مقالة منهجية

التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

DOI:

10.3791/57354

⸱

يوليو 1, 2018

 ,  , 
1College of Life Sciences, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير طريقة جديدة للتعبير عن المشترك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات للتغلب على صعوبات الطرق التقليدية. ويستفيد من استخدام بلازميد تعبير واحد يحتوي على بروتين مستقلة وظيفيا متعددة معربا عن أشرطة الكاسيت لتحقيق التعبير البروتين المشارك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معلومات حول localization(s) سوبسيلولار الزمانية المكانية للبروتين أمر بالغ الأهمية لفهم وظائفها الفيزيولوجية في الخلايا. البروتينات الفلورية وجيل من البروتينات الفلورية الانصهار بعنف استخدمت كأداة فعالة لتصور مباشرة التعريب البروتين والديناميات في الخلايا. أنها مفيدة بشكل خاص لمقارنتها مع علامات عضية المعروفة بعد التعبير المشترك مع البروتين للفائدة. ومع ذلك، النهج الكلاسيكي للتعبير البروتين المشارك في النباتات عادة ما تنطوي على عدة التعبير المستقل والبلازميدات، وبالتالي السلبيات التي تشمل التعبير المشارك منخفضة الكفاءة وتباين مستوى التعبير، وحان الوقت النفقات في عبور الوراثية والفحص. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة قوية ورواية للتعبير المشترك من البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة في النباتات. أن يتغلب على أوجه قصور الأساليب التقليدية باستخدام ناقل تعبير واحد يتكون من عدة أشرطة الكاسيت وإذ تعرب عن شبه مستقلة. كل كاسيت التعبير البروتين يحتوي على عناصر التعبير البروتين الفنية الخاصة به، ولذلك يمكن تعديله مرونة لتلبية الطلب التعبير متنوعة. كما أنها سهلة ومريحة لأداء الجمعية والتلاعب بالحمض النووي وشظايا في بلازميد التعبير باستخدام فعل أمثل في خطوة واحدة دون الهضم إضافية وخطوات عملية ربط. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع التكنولوجيات الحيوية-التصوير الفلورسنت البروتينات المشتقة الحالية والتطبيقات، مثل الحنق وبيفك. كعملية التحقق من الأسلوب، استخدمنا هذا النظام الجديد إلى مستقبلات الفرز رغوي المشارك إكسبريس فلوريسسينتلي تنصهر وبروتينات الغشاء الناقل الافرازية. وتبين النتائج أن تعريب سوبسيلولار منظور هي نفسها كما هو الحال في دراسات سابقة بتعبير عابر والتحول الوراثي في النباتات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك كأدوات مفيدة لدراسة الديناميات داخل الخلايا والتعريب سوبسيلولار وكذلك فهم الوظائف الفسيولوجية وعمل آليات1،2، 3 , 4-أنه مفيد خصوصا للبروتينات مراسل عضية المعروفة إكسبرس المشارك مع البروتين في السؤال لتوضيح أفضل الأساس المنطقي الزمانية المكانية وتوزيع الدالة داخل منظومة اندوميمبراني في خلايا4 , 5 , 6 , 7 , 8.

ويمكن التعبير عن بروتين انصهار نيون تشيميريك في النباتات عن طريق التعبير عابرة والتحول الوراثي المستقرة، التي لديها مزايا كل منهما وقيود9،،من1011. تعبير عابر من البروتين هو نهج مناسب يتضمن biolistic-القصف، البولي إثيلين غليكول (شماعة)-، أو بوساطة انهانسر تعبير عابر الحمض النووي في بروتوبلاستس و المتبعة-وساطة التسلل إلى أوراق خلايا نباتية سليمة، كما هو مبين في الشكل 1 ألف، ب12،13،14،،من1516. بيد أن التعبير المشارك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في خلية نبات واحدة يتطلب مزيج البلازميدات التعبير مستقلة عدة. وهكذا، عيوب استخدام البلازميدات متعددة للتعبير البروتين المشارك في النباتات أدنى مستويات التعبير المشترك بسبب فرصة والبلازميدات عدة في نفس الوقت إدخال نفس الخلايا عند بلازميد واحد، بالمقارنة مع انخفاض كبير اختلافات مستويات التعبير البروتين تسبب بمقدار حسيب عشوائي لكل أنواع بلازميد نقله إلى خلية17،18. وبالإضافة إلى ذلك، أنها تمثل تحديا من الناحية التقنية ﻹدخال عدة التعبير المستقل والبلازميدات مفردة المتبعة للبروتين المشارك التعبير9،،من1011. ولذلك، المتبعة-وساطة البروتين يترك التعبير عابر بتسلل التبغ فقط قادرة على التعبير عن بلازميد واحد في كل مرة، كما هو مبين في الشكل 1 باء. في المقابل، جيل نباتات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار عادة ما يتحقق عن طريق المتبعة التي يحمل ناقل ثنائي تحول. ومع ذلك، ناقل ثنائي أن يتوسط في نقل الجينات والإدراج في جينومات النباتات فقط قادرة على التعبير عن انصهار فلورسنت مفردة بروتين (الشكل 1B)9،،من1012. توليد نبات المعدلة وراثيا التي تعبر عن العديد من البروتينات الفلورية تشيميريك في وقت واحد يتطلب جولات متعددة من عبور الوراثية والفحص، التي يمكن أن تتخذ من أشهر إلى سنوات اعتماداً على عدد الجينات لتكون المشترك أعرب.

توظيف أبلغ تعبير واحد متجه للمشارك التعبير متعددة من البروتينات في النباتات قبل عدة السابقة الدراسات19،،من2021. ومع ذلك، جولات متعددة من الهضم الأنزيمي وربط الحمض النووي من جزيئات الحمض النووي وناقلات العمود الفقري مطلوبة عادة لتوليد بلازميد النهائي للبروتين المشارك أو تعبير الإفراط. وهنا، قمنا بتطوير طريقة جديدة وقوية للتعاون معربا عن البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة في النباتات. وهي طريقة كفاءة عالية ومريحة ليحقق متعددة البروتين التعبير المشارك في النباتات للتعبير عابرة على حد سواء وتحول مستقر في طريقة العريقة. ويعمل ناقل واحد يحتوي على عدة شرائط التعبير البروتين مستقلة وظيفيا للبروتين المشارك التعبير ومما يتغلب على عيوب الأساليب التقليدية. وعلاوة على ذلك، وهو نظام متعدد الاستخدامات بدرجة في الحمض النووي الذي تحقق بفعل خطوة واحدة بسيطة الأمثل دون اتخاذ خطوات إضافية لهضم الحمض النووي وربط التلاعب والجمعية. ويتضح مبدأ العمل في الشكل 2. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع النهج الخلوية والجزيئية والكيمياء الحيوية الحالية التي تعتمد على البروتينات تشيميريك الانصهار الفلورسنت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-التمهيدي تصميم الاستراتيجية وتضخيم الحمض النووي

  1. تصميم الإشعال للاستنساخ الجزيئي من شظايا من الحمض النووي. وتتألف كبسولة تفجير تسلسل الجين ملزمة محددة bp 20 و 20 إلى 25 bp 5 '-نهاية عبء متواليات، وهي تسلسل متداخلة مكملة المتاخمة جزيئات الحامض النووي (انظر الجدول 1 على سبيل المثال).
    ملاحظة: الجمعية العامة اللاحقة للحمض النووي كل الأجزاء، الربط بين الأشرطة تعبير البروتينات المختلفة، والتكامل مع كل ناقل التعبير النهائي يتوقف على اعتراف متواليات متداخلة المتاخمة.
  2. تضخيم شظايا من الحمض النووي، بما في ذلك المروج ومراسل الفلورسنت والجينات المستهدفة والمدمر، اللازمة لتشييد شرائط التعبير البروتين شبه المستقلة ردود الفعل PCR القياسية مع أصدقائهم الإشعال المقابلة وعالية بوليميريز الإخلاص.
    ملاحظة: القوالب المستخدمة في هذه الدراسة لتضخيم الحمض النووي مستمدة من الدراسات السابقة15،،من2223. درجة الحرارة انلينغ وتمديد الوقت ردود الفعل PCR هي التمهيدي والجينات التابعة.

2-الحمض النووي جزء الجمعية وتشييد البروتين التعبير أشرطة الكاسيت

  1. فحص جودة منتجات PCR الجولة الأولى بالتفريد الحمض النووي وتحديدها كمياً بجهاز المطياف الضوئي. التحقق من ما إذا كان الحمض النووي التدهور والتلوث قد حدثت قبل 1% [اغروس] هلام التفريد. ينبغي أن يكون OD260/OD280 منتجات PCR بين 1.6 و 1.8.
  2. مزيج مختلف شظايا من الحمض النووي (0.05-0.1 بمول لكل جزء) في أنبوب بكر جديدة إلى وحدة تخزين نهائي من 5 ميليلتر.
    ملاحظة: جزيئات الحمض النووي مزيج مصممة للبروتين نفس التعبير الكاسيت معا في أنبوب PCR واحد. تجنب الخلط بين السلطات الوطنية المعينة من كاسيت التعبير المختلفة معا، نظراً لأنه يقلل من كفاءة الجمعية الحمض النووي نظراً للإعداد المتزايدة من جزيئات الحمض النووي التي تحتاج إلى أن تكون مرتبطة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  3. إعداد المخزن المؤقت للأسهم x ISO 5: 500 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ مجكل 50 مم2؛ ديوكسينوكليوتيدي 1 مم (دنتب)؛ ديثيوثريتول 50 مم؛ 25% البولي إثيلين غليكول (شماعة) 8000؛ ومم 5 نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD).
  4. جعل 1 مل 2 × رئيسية خليط من 400 ميليلتر 5 × ISO الأسهم المخزن المؤقت، ووحدات 7.5 [ااكسونوكلس] T5، 62.5 وحدات عالية الدقة بوليميراز الدنا، 000 5 وحدة من [تق] [بولمرس] (انظر الجدول للمواد)، والمقطر المعقم الكيل H2o.
    ملاحظة: هذا هو مقتبس من السابق دراسات24،،من2526؛ وينبغي أن يكون الأمثل وحدات التخزين هذه.
  5. الكوة ميليلتر 100 2 × مزيج الرئيسي كل أنبوب ومخزن في-20 درجة مئوية.
    تنبيه: تجميد متكررة وذوبان الجليد الخليط الرئيسي x 2 يمكن أن يسبب انخفاض كفاءة الجمعية الحمض النووي.
  6. إضافة 15 ميليلتر من مزيج الرئيسي x 2 إلى 5 ميليلتر خليط الحمض النووي واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

3-بناء ناقلات للمشارك التعبير متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات

  1. تضخيم كاسيت التعبير البروتين شبه مستقلة كاملة ببكر الجولة الثانية استخدام المنتج (0.5-1.0 ميليلتر) من رد فعل الجمعية متحاور الجولة الأولى كالقالب والإشعال الأبعد (مثلاً، FP35S-1 و 1-رنوس للتعبير كاسيت 1).
    1. استخدام 1 وحدة من بوليميريز عالي الدقة في حجم رد فعل 50 ميليلتر تليها دورات 30 (94 درجة مئوية لمدة 30 s، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، متبوعاً تمديد نهائي في 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. لينيريزي بالبروتين النهائي التعبير ناقلات العمود الفقري pUC18 و pCAMBIA1300، التي صممت للبروتين عابر التعبير والتحول الوراثي، على التوالي، بإضافة 4 وحدات Sma أنا إلى حجم رد فعل نهائي 10 ميليلتر وتحضين 1- 2 ساعة عند 25 درجة مئوية. إلغاء تنشيط إنزيم التقييد التي تفرخ في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. مزيج اكويمولار من جزيئات الحامض النووي من البروتين التعبير أشرطة الكاسيت وناقلات النهائية خطية رد نهائي إلى حجم 5 ميليلتر. ثم، تنفيذ جزئ الحمض النووي الجولة الثانية بالاختلاط مع 15 ميليلتر 2 × المخزن الرئيسي وتفرخ عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  4. استخدام المنتجات النهائية من رد فعل جزئ متحاور الجولة الثانية لتحويل المختصة كولاي الخلايا (مثلاً، DH5α) وفقا للإجراءات القياسية27. التحقق من صحة المستعمرات الإيجابية بتسلسل مستعمرة بكر والحمض النووي. استخراج والبلازميدات إيجابية من كولاي باستخدام مجموعة أدوات استخراج بلازميد مصغرة وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    تنبيه: للتخزين على المدى الطويل، والبلازميدات حله في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات أو مزدوجة المقطر ح2س أكثر استقرارا من إبقائها في سلالات كولاي .

4-بيوليستيك-قصف بوساطة التعبير المشترك عابر متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات

  1. إعداد التبغ حسب-2 تعليق الخلايا والنباتات نبات الأحداث للقصف.
    1. تعيين الخلايا حسب الثقافة-2 في المتوسط Murashige وسكوغ (مللي ثانية) من سوبكولتورينج مرتين في الأسبوع في 25 درجة مئوية في شاكر 130 لفة في الدقيقة. تصفية الخلايا 2 جمع 30 مل 3 د مثقف على قطعة من ورق الترشيح يعقم 70 ملم عبر مضخة فراغ بإعداد ضغط الفراغ إلى 40 [مبر].
    2. من أجل منع الخلايا من الجفاف خلال الخطوات التالية، إضافة عدة قطرات من 2 حسب الخلية السائلة المتوسطة الثقافية في طبق بتري قبل وضع ورق الترشيح (الخطوة التالية).
    3. نقل ورقة تصفية مع الخلايا بمقدار 2 على ذلك إلى طبق بتري جديدة (85 ملم × 15 ملم).
    4. سطح تعقيم بذور نبات التمويل (Col-0) قبل فورتيكسينج خليط مع الإيثانول 70% (v/v) التي تحتوي على 0.05% 20 توين لمدة 10 دقائق.
    5. تدور أسفل البذور باستخدام أجهزة الطرد مركزي أعلى هيئة في أقصى سرعة ل 2 s، إزالة المادة طافية وتغسل البذور مع الإيثانول 100% مرة واحدة ماصة س. 30 من البذور على ورقة تصفية عقيمة جديدة في غطاء عقيمة. ثم، أيردري البذور ونشرها على لوحات أجار ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
    6. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل تحويلها إلى دائرة نمو نبات مع الإعدادات التالية: 16 ح الضوء الظلام 8 ح مع 120-150 ميكرومتر m-2 s-1 كثافة، 22 درجة مئوية.
    7. نقل 7-يوم العمر عينة النباتات داخل دائرة قطرها 30 ملم في وسط صفيحة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الجديدة لزيادة كفاءة عمليات القصف.
      تحذير: تجنب التداخل النباتات عند نقل ووضعها على لوح ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الجديد.
    8. إضافة عدة قطرات من ½ MS المتوسطة السائل على سطح النباتات أو الأنسجة الحفاظ على الرطوبة ومنع جفاف النباتات من خلال الخطوات التالية.
  2. معطف جزيئات الذهب مع بلازميد الحمض النووي.
    1. دوامة ميكروكارير الذهب حل دقيق، للحد الأدنى 3 إعداد أنبوب 1.5 مل جديدة.
    2. التسلسل إضافة الحلول التالية في أنبوب ودوامه: 25 ميليلتر (1.5 ملغ) الذهب الجسيمات، دوامة 10 ق؛ 10 ميليلتر من سبيرمدين 25.46 مغ/لتر، دوامة 10 s; 5 ميليلتر من 1µg/ميليلتر بلازميد الحمض النووي، ودوامه 3 دقيقة؛ 25 ميليلتر 277.5 مغ/لتر كاكل2 الحل، دوامة 1 دقيقة.
      تنبيه: الحفاظ على فورتيكسينج أثناء هذه الخطوة.
    3. زيادة ونقصان لأسفل ميكروكاريرس الذهب باستخدام أجهزة الطرد مركزي أعلى هيئة في أقصى سرعة 5 s وماصة بها المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه. يغسل مع 200 ميليلتر من الإيثانول المطلقة وإعادة تعليق بيليه بدوامة لتدور س. 5-10 إلى أسفل في أقصى سرعة 5 s وإزالة الإيثانول.
    4. إعادة تعليق جزيئات الذهب في ميليلتر 18 الإيثانول المطلقة وتعليق الجسيمات ميليلتر 6 الكوة على منتصف ماكروكاريرس الثلاثة. السماح لهم بالهواء الجاف.
  3. نقل الحمض النووي في النباتات عن طريق القصف الجسيمات.
    1. تعيين نظام التسليم بالجسيمات كما يلي: 1100 رطل/بوصة مربعة، 28 ملم زئبق فراغ ومسافة الفجوة 1 سم ومسافة الرحلة الجسيمات 9-سم.
    2. قصف الخلايا/النباتات على لوحة متوسطة أجار لثلاث مرات في ثلاثة مواقع مختلفة وثم تبقى الخلايا/النباتات في الظلام بعد القصف مباشرة.
      تنبيه: ارتداء نظارات السلامة عند تشغيل نظام تسليم الجسيمات بسبب اقتران ارتفاع ضغط الغاز والجسيمات عالية السرعة مع النظام.
  4. تبقى قصفت خلايا/النباتات في الظلام في قاعة نمو النبات 6 إلى 72 ساعة قبل رصد إشارات الفلورسنت. تعيين الدائرة نمو النبات إلى الظلام 24 ح و 22 درجة مئوية.
    تنبيه: كفاءة التعبير وكثافة إشارة الفلورسنت هي المروج والجينات، والنبات/الأنسجة-تعتمد على.

5-جيل نبات المعدلة وراثيا مستقرة المشترك معربا عن البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة المتبعة-بوساطة التحويل.

  1. ذوبان الجليد المتبعة الخلايا المختصة (PMP90) على الجليد والانتظار لمدة 30 دقيقة، ثم إضافة متجه ثنائي 2 ميليلتر (100-200 نانوغرام) (أعدت أعلاه) إلى الخلايا المختصة. الجلوس المخلوط بالثلج لمدة 10 دقائق.
  2. نقل الخليط إلى ومبومو انهانسر سم 0.1 مبردة مسبقاً. إدراج ومبومو في النظام انهانسر وأداء انهانسر مع الإعدادات التالية: 1.6 كيلو فولت، أوم 600، 25 µF.
  3. إضافة 1 مل من شركة نفط الجنوب السائلة المتوسطة إلى ومبومو فورا بعد انهانسر "الماصة؛" الخلايا في أنبوب 1.5 مل جديدة واحتضان عند 28 درجة مئوية في شاكر مداري أفقي 200 لفة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 2,348 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتجاهل غالبية المادة طافية، بلطف إعادة تعليق الخلايا الأعلاف مع تلميح ماصة، نشرها على لوحة رطل يحتوي على 50 ملغم/لتر هيجروميسين ب واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  5. تحويل التمويل نبات Col-0 النباتات مع المتبعة، التي تحتوي على pCAMBIA1300 ناقل ثنائي متكامل مع عدة شرائط التعبير البروتين، بواسطة الأسلوب28 تراجع الأزهار كما هو موضح سابقا إلى توليد النباتات المعدلة وراثيا مستقرة.
  6. تعقيم سطح بذور نبات المحورة وراثيا بخلطها مع الإيثانول 70% (v/v) التي تحتوي على 0.05% 20 توين. دوامة ل 10 دقيقة تدور أسفل البذور باستخدام أجهزة الطرد مركزي أعلى هيئة في أقصى سرعة ل 2 s، إزالة المادة طافية، وتغسل البذور مع الإيثانول 100% مرة واحدة لمدة 30 ثانية.
  7. "الماصة؛" من البذور على ورقة تصفية عقيمة في غطاء عقيمة. وبعد ذلك، الهواء الجاف ونشرها على ½ MS أجار لوحات تتضمن ب هيجروميسين لفحص نسلها إيجابية.
  8. احتضان لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة يومين. ثم نقل منها إلى دائرة نمو النبات والثقافة لمدة 7 أيام.
  9. حدد العمر 7 اليوم بقاء النباتات الأحداث قبل التحقق من وجود إشارات الفلورسنت تحت مجهر فلوري، ثم نقل النباتات في التربة لفحص المزيد من النباتات متماثل.

6. العلاجات الدوائية

  1. للعلاجات الدوائية، تضعف كل المخدرات في متوسطة MS السائل تركيزات العامل المناسبة قبل الحضانة مع الخلايا أو النباتات.
    1. العلاج وورتمانين: إعداد حلول الأسهم من وورتمانين 1 ملم بتذويب مسحوق وورتمانين في [دمس] وتخزين المخزونات في-20 درجة مئوية. نقل الخلايا النباتية أو النباتات الأحداث في المتوسط MS السائلة التي تحتوي على 16.5 مكم وورتمامين واحتضان لمدة 30-45 دقيقة قبل التصوير.
    2. العلاج بريفالدين A (واو): إعداد 1 مم حلول الأسهم لمنتدى بواو الآسيوي بتذويب مسحوق منتدى بواو الآسيوي في [دمس] وتخزين المخزونات في-20 درجة مئوية. نقل الخلايا النباتية أو النباتات الأحداث في المتوسط MS السائلة التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل منتدى بواو الآسيوي لمدة 30-45 دقيقة قبل التصوير.

7-[كنفوكل] مجهر التصوير والبروتين تحليل التعريب المشارك سوبسيلولار

  1. نقل الأحداث النباتات أو خلايا تعليق على إحدى شرائح زجاجية تقليدية ووضع شريحة غطاء بلطف في الجزء العلوي لتصوير بالليزر [كنفوكل] معيار الفحص المجهري. استخدم الإعدادات التالية: المياه 63 X الهدف (N.A 1.4) 0 الخلفية، كسب 700، وحجم بكسل 0.168 مم، وكاشف ضوئي أنبوب. تثير البروتينات بروتينات فلورية خضراء معلم في 485 نانومتر والكشف عن الأسفار في 525 نانومتر. للبروتينات معلم طلب تقديم العروض، تثير في 514 nm وكشف في 575 نانومتر.
  2. حساب نسبة التعريب المشارك الفلورسنت الإشارات باستخدام البرمجيات "ي الصورة" (https://imagej.nih.gov/ij/) مع بيرسون-سبيرمان الارتباط (PSC) المشارك التعريب في المكونات كما هو موضح سابقا8. وتظهر معاملات الارتباط بيرسون أو معاملات الارتباط سبيرمان للرتب في النتائج (الشكل 4). تكون قيم r المنتجة من-1 إلى 1. 0 يوضح أي ارتباط لا يمكن اكتشافها من إشارات اثنين، بينما + 1 و-1 يبين العلاقة الإيجابية والسلبية الكاملة، على التوالي، إشارات اثنين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير أسلوب قوية وذات كفاءة عالية للتعبير المشترك عن متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات. فإنه يكسر من خلال الحواجز التقليدية استخدام نهج متعددة والبلازميدات المنفصلين عن ذويهم للتعبير البروتين المشارك، وكما هو مبين في الشكل 1 ألف، باء، عن طريق التعبير عابرة أو التحول الوراثي مستقرة. في هذا الأسلوب الجديد، نقوم بإنشاء ناقل تعبير واحد يتكون من البروتين التعبير أشرطة متعددة لتحقيق البروتين المشارك التعبير في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا لقد أظهرنا طريقة جديدة للتعبير عن المشاركة قوة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات. فإنه يمكن استخدامها للتعبير عابرة والتحول الوراثي ومتوافق مع الحالية الفلورسنت القائم على البروتين بيو-التصوير الجزيئي والكيمياء الحيوية تطبيقات وتكنولوجيات9،10،13 . وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يتغلب على الصعوبات للأساليب التقليدية التي تستخدم عدة التعبير الفردي والبلازميدات للتعبير البروتين المشارك. وفي المقابل، يعمل ناقل تعبير واح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر أعضاء المختبر وانغ لإجراء مناقشات مفيدة وتعليقات. يدعمه هذا العمل الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (تشرف، المنحة رقم 31570001) ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ ومدينة قوانغتشو (منح رقم 2016A030313401 و 201707010024) للأب

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
KOD-FX بوليميرازتويوبوKFX-101
SMA I NEBR0141L / S / V
TRIS-HClBBIA600194-0500
MgCl2< / sub>BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleaseمركزT5E4111K
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةPEBM0530S
Taq DNA polymeraseNEBB9022S
Murashige و Skoog خليط الملح القاعدي (MS)SigmaM5524
الإيثانولBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
جزيئات الناقل الدقيق للذهبBio-Rad165-22631.0 & micro ؛ m
CaCl2< / sub>BBICD0050-500
MacrocarriersBio-Rad165-2335
قرص تمزقBio-Rad165-2329
شاشة التوقفBio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
مستخلص الخميرةOXOIDLP0021
كلوريد الصوديومBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
جلوكوزBBIA600219-0001
Hygromycin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) BBIA600163-0500
T100 Thermal CyclerBio-Radغرفة نمو 1861096
باناسونيكMLR-352H-PC
PSD-1000 / نظام توصيل الجسيماتBio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
طرد مركزي BenchtopEppendorf5427000097
متحد البؤرZeissLSM 7 DUO (780 & ; 7Live)
NanoDrop 2000 / 2000c مقاييس الطيفالضوئي الحرارية فيشر العلميND-2000
EPS-300 مزود الطاقةTanonEPS 300
مجهر الفلورسنتMshotMF30
AgroseBBIA600234
أمبيسلينBBIA100339
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيB300599
جهاز مجهر بي بي آي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
  3. Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
  4. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  5. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
  6. Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
  7. Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
  8. Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
  9. Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
  10. Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
  11. Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246(2017).
  12. Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
  13. Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
  14. Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
  15. Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
  18. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  19. Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218(2014).
  20. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
  21. Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28(2007).
  22. Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
  23. Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
  24. Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
  25. Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
  26. Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
  27. Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
  28. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
  29. Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
  30. Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
  31. Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
  32. Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
  33. Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
  34. Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
  35. Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
  36. Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071(2017).
  37. Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
  38. Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
  39. Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FRET BiFC VSR 2 SCAMP4

مقالات ذات صلة