أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

بذبذبات شبكة، التي تساعد على نقل المعلومات داخل وبين الدماغ مناطق^1،2،،من³⁴تنسيق نشاط الخلايا العصبية في الثدييات. وتشمل إيقاعات المخ ذبذبات تتراوح بطيئة جداً (< 0.8 هرتز) يصل إلى فائق السرعة (> 200 هرتز) الترددات. مجموعة كبيرة من الأدلة تؤيد مشاركة شبكة التذبذبات في وظائف الدماغ المتنوعة، بما في ذلك الإدراك^5،،من^67،،من^89،10 ، السلوكيات الفطرية^11،12 ، فضلا عن الاضطرابات العصبية مثل مرض باركنسون والصرع^13،،من¹⁴¹⁵. ولذلك أساليب انتقائية ودقة وقتيا للتلاعب التجريبية من ذبذبات شبكة أساسية لتطوير نماذج معقولة من الناحية الفسيولوجية للمزامنة وإقامة روابط سببية مع السلوك.

مزامنة شبكة الاتصال هو بوساطة ركائز البيولوجية المتنوعة والعمليات، بدءاً من هوية القنوات الأيونية الجزيئية وعلى حركية neuromodulation استثارة واتصالات شبكة الاتصال. تصميم البيولوجية إيقاع غالباً ما تكون مولدات تم كشف¹⁶ للعديد من إيقاعات المخ، والجوانب المتميزة التي (مثلاً، التردد، السعة) التي أحدثتها ديناميات أنواع متميزة من الخلايا والشبكات. على سبيل المثال، إينتيرنيورونس المثبطة استهداف سوماتا الخلايا الرئيسية هي أهم اللاعبين عبر نطاقات التردد والدماغ مناطق^17،18، بما في ذلك ثيتا^19،20، غاما^{20 , 21}، وذبذبات²² تموج (140-200 هرتز). وفي المقابل، تكفل المرحلة المزامنة من الخلايا البعيدة قوية تغذية إلى الأمام مما يشير إلى الخلايا الهرمية، الذي يعيد إطلاق إينتيرنيورونس. معلمة حاسمة للذبذبات، حجم السكان العصبية متزامنة، يرتبط ارتباطاً وثيقا بالسعة بقياس التذبذب طابعات الحجم الكبير، وعلى الأقل لذبذبات سريعة، يعتمد على محرك الأقراص ضادات على إينتيرنيورونس². وفي المقابل، ذبذبات أبطأ، مثل دلتا وايقاعات ثيتا، يتم إنشاؤها بواسطة الحلقات عنها بعيد المدى، التي شكلتها كورتيكو-ثالاميك^23،24 وإسقاطات الحاجز هيبوكامبال الآنسي^{25، 2627}من^،، على التوالي. التذبذبات في هذه الدوائر هي التي أحدثتها تفاعلات تأخير نشر الإشارات والردود منفعل وتفضيلها التردد في المشاركة الخلايا^28،،من^{2930، 31 , 32}-إسقاطات المثبطة من جابايرجيك بارفالبومين (PV)-إيجابية الخلايا من حاجز وسطى (مللي ثانية) إلى إينتيرنيورونس في^25،الحصين³³ومناطق باراهيبوكامبال و قشرة انتورهينال²⁶ أساسي لتوليد الذبذبات ثيتا في الفص الصدغي الآنسي. وهكذا، يمكن التلاعب الآليات الفيزيولوجية ذبذبات شبكة الاتصال والمزامنة الخلايا العصبية باستخدام أوبتوجينيتيكس مع دقة في الوقت الحقيقي.

وطبقت التلاعب أوبتوجينيتيك الخاصة بنوع الخلية للدراسات وذبذبات هيبوكامبال والقشرية في المختبر^{34،35،36،،}من³⁷³⁸ المجراة في^{30،39،40،41،42،43،،}من⁴⁴⁴⁵، بما في ذلك الوظيفية التحقيقات من غاما^{5،12،36،،}من^4647،،من^{4849،50، 51،52} وتموج ذبذبات^40،،من⁵³⁵⁴ والنوم مغزل^55،56. نحن أعرب مؤخرا عن فيروس ChR2 تعتمد على لجنة المساواة العرقية في MS، منطقة رئيسية لتوليد إيقاع ثيتا هيبوكامبال، من الفئران الكهروضوئية-لجنة المساواة العرقية. باستخدام هذا الإعداد، ميزات للذبذبات ثيتا هيبوكامبال (التردد والاستقرار الزمني) تسيطر عليها تحفيز أوبتوجينيتيك من إسقاطات المثبطة لمرض التصلب العصبي المتعدد في الحصين¹¹. وعلاوة على ذلك، أثارت ثيتا التردد أوبتوجينيتيك التحفيز من إسقاطات المثبطة مثل هيبوكامبال إيقاع ثيتا خلال الجمود مستيقظا. أوبتوجينيتيكالي العالق إيقاع ثيتا عرض الخصائص للذبذبات ثيتا عفوية في الماوس في طابعات الحجم الكبير ومستويات نشاط الخلايا العصبية.

الميزات الرئيسية لهذا البروتوكول ما يلي: (1) استخدام طريقا المثبطة التي أمر بالغ الأهمية الفيزيولوجية للذبذبات ثيتا عفوية مع تجنب الآثار غير محدد على استثارة هيبوكامبال؛ (2) محواري، أي، وتحفيز إسقاطات محددة للتقليل من تأثير مباشر على غير هيبوكامبال MS افيرينتس؛ (3) المحلي التحفيز الخفيفة ثيتا الإيقاعي، ضمان تدخل مباشر الحد أدنى مع ديناميات مثل هيبوكامبال ثيتا الإيقاعي والرائعة ثنائية عالمية للذبذبات ثيتا؛ (4) حدودي مراقبة تردد الذبذبات ثيتا وانتظامها؛ والكمي (5) الدقة الرائعة مع عالية الدقة الزمنية باستخدام طابعات الحجم الكبير لتمكين تحليل العلاقة السببية الكمية في سلوك الحيوانات. منذ إعداد هذا يستغل أساسا على دور معروفة جيدا لإزالة التثبيط مثل هيبوكامبال في ثيتا توليد^25،30، وهي تمكن سيطرة قوية على العديد من المعلمات للذبذبات ثيتا في سلوك الفئران. دراسات أخرى أقل مسارات التحقيق وأنواع الخلايا من الدوائر مثل هيبوكامبال فيها التلاعب^38،39،،من^4749،،من^{5051 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} تكشف عن المزيد من آليات لإيقاع ثيتا.

واستخدمت الكهروضوئية-Cre تدق في الفئران الذكور⁵⁹، الأسابيع 10-25 عاماً. كانت الفئران تحت الظروف القياسية في منشأة الحيوان وأبقى في دائرة ضوء/الظلام ح 12. جميع الإجراءات تم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والدولية، وقد وافقت السلطات الصحية المحلية (لانديسامت für Natur، أومويلت und فيربراوتشيرشوتز، نوردراين-فيستفالن).

1-الفيروسية حقن

1. أثناء الإجراء بأكمله، اتبع إرشادات السلامة البيولوجية⁶⁰. ارتداء معطف مختبر وقناع جراحية، هايرنيت، واثنين من أزواج من القفازات.
2. قطع الأنابيب مع مشرط معقم أو المقص بطول متر واحد تقريبا وأدخله في كتلة حامل حقنه من المضخة وإصلاحه.
   1. ملء الأنبوب تماما مع زيت السيليكون باستخدام المحاقن.
   2. التحقق من ما إذا كانت تظهر فقاعات الهواء في الأنبوب. إذا كان يتم ملاحظة فقاعات الهواء، تعبئة الأنبوب مرة أخرى مع النفط.
   3. إصلاح الغطاس إلى كتلة دافع.
   4. ببطء التقدم دافع نحو كتلة حامل حقنه حتى اللمسات غيض المكبس الأنبوب.
   5. إدراج تلميح المكبس في الأنبوب وتلقائياً نقل كتلة دافع إلى الأمام بسرعة بطيئة بتحديد "صب" في إطار الأوامر ومعدل ضخ منخفضة (مثلاً، 500 nL/دقيقة) حتى تصل إلى كتلة حامل حقنه.
3. إعداد إبرة حقن (34 ز).
   1. إزالة لوحة الوصل إبرة مع خفض واضح باستخدام دقة حفر/طاحونة متصل إلى قرص قطع. إذا لزم الأمر، استخدم إبرة لإزالة بقايا معدنية من سطح قطع طازجة.
   2. مؤشر ترابط الأنابيب الشعرية (طول 3-4 سم) عن طريق الإبرة.
   3. الصق الإبرة للأنبوب مع سوبر الغراء.
   4. قم بتوصيل إبرة حقن نهاية الأنبوب، الذي يتصل بالمضخة ميكروسيرينجي.
4. إرفاق الإبرة لصاحب ستيريوتاكسيك.
5. سحب الهواء حتى مرئياً فقاعة هواء في أنبوب شفاف فوق الإبرة.
6. تخدير الماوس مع isoflurane 1.5-3% في الأوكسجين. الانتظار حوالي 2-3 دقيقة، ثم تأكيد أن الماوس هو تماما تخديره بتقييم ردها على السؤال أخمص القدمين. طوال عملية جراحية مراقبة التنفس للحيوان وضبط تركيز isoflurane إذا لزم الأمر.
7. ضع الماوس في الإطار المناظير باستخدام الأشعة باستخدام أصحاب الإذن غير المؤذية.
8. حماية العينين للماوس مع هلام دهن.
9. حقن 0.1 مل ليدوكائين intradermally تحت الجلد الرأس 0.01-1 باستخدام المحاقن مل وقنية حقن ز 26.
10. حلاقة وتطهير رأس الماوس استخدام الحل الإيثانول. ثم البديل الكلورهيكسيدين 2% ثلاث مرات مع الإيثانول لتطهير الموقع الجراحي.
11. تنفيذ شق خط الوسط استخدام مقص حادة وغرامة تسير بين الجزء الخلفي الأذنين إلى مستوى العينين بريجما وامدا مرئية.
12. تنظيف الجمجمة بتطبيق ما يقرب من 50 ميليلتر من كلوريد الصوديوم باستخدام المحاقن وجاف مع نسيج ورقة والنفخ هواء.
13. ضع رأس الماوس عن طريق ضبط مستوى المشبك الآنف دورسو البطني حيث تكون بريجما وامدا على نفس مستوى دورسو البطني (± 0.3 مم).
14. حفر حفرة أعلاه مرض التصلب العصبي المتعدد (AP 0.98 و L 0.5 مم في إشارة إلى بريجما).
15. عند هذه النقطة، تذويب قاسمة الفيروس (ينبغي أن تتضمن على الأقل 2 ميليلتر من AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) لمدة حوالي 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
16. الطرد المركزي قاسمة في 4,000 تقريبا x ز على RT لمدة 1 دقيقة.
17. ماصة 2 ميليلتر للفيروس على قطعة من بارافيلم؛ استخدم الجانب محمية سابقا.
18. غمر غيض إبرة حقن السائل وتسحب بعناية في حوالي 500 nL/دقيقة أثناء مراقبة مستوى السائل. لمنع المص الهواء، وقف الانسحاب قبل الفيروس يتم تناولها تماما. ضبط معدل الانسحاب وفقا للزوجة الحل؛ بمعدل أسرع يمكن تسهيل انسحاب فيروس مع اللزوجة أعلى.
19. تنظيف الإبرة مع نسيج ورقة.
20. تحقق من أن الفيروس هو الوارد في الأنبوب والفيروسات والنفط مفصولة فقاعة هواء. علامة مستوى الفيروس في الأنبوب من أجل التحكم في ما إذا كان الفيروس هي التي غرست بنجاح خلال الحقن.
21. ضع الإبرة أعلاه اوديما وأدخله ببطء في الدماغ عند نقطة الحقن الأولى (AP 0.98، L 0.5 V-5.2، الجانبي 5.5 °).
22. حقن 450 nL الفيروس بمعدل 100-150 nL/دقيقة انتظر 10 دقيقة بعناية تحريك الإبرة حتى 0.1 ملم والانتظار مدة 5 دقائق أخرى.
    1. تحريك الإبرة حقن النقطة الثانية (AP 0.98، L 0.5 V-4.6) وحقن 450 آخر nL في 100-150 nL/دقيقة.
    2. الانتظار مرة أخرى لمدة 10 دقائق قبل أن ينتقل الإبرة حتى 0.1 مم. انتظر 5 دقائق أخرى قبل إزالة الإبرة.
23. خياطة الشق مع خياطة "الحرير الأسود مزين" باستخدام عقده مربعة. حرارة الحيوان مع مصباح أحمر لتسريع الانتعاش. إدارة القائمة والايبوبروفين والمضادات الحيوية (0.3 مل اريسينوم (1:4 في كلوريد الصوديوم عقيمة)) يومي 2-3 أيام بعد الجراحة.
24. قطع الأنبوب فوق علامة تشير إلى مستوى الفيروس. يمكن استخدام الأنبوب لمزيد من الحقن. إعداد إبرة حقن جديدة قبل كل حقنه.
    ملاحظة: هذه الجراحة تستغرق حوالي 1-1.5 ساعة. الحيوان يستيقظ عادة في غضون 5 دقائق بعد الجراحة. الانتظار الحد أدنى الوقت من 6 أسابيع للتعبير محواري كافية ولكن ليس أطول من 5 أشهر قبل تنفيذ عللها المناظير باستخدام الأشعة، حيث تبدأ مستويات التعبير إنقاص حوالي 6 أشهر بعد حقن الفيروس.

2-إعداد الألياف البصرية (الشكل 1A)

1. استخدام الألياف البصرية المتعدد (105 ميكرون الأساسية، الزجاج يرتدون مع السليكا الأساسية، نا 0.22). قطاع 125 ميكرومتر الكسوة الألياف الأساسية استخدام متجرد في الدقيقة بينما يزال مربوطا الألياف إلى التخزين المؤقت الألياف.
2. قص الألياف بطول حوالي 2-3 سم باستخدام سكين الماس.
3. أدخل الألياف في التسليح عصا سيراميك زركونيا (معرف: 126 ميكرومتر). حوالي 0.5-1 ينبغي أن تبرز مم الألياف البصرية من جانب محدب التسليح.
4. باستخدام إبرة، تطبيق قطره واحدة من الغراء الإيبوكسي على كلا طرفي التسليح ولكن ليس على جانبي التسليح. وبدلاً من ذلك، استخدم سوبر الغراء.
5. تسمح الغراء لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
6. البولندية في الجانب المحدب من التسليح استخدام الماس اللف الألياف التلميع الفيلم (3 ميكرومتر الحصى).
7. اختبار الإخلاص لنقل الضوء باستخدام مقياس طاقة ضوئية.
   1. تعيين الطول الموجي على مقياس الطاقة على نفس الموجه بالليزر المستخدمة.
   2. ضع الحبل التصحيح مع تلميح التي تواجه المركز من أجهزة الاستشعار. طاقة الليزر وقراءة الإخراج الخفيفة من مقياس الطاقة. سجل القيمة.
   3. توصيل الألياف البصرية إلى الحبل التصحيح عن طريق التزاوج الأكمام ووضعه مع غيض الألياف التي تواجه المركز من أجهزة الاستشعار. طاقة الليزر وقراءة الإخراج الخفيفة من مقياس الطاقة. سجل القيمة.
   4. حساب معدل انتقال: تقسيم القيمة الثانية بالقيمة الأولى. إذا كان معدل انتقال أقل من 0.5، تجاهل هذه الألياف، وإلا تستخدم لغرس.
   5. اختبار معدل انتقال العدوى لكل من الألياف قبل غرس.
   6. لتجارب لاحقة، ضبط شدة الضوء الناتج من الليزر لأن معدل انتقال العدوى من الألياف البصرية: تعيين إخراج الضوء من طرف الحبل التصحيح إلى 5-15، مقسوماً على معدل انتقال العدوى تحقيق ناتج نهائي خفيفة من طرف الألياف 5-15 ميغاواط.
      ملاحظة: انظر أيضا الرقم ⁶¹ تحضيرا للألياف البصرية.

3-إعداد سلك التنغستن صفائف لطابعات الحجم الكبير التسجيلات (الشكل 1B)

1. الصق عدة (على سبيل المثال 6) 100 ميكرومتر والسليكا أنبوب أدلة بالتوازي مع الجانب sticky قطعة من الشريط. قص قطعة واحدة، حوالي 4-6 مم، لسلك واحد الصفيف الجمعية.
2. مؤشر ترابط فورمفار معزول الأسلاك التنغستن ميكرومتر 45 من خلال أنابيب دليل استخدام الملقط.
3. قطاع ستة معزول المينا غرامة النحاس الترابط الأسلاك (حوالي 5 مم طويل) وسلك تأريض (حوالي 2-3 سم) باستخدام مشرط كشط بعيداً من العزل في كلا طرفي. جندي منهم إلى دبابيس نانوكونيكتور.
4. قم بتوصيل كل سلك الربط سلك التنغستن واحد استخدام قطره واحدة من الفضة الطلاء موصلة، على التوالي. واسمحوا جافة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
5. تطبيق الحد أدنى من الأسمنت لتغطية الأسلاك. لا يتم تطبيق الأسمنت على الأسلاك التنغستن، التي سيتم إدراجها في أنسجة المخ أو في الجزء العلوي من نانوكونيكتور. اسمحوا الأسمنت الجاف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
6. القيام قص زاوي (5-20°) من الأسلاك التنغستن استخدام مقص الفولاذ المقاوم للصدأ صريحا لتمكين غرس موثوقة من الأسلاك أدناه أو أعلاه في المنطقة المتاخمة بطنيا pyramidale الطبقة، حيث السعة ثيتا منخفض جداً للتقدير الدقة الرائعة.
7. دينسولاتي التلميح (حوالي 2 مم) من السلك الأرض باستخدام مشرط كشط بعيداً من العزل. تعامل مع التمويه وبريسولدير.
8. الاختيار المحتملة عبر محادثات بين أقطاب رقمية باستخدام متعدد. للقيام بذلك، الاتصال دبابيس رابط المتعدد، الذي يجب أن يتم تعيين إلى وضع قياس المقاومة. تحقق من تركيبات عشوائية من القنوات؛ قراءة على المتعدد أدناه 5 MΩ يشير إلى كبيرة عبر الحديث.
9. فحص مقاومة كل القطب الأسلاك في استخدام المالحة مقياس مقاومة. قيم مقاومة نموذجية أقل من 100 kΩ.
10. لتسهيل غرس، الصق أحد الألياف البصرية إلى الصفيف سلك ذلك غيض الألياف على مستوى السلك أقصر ونصيحة الألياف في القرب، ولكن عدم لمس الأسلاك التنغستن. الاحتفاظ زاوية الألياف صغيرة بقدر الإمكان للحيلولة دون تلف الأنسجة أثناء غرس.
    ملاحظة: انظر أيضا الرقم ⁶² لتلفيق صفائف سلك التنغستن.

4-ستيريوتاكسيك عللها

1. أداء الأعمال التحضيرية كما هو موضح في الخطوات 1، 6-1، 13.
2. إزالة النسيج الضام من الجزء العلوي من الجمجمة، ودفع أسفل عضلات الرقبة جيدا بما يقرب من 2 ملم لمنع العضلات القطع الأثرية أثناء التسجيل.
3. تنظيف الجمجمة باستخدام المحاليل القطن-نصيحة والمالحة، وحفر ثقوب 4 (2 في الجبهة) و 2 أعلاه المخيخ، قطرها 0.8 ملم مكان مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ العظام (00-96 x 1/16) للأرض، وتحقيق الاستقرار في عملية الزرع (الشكل 1). ضع المسمار الأرض، متصلاً بأحد الأسلاك النحاسية (حوالي 2-3 سم طول) أعلاه المخيخ.
4. تغطية الأرضية-المسمار تماما مع الأسمنت لمنع العضلات التحف خلال التسجيلات الكهربية. بناء أسمنت حلقة ربط جميع المسامير (الشكل 1E).
5. أداء اوديما أعلاه على غرس الجانب (الحصين، AP-1.94، 1.4 لتر، 1.4 V إشارة إلى بريجما). تطبيق حوالي 5 ميليلتر من كلوريد الصوديوم العقيمة على سطح أنسجة المخ.
6. انخفاض ببطء سلك الصفيف باستخدام ستيريوتاكسيس في اوديما. لتسجيلات الوحدوي، زرع مجس سيليكون بدلاً من أسلاك صفيف⁶³؛ منعا للتحف الخفيفة أوبتويليكتريك، زرع الألياف البصرية بشكل منفصل في قرن آمون مع تلميح الألياف تواجه عدم مباشرة التحقيق (الشكل 1 --أنا). للتحقيق في تنسيق الرائعة بين نصفي الكرة الأرضية، زرع ألياف بصرية إضافية في منطقة CA1 هيبوكامبال contralateral.
7. تطبيق حوالي 5 ميليلتر من زيت الشمع السائل الحار/البارافين، يسخن عند 70 درجة مئوية، مع حقنه فوق موقع زرع لحماية أنسجة المخ.
8. تطبيق الأسمنت حول الصفيف الأسلاك وتغطية الجمجمة بالأسمنت.
9. تطبيق قطره واحدة من التمويه على أسلاك بريسولديريد والمراجع الأرض والسلك بريسولديريد متصل بالمسمار الأرض على سبيل المثال باستخدام إبرة، والصمامات الأسلاك باستخدام ماكينة لحام.
10. تغطية السلك كامل الأرض بالأسمنت.
11. إدارة 0.3 مل اريسينوم (1:4 في العقيمة كلوريد الصوديوم) والقائمة والايبوبروفين (5 ملغ/مل) بعد الجراحة، وعلى الأقل بعد يومين. عادة ما يستيقظ الماوس ضمن 15 دقيقة بعد عملية جراحية. حرارة الحيوان مع مصباح أحمر لتسريع الانتعاش.
12. مراقبة وزن الماوس يوميا في الأسبوع الأول بعد الجراحة، أو حتى الوزن مستقر. الوزن يجب أن لا تتجاوز 10% من وزن الماوس المسجلة قبل الجراحة. للإسراع في تحقيق الاستقرار في الوزن، توريد الماوس مع الغذاء الرطب والحليب المكثف خلال الأيام الأولى التالية للجراحة.
13. لتسجيل النشاط الخلوي هيبوكامبال خلال الرائعة، زرع مجس سيليكون في قرن آمون (AP-1.94، 1.4 لتر، 1 الخامس، مع تخفيض اللاحقة) كما هو موضح في الرقم ⁶² (الشكل 1 --أنا). زرع الألياف البصرية في الحصين في AP-3، 1.4 لتر، V 1.6، 39 ° والذيلية روسترال. زرع ألياف بصرية إضافية في مرض التصلب العصبي المتعدد (AP +0.98، L 1، V 3.9, 15 ° الجانبي) إذا كان المطلوب هو تنشيط خلية سوماتى.

5-أوبتوجينيتيك التحفيز والحصول على البيانات الكهربية

1. روض الماوس لتسجيل الإعداد (مثلاً، دورات 15 دقيقة، ودورات 1-2 يوميا لمدة 3 أيام). دراسة سلوك الحيوان قبل البدء بالتجارب الأولى. إذا كان الماوس يتحرك في الدائرة، استكشاف البيئة، واستنشاق، وأداء ريرينجس، و ما إلى ذلك، تبدأ الدورة التجريبية الأولى.
2. ضع الماوس في دائرة مألوفة في غياب الحيوانات الأخرى في نفس الغرفة.
3. إرفاق الصمام المرحلة الرأس باستخدام الشريط اللاصق لتتبع موقف الحيوان. تأكد من أن ضوء الصمام هو الملتقطة بواسطة الكاميرا طوال الفترة أن الحيوان هو استكشاف في دائرة التسجيل قبل بدء التجارب. تسجيل في الظلام من أجل تعقب على ضوء الصمام. ضع كاميرا أعلاه دائرة التسجيل.
4. تحقق من إخراج الضوء من الحبل التصحيح. تقدير ناتج الضوء من طرف الألياف بعد اتصال تبعاً لمعدل انتقال العدوى من الألياف مزروع. ضمان أن الإخراج الخفيفة من غيض الألياف ما بين 5-15 ميغاواط، لتمكين الرائعة موثوق بها.
5. قم بتوصيل المضخم هيدستاجي موصل مزروع مزمن. قم بتوصيل سلك التصحيح اليافي الألياف هيبوكامبال مزروع مزمن لتجارب التحفيز أوبتوجينيتيك. في تجارب التحفيز الخفيفة التحكم، الاتصال الألياف البصرية التسليح دمية متصلة بسماعات الرأس.
6. ضع الماوس في دائرة التسجيل.
7. قم بفتح البرنامج للتحكم في مولد حافزا لإنشاء البروتوكول التحفيز.
8. قم بتحديد القناة الذي يتحكم بالليزر والعسف 473 شمال البحر الأبيض المتوسط. في الصف الأول أدخل 3,000 mV (العمود 1)، الوقت 30 مللي ثانية (العمود 2)، mV القيمة 0 (العمود 3)، وقت 112 مرض التصلب العصبي المتعدد (العمود 4)، صف 840 تكرار، والمجموعة 1 تكرار، لإنشاء بروتوكول 2 دقيقة من التحفيز 7 هرتز مع نبضات طويلة 30 مللي ثانية. ضبط المدة الزمنية في العمود الرابع وعدد التكرار الصف إذا كان مطلوباً التحفيز على تردد آخر أو مدة مختلفة. ميغاواط حدد 0 الصف الثاني في (العمود 1)، الوقت ح 500 (العمود 2)، كرر الصف 1، والفريق أكرر 1، لضمان أن الليزر هو يجري مغلقا بعد أن تم إنهاء بروتوكول التحفيز.
9. انقر فوق "ملف > حفظ باسم" وحفظ الملف باسم المطلوب.
10. أؤكد أن مشجعا TTL إخراج تحريك الليزر متصلاً بالمجلس "الوشق الرقمية" التناظرية الإدخال لمزامنة الحصول على الكهربية والبيانات أوبتوجينيتيك.
11. بدلاً من ذلك، تنظيم باراميتريكالي مدى تغير التردد التذبذب ثيتا، تطبيق القطارات من نبضات الضوء في اختلاف النبض بين الفواصل الزمنية، مع فترات بعد توزيع غاوسي. تعديل تشتت نبض بين الفواصل الزمنية لبروتوكولات مختلفة، مثلاً، من الخطوة²من 3.2 إلى 15.1 ms. وتنطبق هذه البروتوكولات لتوليد الحقبات ثيتا مع تقلب مختلفة من تواتر ثيتا (الشكل 6).
12. قم بفتح البرنامج لنظام التسجيل. انقر فوق "ACQ" للحصول على "تفصيل" لتسجيل. الانتظار قبل البدء بتحفيز الضوء لتسجيل سلوك خط الأساس (مثلاً، 2 دقيقة لاسترداد سرعة خط الأساس أو 30 دقيقة لاستخراج حقول الأساس للمكان).
13. قم بفتح البرنامج للتحكم في مولد التحفيز. انقر فوق "ملف > فتح" وقم بتحديد الملف البروتوكول الاختيار. انقر فوق "تحميل وابدأ" للبدء في تحفيز الضوء.
    ملاحظة: يمكن مسح التجربة، والتحفيز بدأت عن طريق التحكم عن بعد؛ ويستثنى من ذلك تأثير وجود المجرب على سلوك الحيوان. حسب هدف الدراسة، يمكن بدأت التحفيز وإنهاؤها خلال سلوكيات معينة.

6-نهج موحد أوبتوجينيتيك الرائعة وتثبيط الخاصة بالإسقاط من إخراج هيبوكامبال

1. التعبير عن ChR2 في جابايرجيك مرض التصلب العصبي المتعدد الخلايا الفلطائية الضوئية-Cre الفئران، كما هو موضح في المقطع 1.
2. وباﻹضافة إلى ذلك، ضخ ما مجموعة 2.4 ميليلتر من CamKIIα التابعة هالورهودوبسين (eNpHR3.0، AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) في نصفي هيبوكامبال الظهرية (AP-1.7؛ L ± 1.05؛ V-2.05-و 1.4 مم؛ AP-1.7؛ L ± 1.7؛ V-2.05 و-1.55 مم؛ AP-2.3؛ L ± 1.5؛ V-2.2-و 1.3 مم؛ AP-2.3؛ L ± 2.2؛ V-1.65-و 2.45 مم).
3. تسمح 6 أسابيع وقت التعبير.
4. زرع مجموعة سلك تنغستن مع الألياف البصرية في منطقة CA1 هيبوكامبال، كما هو موضح في القسم 4. بالإضافة إلى ذلك، زرع الألياف البصرية على الصعيد الثنائي في حاجز الأفقي (LS، ل 0.25 V، AP 0.1 مم-2.250، ووكالة اسوشييتد برس 0.5 لتر-0.3، V مم-2.70).
5. القيام بتجارب الرائعة ثيتا أوبتوجينيتيك كما هو موضح في الخطوات 5.4 5.5.
   1. لتثبيط متزامنة هيبوكامبال الإخراج LS، يولد جيل تحفيز بروتوكول: مثلاً، يؤدي ظهور قناة المخرجات متصلة s الليزر 15 والعسف نانومتر 593 مع نبض مستمر دائم في المجموع 45 ق، قبل تحريك الإخراج البقول إلى 473 نانومتر الليزر والعسف.
   2. قم بتوصيل كل الألياف في LS عبر الحبال التصحيح استخدام مقرنة الألياف بصرية لليزر والعسف نانومتر 593 ألياف المتعدد.
   3. بدء التسجيل وتحميل وتشغيل بروتوكول التحكم في توليد الحافز.

7-معالجة البيانات

1. تحويل الإشارات الكهربية ووضع بيانات التعقب مع إدارة البيانات العصبية (ND) إلى صيغ dat. و.pos، على التوالي⁶⁴.
2. الحصول على طابعات الحجم الكبير تصفية تمرير المنخفضة وأسفل-أخذ العينات من إشارة واسعة النطاق لهرتز 1,250 باستخدام مدير ND⁶⁶.
3. في كل تسجيل، حدد القناة مع السعة القصوى ثيتا ذبذبات (باستخدام نيوروسكوبي)¹⁹.
4. الكشف عن الطوابع الزمنية نبضات الليزر والحقبات التحفيز لعتبة الكشف عن خوارزمية (استخدام MATLAB الدالة findpeaks.m أو ما شابه ذلك)¹¹.
5. لاستيراد ملف.dat في برنامج تحليل بيانات المتعددة القنوات، انقر فوق "ملف > استيراد"، حدد "ملفات ثنائية" كنوع البيانات، وحدد الملف.dat. في مربع الحوار تكوين، قم بإدخال العدد الصحيح من القنوات ومعدل أخذ عينات هرتز 1,250، انقر فوق "موافق"، وحفظ كملف.smr. ارسم أطياف الطاقة عن طريق تحديد "تحليل > جديد نتيجة عرض > بوويرسبيكتروم". في الإعدادات، قم بتحديد القناة مع السعة ثيتا أعلى وحجم الاتحاد الفرنسي للتنس 16,384، انقر فوق "جديد"، وتعرف بأنها "وقت بدء" بداية العصر التحفيز واعتبارها "وقت الانتهاء" نهاية عصر التحفيز، وانقر فوق "عملية".
6. حساب الدقة الرائعة كنسبة كثافة الطاقة التراكمي الطيفي (PSD) ضمن نطاق التردد التحفيز أوبتوجينيتيك (التحفيز تردد ± 0.5 هرتز)، إلى مديرية الأمن العام التراكمي في الفرقة ثيتا (5-12 هرتز) مع أسلوب مولتيتابير (شمال غرب = 3، حجم الإطار 8,192) للحقبات s 10 (مثلاً، أدوات < http://chronux.org/>).
7. استبعاد الحقبات تسجيل ذروة مديرية الأمن العام السائد فيها ≤ 5 هرتز من التحليل (العهود غير ثيتا، استخدام MATLAB الدالة find.m).
8. ارسم نقطية أطياف الطاقة طابعات الحجم الكبير لجميع الأزمان المسجلة وفقا للدقة الرائعة محسوبة (باستخدام MATLAB وظائف sortrows.m و pcolor.m). تحميل أطياف الطاقة والرائعة الإخلاص بواسطة النقر فوق "> فتح ملف"، تخزين تلبيتها، متغير "نوع الطاقة" = sortrows(In,1)؛ pcolor(Power(:,2:end)).

ويتضح استهداف ChR2 للخلايا جابايرجيك في مرض التصلب العصبي المتعدد كما هو موضح في المقطع 1 في الشكل 2 ألف. أوبتوجينيتيك الحث على محاور عصبية خلايا جابايرجيك مرض التصلب العصبي المتعدد في الحصين الظهرية عبر ألياف بصرية التي يتم زرعها فوق منطقة CA1 انتراينس الذبذبات ثيتا في تواتر الحافز في عن (الشكل 2) فضلا عن كونترالاتيرال نصف الكرة الأرضية (الشكل 2). يمكن أن يكون أكثر أو أقل كفاءة العالق الذبذبات ثيتا بتنشيط أوبتوجينيتيك (الشكل 3 ألف)، فعالية الذي كان يحسب لكل عصر التسجيل ثيتا نسبي السلطة طابعات الحجم الكبير حول تواتر التحفيز، أي الدقة الرائعة (الشكل 3B). الدقة الرائعة أعلاه 0.3، أيأعلى من التسجيلات الضوء قبالة عفوية، لوحظ في حوالي 80% الأزمان تسجيل. أوبتوستيموليشن ترددات غير ثيتا كان أقل فعالية (الشكل 3).

صراحة أيوالتلاعب حدودي بالذبذبات ثيتا التردد يرافق التغيرات الناشئة من الانتظام ثيتا: الانتظام الزمني من السعة وتردد الذبذبات ثيتا زاد خلال العهود مع ارتفاع الدقة الرائعة. يمكن أيضا تنظيم استقرار ذبذبات باراميتريكالي بواسطة تطبيق القطارات من نبضات الضوء، الفترات التي تتبع توزيعات الضبابي مع تشتت مختلفة (الشكل 4).

أوبتوجينيتيك السيطرة على تردد الذبذبات القضاء على الترابط بين ثيتا التردد وسرعة التشغيل، باﻻتفاق مع مراقبة التردد عن طريق مرض التصلب العصبي المتعدد بترتيب تصاعدي أفيرينتس أثناء الحركة (الشكل 5A). كما فعل أوبتوستيموليشن الذبذبات ثيتا خلال الجمود (الشكل 5 (ب)). مراحل تفضيلية إطلاق النار سجلت في منطقة CA1 الخلايا الهرمية المفترضة، وإينتيرنيورونس لم تتغير بالنسبة إلى التذبذب ثيتا أوبتوجينيتيكالي العالق عند مقارنتها بعفوية ثيتا (الشكل 6).

لدراسة مساهمة الحصين لمسار الحاجز الأفقي في التنظيم ثيتا بوساطة من الحركة، ونحن أوبتوجينيتيكالي إعاقة هذا المسار. وأعرب هالورهودوبسين (eNpHR3.0) على الصعيد الثنائي في الخلايا الهرمية هيبوكامبال (الشكل 7 أ)، بينما أعرب ChR2 في الخلايا جابايرجيك MS كأعلى والذبذبات ثيتا أوبتوجينيتيكالي العالق (الشكل 7). الرائعة ثيتا خفض تقلب لتشغيل السرعة ولكن ليس عندما أعاق الحصين إلى المسار LS (الشكل 7).

رقم 1: رسم توضيحي للألياف البصرية واقطاب والجراحة- (أ) رسم توضيحي الألياف البصرية. (ب) رسم توضيحي لمجموعة أسلاك ملتصقاً ألياف بصرية لتسجيل هيبوكامبال طابعات الحجم الكبير خلال الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال. (ج) لتسجيل النشاط الخلوي هيبوكامبال، شنت تحقيق سيليكون على microdrive. (د) يتم وضع مسامير مصغرة في الجمجمة. يتم بريسولديريد الأسلاك النحاسية للمسمار أرضية ومرجعية قبل وضعها فوق المخيخ. يتم تطبيق الأسمنت (ه) لتغطية وربط المسامير. دائرة زرقاء العلوي يشير إلى حيث أجرى في اوديما لغرس مسبار سيليكون. دائرة زرقاء السفلي يشير إلى حيث أجرى في اوديما لغرس هذه الألياف البصرية في قرن آمون. الألياف البصرية (F) واحد هو مزروع في زاوية والذيلية روسترال لاستهداف المنطقة CA1 هيبوكامبال. ألياف بصرية ثانية يمكن أن يكون مزروع في حاجز وسطى إذا كان المطلوب هو تنشيط الخلية سوماتى (اختياري). (ز) السيليكون مسبار يخفض فقط فوق منطقة CA1 هيبوكامبال. (ح) هي عزز حدود microdrive وموصل للزرع والأرض، وهي ملحوم الأسلاك مرجع. (أنا) النحاس مش هي التي شيدت لتطويق عملية الزرع وتكون بمثابة قفص فاراداي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: التحضير للرائعة ثيتا هيبوكامبال أوبتوجينيتيك- وأعرب ChR2 (A) في الخلايا الكهروضوئية+ الحاجز الآنسي في الفئران الكهروضوئية-لجنة المساواة العرقية (المخطط العلوي). ويؤكد fluorescence مشرقة في مرض التصلب العصبي المتعدد (1، 2) التعبير بناء ناجحة في سوماتى. ألياف مرض التصلب العصبي المتعدد المشروع عن طريق فورنيكس (f) وفيمبريا (وأي فأي) الحصين (3-6)؛ هيئة مكافحة الفساد: commissure الأمامي؛ الجزء الأمامي. المحاسب: نواة الجزء الأفقي من الفرقة قطري؛ أو: oriens الطبقة. هو مزروع الألياف البصرية لتحفيز أوبتوجينيتيك مع الضوء الأزرق فوق الطبقة الهرمية لمنطقة هيبوكامبال CA1 (المخطط السفلي). تغيير حجم أشرطة: 500 ميكرومتر (صور 1، 3، 4) و 50 ميكرون (صور 2، 5، 6). (ب) "طابعات الحجم الكبير هيبوكامبال" خلال الذبذبات ثيتا عفوية (يسار) و 7 هرتز (الأوسط) أو 10 هرتز (يمين) أوبتوجينيتيك الرائعة. خطوط زرقاء تشير إلى الإطارات الزمنية للتطبيق الخفيفة. ملاحظة في مرحلة إعادة تعيين بواسطة نبض الضوء المبين سهم. ملاحظة مغلفات غاما خلال عفوية ومجرور ثيتا، مؤشرا على إيقاع ثيتا الفسيولوجية. المرحلة نقض بين الطبقة أورينس (شارع أو.) وأيضا الحفاظ على طبقة رادياتوم (شارع rad.) أثناء الرائعة. الرائعة (ج) موثوق بها خلال عن (قطع العلوي)، فضلا عن كونترالاتيرال (قطع أقل) التحفيز أوبتوجينيتيك. مخططات توضح مواقف الألياف فيما يتعلق بمواقف الأقطاب. وترد المثال طابعات الحجم الكبير آثار خلال ثيتا، وتطبيق نبضات الضوء في الوسط. على اليمين، السلطة أطياف هيبوكامبال طابعات الحجم الكبير خلال إشارتكم والتحفيز contralateral مرمزة وفقا لتواتر التحفيز. وقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: إخلاص الرائعة ثيتا هيبوكامبال أوبتوجينيتيك- (أ) المثال هيبوكامبال طابعات الحجم الكبير آثار خلال الرائعة منخفضة وعالية الدقة. (ب) الطاقة الطيفية كثافة 10 s الحقبات خلال ثيتا عفوية، مع الصفوف أمر يؤدي التردد ثيتا (يسار)، وخلال 7 هرتز (الأوسط) والتحفيز أوبتوجينيتيك (يمين) 10 هرتز، مع الصفوف أمر وفقا للدقة الرائعة. مثال على كل منها طاقة الأطياف (المشار إليها سهم) المرسومة أعلاه. ملاحظة الدقة الرائعة موثوق بها عبر الأزمان. ويرد على الحق، الاحتمال التراكمي للدقة الرائعة للترددات ثيتا. (ج) الرائعة يتطلب تحفيز إيقاعي ثيتا. يمكن العالق نشاط الشبكة هيبوكامبال بنجاح باستخدام ترددات بين 6-12 هرتز. ترددات أقل (مثلاً، 2 أو 4 هرتز) أو أعلى الترددات (مثلاً، 20 هرتز) الرائعة لا يعول عليها. وقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: حدودي التلاعب بانتظام الذبذبات ثيتا. تم تطبيق التحفيز (A) في ترددات مختلفة داخل نطاق ثيتا مع تردد متوسط 7.8 هيرتز عقب توزيع غاوسي. الانحراف المعياري للفواصل بين نبض زاد عبر البروتوكولات من σ = 3.19 إلى σ = 15.09. وفي المجموع، ولدت 11 البروتوكولات وتطبيقها، مع مجموع مدة العصر التحفيز من 1 دقيقة كل. من هؤلاء، تظهر التوزيع الاحتمالي 5 بروتوكولات على الجانب الأيمن الشكل. يتم رسم كثافة الطاقة الطيفية ضمن نطاق من 1-14 هرتز من طابعات الحجم الكبير هيبوكامبال أثناء تطبيق البروتوكولات الخاصة بكل منها في منتصف الشكل. يتم توضيح احتمالات فترات ثيتا أثناء تطبيق البروتوكولات الخاصة بكل منها على الحق. (ب) الفرق التطبيقية نبض بين فترات زمنية تحدد فرق فترة ثيتا المتزامنة (r بيرسون = 0.94، p = 0.0002). (ج) العلاقة بين تغير السعة ثيتا والنبض بين الفاصل الزمني (r بيرسون = 0.61، ف = 0.08). وقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 70. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: يحدد أوبتوجينيتيك ثيتا الإيقاعي الرائعة هيبوكامبال طابعات الحجم الكبير أثناء السلوك. (أ) تحديد التواتر التحفيز أوبتوجينيتيك تواتر ثيتا أثناء الحركة. ومن ثم، لا تؤثر أفيرينتس المتصلة بسرعة تواتر ثيتا هيبوكامبال، ونتيجة لذلك، سرعة لا يرتبط مع التردد ثيتا (الأزرق) كما خلال عفوية ثيتا (أسود). وترد البيانات يعني ± s.e.m. (ب) أثناء اليقظة الهادئة، ثيتا هيبوكامبال يمكن الحصول في غياب الحركة. هيبوكامبال آثار طابعات الحجم الكبير قبل وأثناء الرائعة الناجحة هي المبينة أعلاه، وفيما يلي مثال على آثار السرعة المسجلة خلال الرائعة (التتبع الحمراء يناظر التتبع طابعات الحجم الكبير هيبوكامبال المبينة أعلاه). علامة زرقاء الإطارات الزمنية نبضات خفيفة التحفيز. وقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: هيبوكامبال النشاط الخلوي أثناء ثيتا الرائعة. (أ) النشاط الخلوي تم تسجيلها باستخدام سيليكون المسابر (مخطط). إينتيرنيورونس واحد والخلايا الهرمية كانت معزولة وحددت وفقا للموجي الخاصة بهم. يظهر هنا هو الموجي المتوسط (الوسط) والسيارات-كوريلوجرام خلية المثال الهرمية معزولة. (ب) مرحلة التصريف المفضل للخلايا الهرمية (Pyr) لم يكن مختلفاً خلال عفوية (في ن الأسود، = 29 من الخلايا العصبية) وأوبتوجينيتيكالي العالق (في الزرقاء، n = 30) ثيتا (p = 0.79). (ج) الموضح هنا هو السيارات-كوريلوجرام (يسار) ومرحلة إطلاق تفضيلية من إينتيرنيورون إطلاق النار السريع خلال عفوية وأوبتوجينيتيكالي العالق ثيتا. أدناه على إيقاع طابعات الحجم الكبير هيبوكامبال المقابلة خلال عفوية (يسار) ومجرور ثيتا (يمين). (د) مرحلة التصريف المفضل إينتيرنيورونس إطلاق النار السريع لم يكن مختلفاً خلال عفوية (باللون الأسود) وأوبتوجينيتيكالي العالق (في الزرقاء، n = 28 من الخلايا العصبية) ثيتا (ف = 0.97). ويظهر متوسط السيارات-كوريلوجرام على اليسار. (ﻫ) متوسط السيارات-كوريلوجرام شارع أورينس الخلايا. (و) مرحلة التصريف المفضل من شارع أورينس إينتيرنيورونس لم يكن مختلفاً خلال عفوية (أسود) وأوبتوجينيتيكالي العالق (الأزرق، n = 10 من الخلايا العصبية) ثيتا (ف = 0.56). رسوم بيانية لمراحل التفريغ المفضل تظهر على اليمين. لم تتأثر الإشعال (ز) متوسط معدلات ثيتا الرائعة في الخلايا الهرمية (ف = 0.98)، إينتيرنيورونس إطلاق النار السريع (p = 0.96) أو شارع أورينس إينتيرنيورونس (ف = 0.85). وقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 7: مزيج من ثيتا هيبوكامبال الرائعة وأوبتوجينيتيك تثبيط هيبوكامبال subcortical الناتج من خلال LS. وأعرب (A) eNpHR3.0 (هالورهودوبسين) في الخلايا الهرمية هيبوكامبال (المخطط العلوي). وأكد التعبير الناجح بناء fluorescence مشرقة في سوماتا في قرن آمون (صور العلوي) ومحاور عصبية في LS (الصور أقل). كانت مزروع الألياف البصرية على الصعيد الثنائي أعلاه ليرة سورية (مخطط السفلي). تغيير حجم أشرطة: 500 ميكرومتر (الصور على اليسار)، 50 ميكرومتر (الصور على اليمين). ثيتا هيبوكامبال (ب) هو العالق بنجاح خلال تثبيط الحصين إلى مسار ليرة سورية. يظهر هنا كثافة الطاقة الطيفية لتحفيز الضوء الأزرق 9 هرتز خلال تثبيط ناتج. (ج) تثبيط مسار الإخراج subcortical هيبوكامبال الرئيسية يمنع الآثار من ثيتا هيبوكامبال الرائعة بسرعة. يظهر هنا هو انخفاض في سرعة تقلب على أوبتوجينيتيك الرائعة (أبيض بار بحدود زرقاء)، مع غائب على تثبيط متزامنة من الحصين إلى مسار ليرة سورية (شريط أصفر بحدود زرقاء). ويرد كل منهما خط متوسط السرعة على اليسار. وقد تم تعديل هذا الرقم من الرقم 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.