يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة

10.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57343

⸱

مايو 30, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ويقدم بروتوكول لاستخلاص نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة تربة واحدة في وقت واحد، مما يسمح عينة انخفاض إعداد مرات وتمكين متعدد omic الكتلي تحاليل العينات بكميات محدودة.

الملخص

الطيف الكتلي (مللي ثانية)-ميتابروتيوميك متكامل يستند إلى، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك (multi-أوميك) في تحويل قدرتنا على فهم وتميز المجتمعات الميكروبية في النظم البيئية والبيولوجية. هذه القياسات حتى تمكن التحليلات المعززة للمجتمعات الميكروبية التربة المعقدة، التي أكثر النظم الميكروبية المعقدة المعروفة حتى الآن. تحليلات متعددة-أوميك، ومع ذلك، قد التحديات إعداد عينة، منذ عمليات الاستخراج منفصلة مطلوبة عادة لكل دراسة أوميك، إلى حد كبير وبالتالي تضخيم إعداد الوقت وكمية العينة المطلوبة. لمعالجة هذا القيد، تم إنشاء أسلوب 3 في 1 لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (مبليكس) من نفس العينة التربة بتكييف نهج قائم على أساس مذيب. أثبت هذا البروتوكول مبليكس على حد سواء بسيطة وقوية للعديد من أنواع العينات، حتى عندما تستخدم لكميات محدودة من عينات التربة المعقدة. الأسلوب مبليكس كبير أيضا تمكين القياسات المتعددة-أوميك السريع اللازم للحصول على فهم أفضل لأعضاء كل جماعة الميكروبية، أثناء تقييم التغيرات التي تحدث عند الاضطرابات البيولوجية والبيئية.

المقدمة

تقييم المجتمعات الميكروبية في التربة آثار هامة لفهم الكربون ركوب الدراجات، وتغير المناخ. قد أبرزت الدراسات الأخيرة لكن الصعوبات، مثل عدم وجود تسلسل الجينوم الحجمية في مختلف أنواع التربة والدالة غير معروف للعديد من البروتينات الكشف عن. هذه نتيجة التحديات نظراً للتربة يجري المجتمع الميكروبي أعقد المعروفة حتى الآن1،،من23. تحليلات متعددة-أوميك، التي تجمع بين النتائج من الجينومية، ميتاترانسكريبتوميك، ميتابروتيوميك، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك، قد نفذت مؤخرا في العديد من الدراسات التربة على اكتساب فهم أكبر في الميكروبات الحالية، بينما الحصول على معلومات شاملة حول التغيرات الجزيئية التي تحدث بسبب الاضطرابات البيئية1،،من45. التحدي واحدة مع دراسات متعددة-أوميك هو أن الكتلي (مللي ثانية)-استناداً إلى قياسات ميتابروتيوميك، metabolomic، ليبيدوميك، وعادة ما تتطلب عملية استخراج محددة لكل أوميك أن يكون مرض التصلب العصبي المتعدد متوافق مع6،7 , 8 , 9-هذه الإجراءات الدقيقة جعل تنفيذها صعباً أو مستحيلاً للغاية عندما فقط تتوفر كمية محدودة من عينة. هذه التحديات قد حدا بنا إلى التحقيق في أسلوب متزامنة من استخراج (مبليكس) المستقلب والبروتين والدهن قادرة على استخدام أصغر حجم العينة أو الجماهير، وتحسين دقة وتوفير الاستعدادات عينة أسرع لجميع التحاليل الثلاثة 10-حتى الآن، لا توجد أي إجراءات استخراج التربة البديلة التي يمكن تحقيق كل هذه الأهداف.

لتمكين تحليلات عالمية متعددة-أوميك من عينة التربة واحدة، كان بروتوكولا استخلاص بالمذيبات عضوية استناداً إلى كلوروفورم، والميثانول، وفصل المياه المستخدمة10. هذا الأسلوب وضعت أصلاً للدهن مجموع الاستخراج9،11 ، وفي الآونة الأخيرة عدل لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة واحدة12،13 ،14،15،16،17،،من1819،،من2021،22، 23،24،25،26،27،28،،من2930، تمكين أقل كمية العينة و 10من تقلب التجريبية. في بروتوكول مبليكس، كلوروفورم ليس الامتزاج مع الماء، مما يوفر الأساس لفصل مكونات عينة ثلاثية الأطوار الكيميائية إلى كسور متميزة. ولذلك تتضمن المرحلة مائي أعلى والايضات ماء، متبوعة بقرص بروتين، ومن ثم طبقة الدهون في مرحلة كلوروفورم السفلي (الشكل 1). عندما يتم تطبيق مبليكس على معظم أنواع التربة، جسيمات الحطام يتراكم في الجزء السفلي من أنابيب أخذ العينات ويمكن التخلص منها بعد أن يتم جمع كل الطبقات. كل نوع من أنواع التربة يمكن أن تكون مختلفة، ومع ذلك، وفي التربة العضوية العالية مثل الخث، والحطام التربة يبقى في الطبقة الوسطى، ولا تقع على الجزء السفلي من أنبوب أخذ العينات. مبليكس يوفر العديد من المزايا عند عزل جزيء عدة أنواع من نفس العينة مثل كميات 1) أصغر بعينه يمكن أن تستخدم لتحليلات متعددة-أوميك، 2) multi-omic الاستخراج من النقصان عينة نفس تقلب التجريبية عموما، و 3) يمكن إعداد أسرع بكثير عدد أكبر من العينات ل دراسات الإنتاجية أعلى10. معا هذه الفوائد أمر حيوي لتوفير قدرات القياس بشكل أفضل لتقييم عينات التربة ومجتمعاتهم الجرثومية المعقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يمكن ليوفيليزيد التربة رطبة جداً قبل استخراج دون الأضرار بالفعالية للاستخراج. يمكن أيضا استخدام التربة الرطبة لكن ينبغي النظر عند إضافة الكواشف في نسب محددة.

ملاحظة: من المستحسن استخدام 20 غراما وزن التربة الجافة للاستخراج، التي يجب تقسيمها بين أنبوبين 50 مل (بحد أقصى 10 جرام التربة في أنبوب 50 مل). يمكن تحجيم عمليات الاستخراج صعودا أو هبوطاً يعتمد على العينة المتاحة.

ملاحظة: يمكن غربلة عينات التربة الجافة من خلال شاشة 3 مم لمجانسة وإزالة الجذور الصغيرة والصخور. لا منخل عينات التربة الرطبة، كما سوف تتعثر العينة في الشاشة.

1-التربة تحلل الخلية واستخراج من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (توقيت د ~ 1)

  1. كل عينة التربة ز 20، تزن 10 جرام إلى أنبوبين منفصلين 50 مل الميثانول/كلوروفورم متوافقة. تكون حذراً للغاية مع أنابيب المختار، كما سوف ليتش كلوروفورم معظم المواد البلاستيكية، تلوث العينات. استخدام الزجاج كلما كان ذلك ممكناً أو البلاستيكية أنابيب مصنوعة من بولي بروبلين أو تترافلوروايثيلين (PTFE).
    ملاحظة: الحفاظ على التربة على الجليد وباردة قدر الإمكان خلال الخطوات الأولية وزنها والتجانس.
  2. إضافة 10 مل كلوروفورم غسلها الفولاذ المقاوم للصدأ وحبات العقيق لكل أنبوبة. على الجليد، إضافة 4 مل البرد عالي النقاوة الماء (انظر الجدول للمواد لنظام تنقية) لكل أنبوبة (تقسيم عينة واحدة بين أنبوبين) ونقل العينات دلو الجليد في غطاء دخان.
  3. بسرعة باستخدام ماصة مصلية زجاج 25 مل، إضافة 20 مل من المثلج 2:1 كلوروفورم: الميثانول (v/v).
    تنبيه: لقد كلوروفورم: الميثانول حدة الآثار الصحية المحتملة: الجلد تهيج والحروق الكيميائية المحتملة، وتهيّج الجهاز التنفسي. قد يؤثر على الكلي والكبد والقلب. ارتداء نظارات واقية مناسبة وملابس، والقفازات، والعمل دائماً في غطاء دخان.
  4. تشديد على أغطية ودوامه في الحل. choloroform:methanol 2:1 يساعد على كسر جدار خلية بدائيات النوى ويحللها أيضا الأنشطة الانزيمية.
  5. إرفاق هذه الأنابيب إلى 50 مل أنبوبة الدوامة المرفقات ودوامه لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية داخل ثلاجة أفقياً إذا أمكن. ثم وضع العينات داخل ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة دقيقة ~ 15 بغية تهدئة لهم تماما.
  6. استخدام سونيكاتور تحقيق داخل غطاء دخان، sonicate كل عينة مع تحقيق 6 مم (1/4 ") في السعة 60% لمدة 30 ثانية كل على الجليد.
    تنبيه: يوصي باستخدام صوت تخف حماية الضميمة والإذن أثناء سونيكاتينج. الجهد العالي موجود في كابل العرض والترددات العالية الطاقة. تجنب لمس الجانبين السفينة عينة أو السفلي مع فحص نشط؛ قد صدع أو ذوبان البلاستيك.
  7. وضع العينات في الثلاجة-80 درجة مئوية ~ 15 دقيقة، كما سونيكاتينج يمكن أن تولد الكثير من الحرارة.
  8. كرر الخطوات من 1، 1، 5-7.
    ملاحظة: تأكد من البقاء باردة طوال فترة الإجراءات تحلل العينات.
  9. الطرد المركزي هذه العينات في س 4,000 ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية. عند هذه النقطة، سيتم فصل العينة إلى الطبقة العليا المستقلب إينتيرلايير البروتين، وانخفاض طبقة الدهن (وبيليه الحطام المتبقي). انظر الشكل 1.
  10. وضع العينات على الجليد دلو الجليد، وداخل غطاء دخان واستخدام 10 مل زجاج ماصة مصلية، إزالة الطبقات العليا المستقلب من أنبوبين 50 مل في قنينة زجاجية كبيرة واحدة.
    ملاحظة: تجنب يسفط أي طبقة البروتين إلى الماصة؛ ترك طبقة صغيرة من المستقلب إذا لزم الأمر.
  11. إمالة أنبوب 50 مل بالإفراج عن إينتيرلايير البروتين حيث يكون العائمة مجاناً عند طبقة الدهن أقل قليلاً. باستخدام ملعقة مسطحة رئيس مختبر فولاذ المقاوم للصدأ نظيفة، حلج القطن كلا من إينتيرلاييرس البروتين بعناية ووضعها معا في أنبوب 50 مل واحد جديد.
  12. استخدام ماصة مصلية زجاج 25 مل، إزالة طبقات الدهون أقل في قنينة زجاجية كبيرة واحدة.
    ملاحظة: في محاولة لتجنب تطمح جزيئات التربة؛ ومع ذلك، تطمح بعض التربة الحطام والجزيئات جنبا إلى جنب مع الدهون سيتم إزالة في وقت لاحق.
  13. مكان تنفس الأغشية عبر الجزء العلوي من المستقلب والدهن زجاج قارورة وجاف في مركز فراغ حتى جفاف (الدهون ح ~ 4-5، والايضات بين عشية وضحاها).
  14. لأنبوب عينة البروتين وأنابيب بيليه الحطام المتبقي، بإضافة 20 مل من الميثانول المثلج لكل منهما ودوامه. ويتم ذلك بالكريات الحطام شطف كلوروفورم قبل محاولة لجعل أي البروتين المتبقية الممكنة من تحت الأنقاض قبل ينثر.
  15. أجهزة الطرد المركزي الكريات الحطام والبروتين المدى في 4,000 س ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية، ثم صب الميثانول في حاوية نفايات الخطرة داخل غطاء دخان.
  16. تجميد الكريات البروتين والحطام في النتروجين السائل والجاف في ليوفيليزير (مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية بسبب الميثانول بعد نقطة تجميد منخفضة جداً من-98 درجة مئوية) لمدة ساعة ~ 2.
    ملاحظة: لا جاف الإفراط الكريات، كما أنها ستكون أكثر صعوبة جعل.
  17. إضافة 10 مل من البروتين المخزن المؤقت سولوبيليزيشن (الحزب الديمقراطي الصربي 4 ٪، 100 مم DTT (DL-ديثيوثريتول) في 50 ملم تريس العازلة، pH 8.0؛ انظر التكميلية كاشف الإعداد) إلى أنبوب البينية البروتين و 20 مل لكل من الكريات الحطام.
    تنبيه: الحزب الديمقراطي الصربي يسبب السمية الحادة والقابلة للاشتعال. من الجلد والعيون، ومجرى الهواء مهيجة. ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
  18. في غطاء الدخان، sonicate المسبار العينات في السعة 20% لمدة 30 ق لتقديمهم إلى الحل. دوامة لمدة 2 دقيقة.
  19. ضع العينة البينية البروتين في المدورة أنبوب مختبر مدة 30 دقيقة 300 لفة في الدقيقة، 50 درجة مئوية، جعل البروتين.
  20. أفقياً دوامة العينات الحطام 10 دقيقة إضافية أي الخلايا المتبقية سليمة، ثم تدوير مع عينات البروتين البينية ل 20 دقيقة المتبقية.
  21. الطرد المركزي جميع العينات في س 4,500 ز لمدة 10 دقائق، درجة حرارة الغرفة (RT)، وجمع المادة طافية من كل أنبوبة كل عينة إلى أنبوبين 50 مل.
  22. قم بإضافة 10 مل solubilization المخزن المؤقت للبروتين بيليه البينية، ثم sonicate ودوامه بالعودة إلى الحل وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل.
  23. دمج في supernatants اثنان أنابيب 50 مل على قدم المساواة والطرد المركزي في 8,000 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية، في دوار دلو زاوية ثابتة.
    ملاحظة: الطرد المركزي نهائي ضروري لإزالة المواد الدبالية تلويث المفرط.
  24. صب في supernatants في أنبوبين 50 مل حيث أن هناك 30 مل في كل منهما. ثم، باستخدام 10 مل زجاج ماصة مصلية، إضافة 7.5 مل من كلورفورم الميثيل (حمض التريكلوروسيتيك) لكل أنبوبة. دوامة في الحل. وهذا يجعل نسبة 20% TCA في كل عينة 30 مل (ضبط تبعاً لذلك)،
    تنبيه: TCA هو الكاوية والسامة ومايو تسبب حروق الجلد. ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
  25. وضع العينات في ثلاجة-20 درجة مئوية ل 2 (ح) بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: البروتينات سوف يعجل عادة ضمن ح 1، لكن يمكن أن يكون بين عشية وضحاها اليسار (ما يصل إلى 18 س).
    ملاحظة: لا تدع استخراج TCA الذهاب أطول من ح 18 بسبب التحلل حمض ممكن من البروتين. إذا كان يتم تجميد العينة، الذوبان في الجليد؛ لا تدع العينة الاحماء في الماضي ذوبان الجليد.
  26. بيليه البروتين سرع، الطرد المركزي العينة في 4,500 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية، وصب المادة طافية في النفايات.
  27. إضافة 10 مل الأسيتون المثلج 100% لكل بروتين بيليه، ودوامه، والجمع بين مثل الكريات في أنبوب واحد.
  28. الطرد المركزي الأنبوبة المحتوية على بيليه مجتمعة (باستخدام توازن)، ومن ثم صب المادة طافية في النفايات.
    تنبيه: الأسيتون قد يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي، وهو سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتداء قفازات سلامة النظارات ومعطف معمل، والعمل في غطاء دخان.
  29. أغسل بيليه مرتين باستخدام 1.5 مل من الأسيتون ونقل أخيرا إلى أنبوب 2 مل للدوران النهائية في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق.
  30. صب المادة طافية في النفايات وتسمح بيليه لتجف مقلوب على مسح ورقة في غطاء دخان ~ 20 دقيقة أو ضمن إطار دفق نيتروجين حتى تبدأ بيليه قليلاً للقضاء.
  31. إضافة 100-200 ميليلتر من المخزن المؤقت سولوبيليزيشن البروتين، تبعاً لحجم بيليه.
    ملاحظة: الاحتفاظ بحجم المخزن المؤقت سولوبيليزيشن إضافة إلى عينة منخفضة قدر الإمكان. يمكن فقط استخدام اللاحقة تصفية مساعدة نموذج إعداد (FASP) ما يصل إلى 50 ميكروليتر من عينة solubilized كل عمود؛ أي يجب أن يكون أكثر انقسام إلى أعمدة فاسب متعددة.
  32. Sonicate ودوامه بيليه في الحل. علما بأن العينة قد تكون اللزوجة بسبب المواد الدبالية عجل جنبا إلى جنب مع البروتين، التي سيتم إزالتها مع الطرد المركزي لاحقة.
  33. هزة العينة في حاضنة/شاكر مدة 30 دقيقة 300 لفة في الدقيقة، 40 درجة مئوية، جعل البروتين في الحل، والمضي قدما لهضم البروتين.
  34. الأداة الإضافية تجميد العينة في النتروجين السائل ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية حتى على استعداد لهضم البروتين.

2-المادة الدهنية إعداد (توقيت ~ 20 دقيقة)

  1. وبمجرد عينات الدهن الجاف، إضافة 200 ميكروليتر من 2:1 كلوروفورم: الميثانول إلى القنينة، دوامة في الحل ونقل إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل، إضافة ميكروليتر 200 إضافية للزجاج فيال، دوامة و "الماصة؛" الدهون المتبقية ونقل إلى الأنبوب.
  2. الطرد المركزي بين الأنقاض من العينة في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. نقل المادة طافية في قنينة الدهن الزجاج ومخزن في-20 درجة مئوية حتى تحليل LC-MS/MS (تفاصيل إضافية ل LC-MS/MS في أساليب تكميلية).
  4. إذا لا يمكن تحليل العينات مباشرة بعد التحضير، الدهون تحتاج إلى تخزين في المذيبات في-20 درجة مئوية لمنع الأكسدة والتدهور.

3-المستقلب إعداد و Derivatization (توقيت ح ~ 5)

  1. في اليوم التالي لاستخراج، إزالة عينات المستقلب من "بطالة سرعة" وتخزين جافة في-20 درجة مئوية حتى جاهزة ل derivatization والتحليل في GC. إذا لم يكن قيد التشغيل والايضات على نشرة مصورة عمومية، ثم إعداد عليها باستخدام البروتوكول المناسب لهذا الصك.
  2. مباشرة قبل ديريفاتيزينج الأيض للتحليل في GC، نقلها من القنينات الزجاجية الكبيرة بإضافة 200 ميكروليتر من الميثانول، فورتيكسينج، وإضافة إلى أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل. كرر مرة واحدة.
  3. الطرد المركزي الأنبوب في 12,000 ز خ ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية. نقل المادة طافية في قنينات زجاجية أصغر، إضافة غشاء تنفس إلى الأعلى، ويجف تماما في "بطالة" سرعة.
  4. ديريفاتيزي نواتج الأيض بإضافة 20 ميليلتر لحل ميثوكسياميني بعينه القنينة ودوامه لمدة 30 ثانية على فورتيكسير سرعة متوسطة.
    تنبيه: هيدروكلوريد ميثوكسياميني يسبب حروق خطيرة وأضرار خطيرة بالعيون، وقد تسبب حساسية بتماس الجلد. ارتداء نظارات السلامة وقفازات ومعطف المعمل، والعمل في غطاء دخان.
  5. استخدام سونيكاتور حمام لضمان حل العينة هو تماما.
  6. احتضان العينة في حاضنة مع غطاء منع تكثيف الحفاظ على 37 درجة مئوية عن 1 ساعة و 30 دقيقة مع لفة في الدقيقة 1,000 تهتز.
  7. عكس القنينة مرة واحدة لخلط العينات مع قطرات مركزة على سطح الغطاء. تدور العينة إلى أسفل في 1,000 غ س ل 1 دقيقة، الرايت
  8. أداء silylation بإضافة 80 ميليلتر (باستخدام المحاقن) ن-الميثيل-N-(تريميثيلسيليل) تريفلورواسيتاميدي مع تريميثيلتشلوروسيلاني 1%. دوامة ل 10s.
    تنبيه: مستفا + 1% فصليا يمكن أن يسبب تآكل الجلد وتلف العين الشديد السمية الشاملة لأعضاء مستهدفة محددة، وهو سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتداء نظارات السلامة وقفازات ومعطف المعمل، والعمل في غطاء دخان.
  9. احتضان العينة في حاضنة مع غطاء منع تكثيف الحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع لفة في الدقيقة 1,000 تهتز.
  10. عكس القنينة مرة واحدة لخلط العينات مع قطرات مركزة على سطح الغطاء.
  11. تدور العينة إلى الأسفل لمدة 5 دقائق في 2,000 س ز، الرايت
  12. نقل الحل رياكتيد في قارورة المناسبة لتحليل GC-MS.

4-البروتين الهضم (توقيت د ~ 1)

  1. الطرد المركزي العينة في 15,000 س ز لمدة 5 دقائق، الرايت، بيليه أي حطام.
  2. إجراء تصفية--ساعدت عينة-إعداد (FASP) لهضم فاسب باستخدام مجموعات (انظر الجدول للمواد) بعد تعديل تعليمات الشركة المصنعة31،32:
    1. إضافة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا المخزن المؤقت إلى عمود فاسب (500 ميكروليتر 30 ك موكو تدور التصفية).
    2. وبمجرد الانتهاء من العينة سينتريفوجينج، "الماصة؛" إيقاف المادة طافية (تجاهل بيليه) وإضافة تصل إلى 50 ميكروليتر من العينة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا في العمود.
      ملاحظة: إضافة فقط يصل إلى 50 ميكروليتر من عينة كل عمود. إذا كان هناك أكثر من 50 ميكروليتر من عينة، استخدام أعمدة متعددة وتجمع بين الببتيدات بعد الهضم. فمن الأفضل أن تترك هذا الحجم منخفضة قدر الإمكان (30 ميليلتر مثالي) بغية ضمان FASP عمود سيؤدي إلى إزالة كل من الحزب الديمقراطي الصربي الذي هائلة يمكن أن تتداخل مع التحليل الشامل المواصفات.
    3. مكان العمود في أنبوب شملت 1.5 مل والطرد المركزي العينة في 14,000 ز خ ل 30 دقيقة، الرايت
    4. إزالة التدفق عبر في النفايات وإضافة ميكروليتر 400 م 8 اليوريا إلى العمود والطرد المركزي مرة أخرى.
    5. كرر الخطوة السابقة مرة أخرى ليصبح مجموع 3 اليوريا يشطف.
      ملاحظة: تأكد من العينة يذهب ما يقرب من جفاف في العمود، إذا كان هناك أي أكثر من ~ 30 ميليلتر المتبقية على التصفية بعد كل دورة، مواصلة سينتريفوجينج.
    6. إضافة ميكروليتر 400 50 مم NH4HCO3 وأجهزة الطرد المركزي في 14,000 ز س لمدة 20 دقيقة، وتجاهل النفايات وكرر مرة واحدة.
    7. نقل الأعمدة إلى أنبوب الطرد مركزي نظيفة 1.5 مل.
    8. إضافة ميكروليتر 75 التربسين هضم المخزن المؤقت إلى الأعمدة واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3 في حاضنة مع غطاء منع تكثيف في 750 دورة في الدقيقة.
    9. إضافة ميليلتر 40 50 مم NH4HCO3 إلى الأعمدة.
    10. الطرد المركزي العينة في س 14,000 ز لمدة 15 دقيقة لجمع الببتيدات في الأنبوب مع الحفاظ على ملوثات عالية الوزن الجزيئي على رأس العمود.
    11. إضافة 40 ميكروليتر من 50 مم NH4HCO3 إلى العمود والطرد المركزي مرة أخرى.
  3. تجاهل العمود, الجاف أسفل الببتيدات في الأنبوب في "بطالة" سرعة ~ 30 ميليلتر، واتفاق التعاون الأساسي المقايسة (طقم مقايسة البروتين حمض بيسينتشونينيك؛ انظر الجدول للمواد) الببتيدات.
  4. بشكل اختياري، أداء خطوة التنظيف في حالة الاشتباه في تلوث مخزونات النشر الاستراتيجي (فقاعات مرئية)33. ويجب أن يتم استخراج مرحلة صلبة بعد ذلك في حالة اختيار هذا الخيار. تتوفر معلومات مفصلة حول هذا الأسلوب تنظيف في أساليب تكميلية.
  5. تخفيف العينة لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد أو المضي قدما بشكل اختياري إلى تجزئة [هبلك] (الخطوتين التاليتين).
  6. أن يجزئ، تخفف من العينات إلى حجم 400 ميليلتر مع المخزن المؤقت فورمات الأمونيوم 10 ملم (pH 10.0).
  7. حل على عمود C18 (انظر الجدول للمواد) بفصل في 0.5 مل/دقيقة باستخدام نظام [هبلك] مع مراحل المتنقلة (A) 10 ملم فورمات الأمونيوم، pH 10.0 و (ب) 10 مم فورمات الأمونيوم، pH 10.0/الاسيتو الانيتريل (10:90).
    1. ضبط التدرج من نسبة 100% A إلى 95% A خلال أول 10 دقيقة، 95% A إلى 65% A خلال دقيقة 10 إلى 70، أ 65% إلى 30% على مدى دقيقة 70 إلى 85، الحفاظ على الأقل 30% A خلال دقيقة 85 إلى 95.
    2. إعادة توازن مع 100% A خلال دقيقة 95 إلى 105 بنسبة 100% A حتى 120 دقيقة.
    3. جمع الكسور كل دقيقة 1.25 (96 الكسور عبر التدرج الكامل) وأخيراً الجمع بين كل صف لما مجموعة 12 عينات أو كل صف آخر للعينات 24 (كل منها n = 8 أو n = 4 الكسور المجمعة).
  8. الجاف لجميع الكسور تحت الفراغ وإضافة 15 ميليلتر من الماء عالي النقاوة لكل مخزن في-20 درجة مئوية حتى تحليل LC-MS/MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عندما تستخدم بروتوكول مبليكس لاستخراج جزيئات من كانساس البراري الأصلي التربة (تربة موليسول)، قدمت تحليلات ثلاث نتائج الببتيدات 3376 والدهون 105 والايضات القطبية 102 (كل هوية فريدة من نوعها). في حين كان البروتوكول مبليكس راسخة لاستخراج عامة من الدهون ونواتج الأيض12،13،،من1415،،من1617،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من المهم أن نلاحظ أن ليس جميع المختبرات سوف يكون نفس المعدات المتاحة حتى يمكن تكييف أساليب معينة، وعلى سبيل المثال فإن الخطوة تحلل،. هنا نستخدم فورتيكسينج وسونيكاتينج، أن استخدام الخافق حبة كبيرة 50 مل العمل. إذا لم يتوفر ليوفيليزير مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية، ثم يمكن أن تجفف العينات تحت تيار نيتروجين. أيضا أنواع التربة تختلف اختلافاً كبيرا ويمكن أن تشمل الرمل والطمي والطين، الخث والصلصالي (إلخ)، وأنها يمكن أن تختلف أيضا بناء على درجة الحموضة والملوحة وثراء المواد العضوية. كل من هذه الفروق يمكن أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

المؤلف يود أن يشكر ناثان جونسون لمساعدته في إعداد الأرقام. هذا البحث وأيده اوميكس عموم البرنامج الذي تموله وزارة الطاقة الأمريكية مكتب البيولوجية والبحوث البيئية (برنامج العلوم المجيني)، ميكروبيوميس في المرحلة الانتقالية (النعناع) "مختبر الموجهة للبحث والتطوير" المبادرة في المختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ، فضلا عن الوطنية معاهد للصحة الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (R01 ES022190)، والمعاهد الوطنية للصحة (P42 ES027704). كيبج يود أن يشكر R21 HD084788 لتقديم الدعم المالي لتطوير والتحقق من صحة رواية متعددة-omic تقنيات الاستخراج. هذا العمل قد أنجز في جورج ر. إيلي البيئية الجزيئي العلوم المختبرية (امسل)، منشأة الكيان التشغيلي المعين لمستخدم علمية وطنية في المختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ (بننل). بننل برنامج متعدد مختبر وطني تشغلها Battelle للكيان التشغيلي المعين تحت العقد دي-AC06-76RL01830.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
650498تخزين الكلوروفورمسيجما ألدريتشعند -20 درجة ؛ C ! تحذير الكلوروفورم له آثار صحية محتملة حادة ، وتهيج الجلد والحروق الكيميائية المحتملة ، وتهيج الجهاز التنفسي ، قد يؤثر على الكلى والكبد والقلب. ارتد نظارات واقية مناسبة وملابس وقفازات ، واعمل في غطاء الدخان.
الميثانولسيجما ألدريتش34860مخزنة في -20 درجة ؛ C ! تحذير قد يسبب الميثانول تهيج الجهاز التنفسي والجلد والعين ، وقد يتلف الأعصاب والكلى والكبد. ارتد نظارات واقية مناسبة وملابس وقفازات ، واعمل في غطاء الدخان.
مياه نقية مننظام تنقية المياهMilli-Q
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتشL6026! تحذير: يسبب SDS سمية حادة وقابل للاشتعال. إنه مهيج للجلد والعين ومجرى الهواء. ارتد القفازات ونظارات السلامة.
طقم استخراج بروتين التربةMoBio ، طقم استخراج بروتين التربة NoviPure ، Qiagen30000-20
DL-dithiothreitolSigma-Aldrich43815
1M Trizma HCLSigma-AldrichT2694
حمض ثلاثي كلورو أسيتيكسيجما-ألدريتشT0699! تحذير TCA مادة كاوية وسامة وقد تسبب حروقا في الجلد. ارتد القفازات ونظارات السلامة.
650501تخزين الأسيتونسيجما ألدريتشفي -20 درجة ؛ C ! تحذير قد يسبب الأسيتون تهيج الجهاز التنفسي والجلد والعين. سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان.
اليورياسيجما ألدريتش208884! تحذير اليوريا مهيجة للعين والجلد ، استخدم القفازات ونظارات السلامة
بيكربونات الأمونيومفلوكا09830
التربسينبروميجاV528A20 & مايكرو ؛ g قوارير
مجموعة فحص بروتين حمض البيسينجونينيكبيرس23227
فورمات الأمونيومسيجما ألدريتش09735
أسيتونيتريلسيجما ألدريتش34998! تحذير الأسيتونيتريل مهيج للجلد والعين. شديد الاشتعال. ارتد القفازات ونظارات السلامة. العمل في غطاء الدخان.
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتشT6508! تحذير TFA خطير للغاية في حالة ملامسة الجلد وملامسة العين والابتلاع والاستنشاق. قد يؤدي تلف الأنسجة خاصة على الأغشية المخاطية للعينين والفم والجهاز التنفسي. قد يؤدي ملامسة الجلد إلى حروق. ارتد القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة واعمل في غطاء الدخان.
ميثوكسيأمين هيدروكلوريدسيجما ألدريتش226904! تحذير يسبب الميثوكسيأمين هيدروكلوريد حروقا شديدة وأضرار جسيمة للعينين ، وقد يسبب التحسس عن طريق ملامسة الجلد. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان.
بيريدينسيجما ألدريتش270970! تحذير يمكن أن يسبب البيريدين تهيج الجلد والعين واكتئاب الجهاز العصبي المركزي. قد يتسبب البخار في حدوث حريق سريع. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان.
N-Methyl-N- (trimethylsilyl) ثلاثي فلورو أسيتاميد مع 1٪ ثلاثي ميثيل كلوروسيلانسيجما ألدريتش69478! تحذير يمكن أن يتسبب MSTFA + 1٪ TMCS في تآكل الجلد وتلف خطير في العين وسمية عضو مستهدف محدد. سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان.
كلوريد البوتاسيومسيجما ألدريتشP9541
تنقية المياه ميلي كيوميليبورMPGP04001
دوامةالصناعات العلميةSI-0236دوامة جيني 2
مسبار سونيكاتورفيشرنموذج العلامة التجاريةFB505
طرد مركزي مبردإيبندورفموديل 5810R
50 مل أنبوب دوار دلو متأرجحEppendorfA-4-44
50 مل دوار بزاوية ثابتةEppendorfFA-45-6-30
BalanceOHAUSModel V22PWE150IT
وحدة تحكم الماصة المصليةEppendorf12-654-100
10 مل ، 25 مل ماصات زجاجية مصليةFisherBrand13-678-27F ، 13-678-36D
Thermomixer مع ThermotopEppendorf5382000015 ، 5308000003
0.9 & 2.0 مم مزيج من الفولاذ المقاومالخرز NextAdvanceSSB14B
0.15 مم حبات العقيقMoBio13122-500
لوحة التحريك المغناطيسيFisherBrand11-100-16SH
التحريك المغناطيسيFisherBrandشرائط ورق الأس الهيدروجيني
، درجة الحموضة النطاق 0 & ndash ؛ 14FisherBrandM95903
15 مل ، 50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطي من مادة البولي بروبلينجينيسي Scientific21-103 21-108متوافق مع الكلوروفورم
50 مل مرفق دوامةMoBio13000-V1-50
دلو الثلجFisherBrand02-591-44
قوارير زجاجية 27.25x70 ممFisherBrand03-339-22K
التنفس أغشية الألواح الأسهل الغربالأوسط العلميBERM-2000
مناديل الكحولمتنوعة التكنولوجيا الحيويةBPWP-1000
حاضنة شاكر سخانالمعيار ، Incu-Shaker Mini
Analog Rotesserie أنبوب دوارSoCal BioMed، LLC82422001
مجموعة المرشح بمساعدة العينة الإعداديةFASP ؛ Expedeon44250
قارئ MicroplateBiotek ، EPOCH-20
درجة مئوية فريزرفيشر13986149-80
درجة مئوية فريزرستيرلنغ فائق البرودةSU78OUE
Q-Exactive أيون مصيدة مطياف كتلةThermo Scientific
Agilent 7890A مقترن برباعي أقطاب واحد مطياف الكتلة 5975CAgilent Technologies، Inc.
LTQ-Orbitrap VeloThermo Scientific
Waters NanoEquityTM نظام UPLCميلفورد ، MA
زجاجة وسائط 250 ملFisherBrand1395-250
قارورة المياه186002805
زجاج MS عينة وإدراجMicroSolv9502S-WCV ، زجاج 9502S-02ND
قنينة HPLC وأغطية المفاجئةMicroSolv9512C-0DCV ، 9502C-10C-B
HPLC 96 بئر لوحةAgilent5042-6454
قارورة زجاجية كبيرة 27.25x70mmFisherBrand03-339-22K
LyophilizerLabconco7934021
ملعقة رأس مسطحة من الفولاذ المقاوممصقول Spoonula ؛ مناديل FisherBrand14-375-10
KimKimberly-Clark34721
XBridge C18 ، 250x4.6 مم ، 5 & mu ؛ M مع عمود حماية 4.6x20 ممWaters186003117 ، 186003064
Agilent 1100 series نظام HPLCAgilent TechnologiesG1380-90000
1.7 مل أنبوب الطرد المركزيسورنسون11700
محاقن زجاجية هاميلتون ، 5 مل ، 50 ميكرو ؛ L و 250 & micro; Lهاميلتون81517 ، 80975 ، 81175
باستور ماصاتفيشر العلامة التجارية13-678-20A
باستور ماصةسيجما ألدريتشZ111597
حمام سونيكاتوربرانسون 1800 بالموجات فوق الصوتية منظف
فراغ الطرد المركزيلابكونكو Centrivap نظام مكثف
أعمدة MicroSpin ، C18 سيليكاذا نيست جروبSEM SS18V
Millipore . نظام نموذج جهاز للصدأ شريط 14512130 للصدأ لمبات مقاوم للأحماض

المراجع

  1. Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
  2. White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
  3. White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
  4. Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
  5. Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
  7. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
  8. Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).
  9. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
  10. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
  11. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  12. Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138(2016).
  13. Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
  14. Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
  15. Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
  16. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209(2015).
  17. Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188(2015).
  18. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
  19. Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155(2013).
  20. Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
  21. Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
  22. Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558(2012).
  23. Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
  24. Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584(2012).
  25. Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
  26. Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
  27. Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719(2010).
  28. Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
  29. Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
  30. Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
  31. Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
  32. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
  33. Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
  34. Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
  35. Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
  36. Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
  37. Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277(2014).
  38. Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
  39. Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.