ويقدم بروتوكول لاستخلاص نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة تربة واحدة في وقت واحد، مما يسمح عينة انخفاض إعداد مرات وتمكين متعدد omic الكتلي تحاليل العينات بكميات محدودة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الطيف الكتلي (مللي ثانية)-ميتابروتيوميك متكامل يستند إلى، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك (multi-أوميك) في تحويل قدرتنا على فهم وتميز المجتمعات الميكروبية في النظم البيئية والبيولوجية. هذه القياسات حتى تمكن التحليلات المعززة للمجتمعات الميكروبية التربة المعقدة، التي أكثر النظم الميكروبية المعقدة المعروفة حتى الآن. تحليلات متعددة-أوميك، ومع ذلك، قد التحديات إعداد عينة، منذ عمليات الاستخراج منفصلة مطلوبة عادة لكل دراسة أوميك، إلى حد كبير وبالتالي تضخيم إعداد الوقت وكمية العينة المطلوبة. لمعالجة هذا القيد، تم إنشاء أسلوب 3 في 1 لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (مبليكس) من نفس العينة التربة بتكييف نهج قائم على أساس مذيب. أثبت هذا البروتوكول مبليكس على حد سواء بسيطة وقوية للعديد من أنواع العينات، حتى عندما تستخدم لكميات محدودة من عينات التربة المعقدة. الأسلوب مبليكس كبير أيضا تمكين القياسات المتعددة-أوميك السريع اللازم للحصول على فهم أفضل لأعضاء كل جماعة الميكروبية، أثناء تقييم التغيرات التي تحدث عند الاضطرابات البيولوجية والبيئية.
المقدمة
تقييم المجتمعات الميكروبية في التربة آثار هامة لفهم الكربون ركوب الدراجات، وتغير المناخ. قد أبرزت الدراسات الأخيرة لكن الصعوبات، مثل عدم وجود تسلسل الجينوم الحجمية في مختلف أنواع التربة والدالة غير معروف للعديد من البروتينات الكشف عن. هذه نتيجة التحديات نظراً للتربة يجري المجتمع الميكروبي أعقد المعروفة حتى الآن1،،من23. تحليلات متعددة-أوميك، التي تجمع بين النتائج من الجينومية، ميتاترانسكريبتوميك، ميتابروتيوميك، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك، قد نفذت مؤخرا في العديد من الدراسات التربة على اكتساب فهم أكبر في الميكروبات الحالية، بينما الحصول على معلومات شاملة حول التغيرات الجز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يمكن ليوفيليزيد التربة رطبة جداً قبل استخراج دون الأضرار بالفعالية للاستخراج. يمكن أيضا استخدام التربة الرطبة لكن ينبغي النظر عند إضافة الكواشف في نسب محددة.
ملاحظة: من المستحسن استخدام 20 غراما وزن التربة الجافة للاستخراج، التي يجب تقسيمها بين أنبوبين 50 مل (بحد أقصى 10 جرام التربة في أنبوب 50 مل). يمكن تحجيم عمليات الاستخراج صعودا أو هبوطاً يعتمد على العينة المتاحة.
ملاحظة: يمكن غربلة عينات التربة الجافة من خلال شاشة 3 مم لمجانسة وإزالة الجذور الصغيرة والصخور. لا منخل عينات التربة الرطبة، كما سوف تتعثر العينة في الشاشة.
1-التربة تحلل الخلية واستخراج من نواتج الأيض، والبروتينات،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عندما تستخدم بروتوكول مبليكس لاستخراج جزيئات من كانساس البراري الأصلي التربة (تربة موليسول)، قدمت تحليلات ثلاث نتائج الببتيدات 3376 والدهون 105 والايضات القطبية 102 (كل هوية فريدة من نوعها). في حين كان البروتوكول مبليكس راسخة لاستخراج عامة من الدهون ونواتج الأيض12،13،،من1415،،من1617،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
من المهم أن نلاحظ أن ليس جميع المختبرات سوف يكون نفس المعدات المتاحة حتى يمكن تكييف أساليب معينة، وعلى سبيل المثال فإن الخطوة تحلل،. هنا نستخدم فورتيكسينج وسونيكاتينج، أن استخدام الخافق حبة كبيرة 50 مل العمل. إذا لم يتوفر ليوفيليزير مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية، ثم يمكن أن تجفف العينات تحت تيار نيتروجين. أيضا أنواع التربة تختلف اختلافاً كبيرا ويمكن أن تشمل الرمل والطمي والطين، الخث والصلصالي (إلخ)، وأنها يمكن أن تختلف أيضا بناء على درجة الحموضة والملوحة وثراء المواد العضوية. كل من هذه الفروق يمكن أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
المؤلف يود أن يشكر ناثان جونسون لمساعدته في إعداد الأرقام. هذا البحث وأيده اوميكس عموم البرنامج الذي تموله وزارة الطاقة الأمريكية مكتب البيولوجية والبحوث البيئية (برنامج العلوم المجيني)، ميكروبيوميس في المرحلة الانتقالية (النعناع) "مختبر الموجهة للبحث والتطوير" المبادرة في المختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ، فضلا عن الوطنية معاهد للصحة الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (R01 ES022190)، والمعاهد الوطنية للصحة (P42 ES027704). كيبج يود أن يشكر R21 HD084788 لتقديم الدعم المالي لتطوير والتحقق من صحة رواية متعددة-omic تقنيات الاستخراج. هذا العمل قد أنجز في جورج ر. إيلي البيئية الجزيئي العلوم المختبرية (امسل)، منشأة الكيان التشغيلي المعين لمستخدم علمية وطنية في المختبر الوط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 650498 | تخزين الكلوروفورم | سيجما ألدريتش | عند -20 درجة ؛ C ! تحذير الكلوروفورم له آثار صحية محتملة حادة ، وتهيج الجلد والحروق الكيميائية المحتملة ، وتهيج الجهاز التنفسي ، قد يؤثر على الكلى والكبد والقلب. ارتد نظارات واقية مناسبة وملابس وقفازات ، واعمل في غطاء الدخان. |
| الميثانول | سيجما ألدريتش | 34860 | مخزنة في -20 درجة ؛ C ! تحذير قد يسبب الميثانول تهيج الجهاز التنفسي والجلد والعين ، وقد يتلف الأعصاب والكلى والكبد. ارتد نظارات واقية مناسبة وملابس وقفازات ، واعمل في غطاء الدخان. |
| مياه نقية من | نظام تنقية المياه | Milli-Q | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | سيجما ألدريتش | L6026 | ! تحذير: يسبب SDS سمية حادة وقابل للاشتعال. إنه مهيج للجلد والعين ومجرى الهواء. ارتد القفازات ونظارات السلامة. |
| طقم استخراج بروتين التربة | MoBio ، طقم استخراج بروتين التربة NoviPure ، Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| حمض ثلاثي كلورو أسيتيك | سيجما-ألدريتش | T0699! | تحذير TCA مادة كاوية وسامة وقد تسبب حروقا في الجلد. ارتد القفازات ونظارات السلامة. |
| 650501 | تخزين الأسيتون | سيجما ألدريتش | في -20 درجة ؛ C ! تحذير قد يسبب الأسيتون تهيج الجهاز التنفسي والجلد والعين. سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان. |
| اليوريا | سيجما ألدريتش | 208884 | ! تحذير اليوريا مهيجة للعين والجلد ، استخدم القفازات ونظارات السلامة |
| بيكربونات الأمونيوم | فلوكا | 09830 | |
| التربسين | بروميجا | V528A | 20 & مايكرو ؛ g قوارير |
| مجموعة فحص بروتين حمض البيسينجونينيك | بيرس | 23227 | |
| فورمات الأمونيوم | سيجما ألدريتش | 09735 | |
| أسيتونيتريل | سيجما ألدريتش | 34998 | ! تحذير الأسيتونيتريل مهيج للجلد والعين. شديد الاشتعال. ارتد القفازات ونظارات السلامة. العمل في غطاء الدخان. |
| حمض ثلاثي فلورو أسيتيك | سيجما ألدريتش | T6508 | ! تحذير TFA خطير للغاية في حالة ملامسة الجلد وملامسة العين والابتلاع والاستنشاق. قد يؤدي تلف الأنسجة خاصة على الأغشية المخاطية للعينين والفم والجهاز التنفسي. قد يؤدي ملامسة الجلد إلى حروق. ارتد القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة واعمل في غطاء الدخان. |
| ميثوكسيأمين هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش | 226904 | ! تحذير يسبب الميثوكسيأمين هيدروكلوريد حروقا شديدة وأضرار جسيمة للعينين ، وقد يسبب التحسس عن طريق ملامسة الجلد. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان. |
| بيريدين | سيجما ألدريتش | 270970 | ! تحذير يمكن أن يسبب البيريدين تهيج الجلد والعين واكتئاب الجهاز العصبي المركزي. قد يتسبب البخار في حدوث حريق سريع. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان. |
| N-Methyl-N- (trimethylsilyl) ثلاثي فلورو أسيتاميد مع 1٪ ثلاثي ميثيل كلوروسيلان | سيجما ألدريتش | 69478 | ! تحذير يمكن أن يتسبب MSTFA + 1٪ TMCS في تآكل الجلد وتلف خطير في العين وسمية عضو مستهدف محدد. سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتد نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر ، واعمل في غطاء الدخان. |
| كلوريد البوتاسيوم | سيجما ألدريتش | P9541 | |
| تنقية المياه ميلي كيو | ميليبور | MPGP04001 | |
| دوامة | الصناعات العلمية | SI-0236 | دوامة جيني 2 |
| مسبار سونيكاتور | فيشرنموذج العلامة التجارية | FB505 | |
| طرد مركزي مبرد | إيبندورف | موديل 5810R | |
| 50 مل أنبوب دوار دلو متأرجح | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50 مل دوار بزاوية ثابتة | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | Model V22PWE150IT | |
| وحدة تحكم الماصة المصلية | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10 مل ، 25 مل ماصات زجاجية مصلية | FisherBrand | 13-678-27F ، 13-678-36D | |
| Thermomixer مع Thermotop | Eppendorf | 5382000015 ، 5308000003 | |
| 0.9 & 2.0 مم مزيج من الفولاذ المقاوم | الخرز NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 مم حبات العقيق | MoBio | 13122-500 | |
| لوحة التحريك المغناطيسي | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| التحريك المغناطيسي | FisherBrand | شرائط ورق الأس الهيدروجيني | |
| ، درجة الحموضة النطاق 0 & ndash ؛ 14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15 مل ، 50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطي من مادة البولي بروبلين | جينيسي Scientific | 21-103 21-108 | متوافق مع الكلوروفورم |
| 50 مل مرفق دوامة | MoBio | 13000-V1-50 | |
| دلو الثلج | FisherBrand | 02-591-44 | |
| قوارير زجاجية 27.25x70 مم | FisherBrand | 03-339-22K | |
| التنفس أغشية الألواح الأسهل الغرب | الأوسط العلمي | BERM-2000 | |
| مناديل الكحول | متنوعة التكنولوجيا الحيوية | BPWP-1000 | |
| حاضنة شاكر سخان | المعيار ، Incu-Shaker Mini | ||
| Analog Rotesserie أنبوب دوار | SoCal BioMed، LLC | 82422001 | |
| مجموعة المرشح بمساعدة العينة الإعدادية | FASP ؛ Expedeon | 44250 | |
| قارئ Microplate | Biotek ، EPOCH-20 | ||
| درجة مئوية فريزر | فيشر | 13986149-80 | |
| درجة مئوية فريزر | ستيرلنغ فائق البرودة | SU78OUE | |
| Q-Exactive أيون مصيدة مطياف كتلة | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A مقترن برباعي أقطاب واحد مطياف الكتلة 5975C | Agilent Technologies، Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM نظام UPLC | ميلفورد ، MA | ||
| زجاجة وسائط 250 مل | FisherBrand | 1395-250 | |
| قارورة المياه | 186002805 | ||
| زجاج MS عينة وإدراج | MicroSolv | 9502S-WCV ، زجاج 9502S-02ND | |
| قنينة HPLC وأغطية المفاجئة | MicroSolv | 9512C-0DCV ، 9502C-10C-B | |
| HPLC 96 بئر لوحة | Agilent | 5042-6454 | |
| قارورة زجاجية كبيرة 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| ملعقة رأس مسطحة من الفولاذ المقاوم | مصقول Spoonula ؛ مناديل FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18 ، 250x4.6 مم ، 5 & mu ؛ M مع عمود حماية 4.6x20 مم | Waters | 186003117 ، 186003064 | |
| Agilent 1100 series نظام HPLC | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7 مل أنبوب الطرد المركزي | سورنسون | 11700 | |
| محاقن زجاجية هاميلتون ، 5 مل ، 50 ميكرو ؛ L و 250 & micro; L | هاميلتون | 81517 ، 80975 ، 81175 | |
| باستور ماصات | فيشر العلامة التجارية | 13-678-20A | |
| باستور ماصة | سيجما ألدريتش | Z111597 | |
| حمام سونيكاتور | برانسون 1800 بالموجات فوق الصوتية منظف | ||
| فراغ الطرد المركزي | لابكونكو Centrivap نظام مكثف | ||
| أعمدة MicroSpin ، C18 سيليكا | ذا نيست جروب | SEM SS18V |
المراجع
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A. 3rd, et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from com....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
