلى ينقول ترانسجينيسيس، وعملية التصوير للأورام الأجنة والأسماك الأسماك في مرحلة مبكرة باستخدام المجاهر العادية ابيفلوريسسينت. استخدام هذا الخط الأسماك، وجدنا أن هناك تغيرات الجهد الكهربائي الخلوية أثناء embryogenesis الزرد، وحركة الأسماك اليرقات. وعلاوة على ذلك، فقد لوحظ أن ورم الخلايا كانت عموما الاستقطاب في أورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة الزرد قليلة، مقارنة بالانسجة الطبيعية المحيطة بها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشير تستخرجها للإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية1. تبادل أيونى عبر الغشاء الخلوي، وإلى جانب التغييرات الحالية والمحتملة الكهربائية، ضرورية لإشارات عمليات خلايا العصبية والعضلات منفعل. وباﻹضافة إلى ذلك، تستخرجها والتدرجات وأيون لها مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية الهامة الأخرى بما في ذلك تخزين الطاقة والنقل المستقلب والحيوي،. إشارات bioelectrical اكتشفت أيضا كمنظم لتشكيل نمط الجنينية، مثل هيئة المحاور، ودورة الخلية، والخلية التمايز1. وبالتالي، من الأهمية بمكان لفهم العديد من الأمراض الخلقية البشرية التي تنجم عن سوء تنظيم هذا النوع من الإشارات. على الرغم من أن المشبك التصحي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد يسكن في منشأة حيوان الموافقة على آآلاك، وجميع التجارب التي أجريت وفقا للبروتوكولات المعتمدة "رعاية الحيوان بوردو" واستخدام اللجنة (باكوك).

1-Tol2 ينقول بلازميد بناء إعداد

ملاحظة: Tol2، ينقول التي تم اكتشافها في أسماك الميداكا، على نطاق واسع استخدمت في البحوث الزرد المجتمع8،9. أنه تم بنجاح اعتمدت على بوابة الموقع جزئ استنساخ النظام القائم والمعروفة باسم مجموعة Tol210. كيت Tol2 يسمح بطريقة أكثر ملائمة لإنشاء بنيات التعبير مخصصة، بينما أيضا زيادة كفاءة ترانسجينيسيس. وهكذا، كان قرارا سهلاً الاستفادة من هذا النظام، وإنشاء خط الزرد ت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حقن ناجحة، أكثر من أجنة الأسماك 50% حقن سيتم عرض بعض درجة الفلورية الخضراء في الخلايا الجسمية، ومعظمها سيكون إيجابيا بمقايسة المكوس ينقول Tol2 (الشكل 2). بعد خارج عبر الأجيال 2-4 مع الأسماك wildtype (حتى الأسماك الفلورية تصل إلى 50 في المائة ونسبة مندلية المتوقعة)، والأسماك المحورة وراثيا استخدمت لتجربة التصوير لتعقب إمكانات غشاء الخلية أثناء التطور الجنيني. أولاً، تم فحص التغيرات المحتملة غشاء طوال دورة الخلية أثناء مراحل النمو الجنيني المبكر الزرد. ولوحظ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن تم اكتشاف الخلايا والأنسجة ومستوى الأنشطة الكهربائية أثناء التطور الجنيني والأمراض البشرية منذ زمن طويل، في فيفو الكهربائية التغيرات الدينامية ودورها البيولوجي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. أحد التحديات الرئيسية هو تصور وتحديد التغييرات الكهربائية. التكنولوجيا المشبك التصحيح كسر عبر لتتبع الخلايا المفردة، ولكن يقتصر تطبيقه على أجنة الفقاريات لأنها تتكون من العديد من الخلايا. الأصباغ الكيميائية الجهد الحالي أيضا ليست مثالية بسبب الحساسيات، وخصائصها، والسمية. الجهود التي بذلت مؤخرا في اختراع جيفي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد أعمال البحث التي ذكرت في هذا المنشور بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم R35GM124913 وبرنامج الحوافز PI4D جامعة بوردو، والتنافسية الداخلية PVM برنامج صناديق الأبحاث الأساسية. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لعملاء التمويل. ونحن نشكر كويشي كاواكامي لبناء Tol2، مايكل لين لبناء ASAP1، وتشييد زون ليونارد للمروج يو بي أي عن طريق أدجيني.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب زراعة الخلايا سعة 14 ملVWR60818-725ثقافة الإشريكية القولونية
خزان الرحلان الكهربائي الاغاروزالبومةالحرارية B2الرحلان الكهربائي للحمض النووي
Agarose RAAmrescoN605-500Gلصنع المواد الهلامية للحقن
Attb1-ASAP1-F التمهيديIDT DNAGGGGACAAGTTTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		تضخيم منطقة الترميز ASAP1 للاستنساخ الفرعي
Attb2-ASAP1-R التمهيديIDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTTCTGAAGCCA		ASAP1 تضخيم منطقة الترميز للاستنساخ
الفرعي نطاق تشريح المجالالساطع نيكونSMZ 745Dechorionation ، الحقن المجهري ، تركيب
الكاميرا الملونةZeissAxioCam MRcجنين الأسماك تسجيل الصورة
الشريحة المقعرةVWR48336-001لحمل أجنة الأسماك أثناء عملية التصوير
ماصة نقل يمكن التخلص منها 3.4 ملThermo Scientific13-711-9AMأجنة الأسماك ونقل
المياه إنزيم نوكلياز داخلي ، وليس أناNEBR0189Lلخطية الحمض النووي البلازميد
نطاق مركبZeissAxio Imager.A2Fish تصوير الأجنة
نطاق تشريح ستيريو epifuorescentZeissStereo Discovery.V12تصوير أجنة الأسماك
مصدر ضوء الفلورسنتديناميكيات التجويفX-cite seris 120مصدر الضوء للمجاهر الفلورية
ملقط # 5WPI500342Dechorionation وكسر الإبرة
Gateway BP Clonase II مزيج الإنزيمThermo Scientific11789020بوابة BP إعادة التركيب استنساخ
بوابة LR Clonase II Plus إنزيمThermo Scientific12538120Gateway LR إعادة التركيب
هلام استعادة الحمض النوويكيت Zymo ResearchD4002تنقية هلام الحمض النووي
التحميلEppendorf930001007لتحميل محلول الحقن في الإبر الكابيلاري
ميثيل السليلوز (1600cPs)Alfa Aesar43146تصاعد جنين السمك
الميثيلين الأزرقSigma-AldrichM9140يقمع تفشي الفطريات في أطباق بتري
قالب الحقن الدقيقأدوات العلوم التكيفيةTU-1لتحضير صينية قالب agaorse لحمل أجنة الأسماك أثناء الحقن
الحاقن الدقيقWPIPicopump الهوائي PV820حاقن الحقن
الدقيق مناورMicro WPIحاقن دقيق MM3301Rعملية الحقن الدقيق
مجتذب الماصاتالدقيقة أداة SutterP-1000لتحضير إبرة شعرية
زيت معدنيAmrescoJ217-500mlلمعايرة حجم الحقن
mMESSAGE mMACHINE SP6 طقم النسخالحراري العلميAM1340mRNA في النسخ المختبري
كاميرا أحادية اللونZeissAxioCam MRmتسجيل صورة جنين الأسماك
مجموعة البلازميد MiniprepKit Zymo ResearchD4020تحضير كمية صغيرة من أطباق بلازميد الحمض النووي
البلاستيكيةVWR25384-088لحمل أجنة الأسماك أو الأسماك أثناء عملية
التصوير الحمض النووي الريبي نظيف & المكثف -5Zymo ResearchR1015تنظيف mRNA بعد النسخ في المختبر
مقياس الطيفالحراري العلميNanoDrop 2000لقياس تركيزات الحمض النووي والحمض النووي الريبي
المرحلة ميكرومترAm نطاقMR100معايرة حجم الحقن
الدقيق ThermocyclerBio-RadT100تضخيم الحمض النووي لاستنساخ الجينات
جدار رقيق الشعيرات الدموية الزجاجيةWPITW100F-4الزجاج الخام لصنع إبرة كابلاري
Tol2-exL1 التمهيديIDT DNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCمقايسة المكوس Tol2-exR
التمهيديIDT DNAACCCTCACTAAAGGGAACAAAGTOL2 مقايسة المكوس
TOP10 المختصة كيميائيا بكتريا قولونيةC404006 علميةحرارية تستخدم للتحويل أثناء استنساخ
الجيناتالتريكايين ميسيلاتسيجما ألدريتشA5040لتخدير الأسماك أو أجنة الأسماك الأشعة
فوق البنفسجية العابرة للإضاءة 302 نانومترUVPM-20Vتصور الحمض النووي
حمام مائيحراري علمي2853لعملية تحويل استنساخ الجينات
العلمية طرف الضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles