تم اتباع القواعد التي تحكمها التشريعات الألمانية لدراسات أجريت على الحيوانات، فضلا عن "مبادئ لمختبر الحيوان الرعاية" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور الطبعة 8، 2011). يتم منح إذن رسمي من مكتب رعاية الحيوان الحكومية (لانديسامت für Natur، أومويلت und فيربراوتشيرشوتز نوردراين-فيستفالن، ركلينغهاوزن، ألمانيا).
1-الحيوانات
- استخدام الخنازير landrace الألمانية الإناث (وزنها 25-30 كجم) يسكنون في أقفاص مفتوحة.
- استخدام الحيوانات 5 كل مجموعة (الأرجون والهيليوم).
- السماح للحيوانات على التأقلم للمناطق المحيطة بها لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل التجارب. الحيوانات بسرعة من أجل 24 ساعة قبل الجراحة مع حرية الوصول إلى المياه.
2-التخدير
- بريميديكاتي الحيوانات مع حقنه عضليا الكيتامين (15 مغ/كغ من وزن الجسم [و])، إكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) والاتروبين (0.1 مغ/كغ وزن الجسم) 10 دقيقة قبل تنظيم دورات تعريفية للتخدير.
- وصول الوريدية المحيطية تنشأ بموجب تنسيب قنية 22-قياس الوريد إذن.
- حمل التخدير العام بالحقن رابعا بروبوفول 2 مغ/كغ من وزن الجسم.
- وضع الحيوان في موقف ضعيف وأداء شق جلد طولية في أخدود جوجولار على طول من تحديد موقع الوريد 2 سم. من خلال إعداد حادة في النسيج تحت الجلد. إدراج قنية، ثم Seldinger الأسلاك.
- التراجع عن القنية وإدراج 14 fr. القسطرة عبر الأسلاك دليل. سحب سلك الدليل. توصيل قسطرة للتمديد وثبت القسطرة بحزام أو خياطة الجروح.
- سحب اللسان وإدخال المنظار على التوالي. استخدام تلميح المنظار لهدم في ابيجلوتيس. إدراج أنبوب عن طريق الاحبال الصوتية. ضع الكفة تحت المزمار وتضخيم.
- يحققوا مع الأكسجين 40% في الدقيقة 20-26 الأنفاس وحجم المد 10 مل/كغ إبقاء التوتر ثاني أكسيد الكربون الجزئي نهاية-المد والجزر بين 36 و 42 ملم زئبق.
- المحافظة على التخدير مع إيسوفلوراني بتركيز 1-1.5% وشيفتشنكو بتركيز 3-4 ميكروغرام/كغ/ساعة.
- توفير حل لاكتات في المسابقة أولى بمعدل 4 مل/كغ/h، وزيادة بعد فتح البطن لتسريب مستمر بمعدل 8 مل/كغ/ساعة.
3-الجراحة وتخثر البلازما
- وضع الحيوان في موقف ضعيف على طاولة العمليات جراحية قياسية.
- تطهير الجلد بتطبيق مطهر جراحي قياسية (2-بروبانول ز 45/100 غرام، 1-بروبانول ز 10/100 غرام، ثنائي الفينيل-2-الرتب الأخرى 0.2 غ/100 غ) مع مسحه جراحية 3 مرات.
- القيام فتح البطن خط الوسط واسعة من عملية الرهابه إلى العانة مع مشرط وتثبيت الكامشات الجراحية.
- التبديل على جهاز تخثر البلازما، وفتح زجاجة غاز الأرجون أو الهليوم، اعتماداً على الغاز الناقل المستخدمة. ضبط تدفق الغاز إلى طاقة 3 لتر/دقيقة التخثر حدد جهاز الإخراج كما هو مطلوب.
ملاحظة: يمكن استخدام كلا من الغازات الخاملة، الأرجون أو الهليوم، تخثر البلازما. آثار التخثر قابلة للمقارنة. راجع مرجع7 لمزيد من التفاصيل.
- أداء تخثر البلازما في فص الكبد الأيسر كما هو موضح سابقا7. استخدام قالب تيتانيوم (فتحه مربعة 1 × 1 سم2) إلى توحيد منطقة التخثر. يتجمد 5 s مع مسبار لمسافة 1 سم. يمكن أن يؤديها تخثر مع إعدادات طاقة مختلفة جنبا إلى جنب مع مسافة قصيرة بين تخثر 5 مم (الشكل 1).
- لحصاد الكبد، تقسيم كل وجود اتصالات للكبد. عزل وتقسيم بيديكلي كبدي أعلاه flexure الإثناعشرية متفوقة ترك أجزاء طويلة من الوريد البابي والقناة الصفراوية المشتركة. تقسيم على المنوال كابل أعلى وأسفل الكبد واسترداد الجهاز.
- بعد الحصاد في الكبد، كان euthanized الخنازير بالإدارة رابعا من 0.16 غرام/كغ وزن الجسم بينتوباربيتال.
- لإجراء تجارب الضغط الاندفاع، يرسخ نصف الفص الكبد الآنسي الأيسر مع مقص حاد. بلازما-يتجمد القطع السطح (100W إنتاج الطاقة) أو ختم على سطح قطع مع تسرب فيبرينوجين (الشكل 2).
4. قياس دوران الأوعية الدقيقة
ملاحظة: يمكن تحديد مطيافية الليزر دوبلر تدفق الدم في الأنسجة من خلال قياس التحول دوبلر الناجم عن حركة الكريات الحمراء. وترتبط إشارة الليزر بعدد الكريات الحمراء تتحرك. مطيافية دوبلر الليزر في الاستخدام السريري (مثل زرع الطب)، وقد تم التحقق من صحة عدة مرات15.
- التبديل على مقياس التدفق دوبلر الليزر وجهاز المطياف الضوئي. استخدام مجس مسطحة.
- أخذ قياسات أساسية للتدفق والسرعة. حفظ أو ملاحظة القيم.
- تنفيذ تخثر الدم كما هو موضح تحت 3.5.
- مكان المسبار شقة في مواقع التخثر وقياس التدفق والسرعة. ومرة أخرى، حفظ أو ملاحظة القيم.
- كرر كافة إعدادات الطاقة لجهاز كواجولاتور.
5. قياس درجة الحرارة
- تبديل النظام (كاميرا حرارية ودفتر الملاحظات والحرارة الأشعة تحت الحمراء) والسماح لها بخوض ح 1 على الأقل قبل إجراء القياسات.
- ضبط التركيز وعرض إطار كاميرا حرارية على موقع تخثر الدم. ويمكن الكشف عن تسلسل الأشعة تحت الحمراء مع القرار المكانية من 1024 × 768 بكسل بدقة درجة حرارة أكبر من 20 عضو الكنيست. تأخذ في الاعتبار، أن المنطقة من تجلط الدم والأنسجة المحيطة – المتأثرين بنقل الحرارة – يقع في وسط الرأي.
ملاحظة: ينبغي أن يشمل العديد من بكسل للإطار ممكن للتوصل إلى حل أمثل مكانية.
- تسجيل عملية التخثر مع كواجولاتور بلازما على سطح الكبد مع كاميرا حرارية على مدى فترة 2 دقيقة.
- تحليل تسلسل الصور مع برامج التحليل الحراري: تحديد المناطق ذات الاهتمام.
ملاحظة: يحسب البرمجيات مجرى المقابلة متوسط درجة الحرارة مع مرور الوقت.
6-تخثر قياس العمق
- حصاد الفص الكبد الآنسي الأيسر مع مقص حاد.
- المكوس المواقع التخثر بسمك 1 سم. مقطعة شرائح طولية سميكة 3 مم لمزيد من المعالجة.
- معزولة فيكس عينات الأنسجة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع المحايد 10% فورمالين. الحرارة 2 درجة مئوية فوق نقطة انصهار البارافين وتضمين الشرائح. العملية بين عشية وضحاها.
- القيام بتلوين الهيماتوكسيلين/ويوزين.
- ديبارافينيزي وهيدرات الأنسجة بالغمس في وقت لاحق في 2 × زيلين نفط، 100 ٪ الإيثانول (EtOH)، 95% EtOH، 70% EtOH، منزوع ح2س لكل 2 دقيقة.
- وصمة عار عينة الأنسجة مع توضع حل ماير لمدة 3 دقائق.
- الآن الشطف بماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار في الأنسجة مع الحل ثم لمدة 3 دقائق.
- شطف في x EtOH 2 95% ومن ثم زيلين نفط لمدة 3 دقائق. جبل مع المتوسطة تصاعد القياسية.
- تبديل النظام (مجهر توصيل الكاميرا، برامج التصوير). عرض جميع الأقسام مع 40 X التكبير.
- التقاط صورة ميكرومتر الكائن في بير 40 س. اضغط على زر تعديل في إطار الأهداف. حدد المعايرة اليدوية. رسم خط على صورة ميكرومتر 100 ميكرومتر. أدخل 0، 1 مم في مربع الحوار ثم اضغط موافق.
- حدد طول في العرض > "ضوابط تحليل" > نافذة الشروح والقياسات. قياس من سطح الكبد إلى الهامش التخثر باستخدام الماوس. تصدير أو ملاحظة النتيجة. كرر القياس على موقع آخر على نفس الشريحة.
ملاحظة: يمكن أن تكون متباينة العمق تخثر الدم بسهولة من نسيج الكبد الطبيعي بفارق حاد بين الحبال تتمثل العادي ومنطقة نخر السيتوبلازم منكمش ونوى متنكرزه ومناطق نزيف.
- حساب يعني الخروج من القياسات اثنين.
7-انفجار قياس الضغط
- تبديل النظام في (المضخات التلقائية، ومقياس الضغط). إعداد عينات الكبد وفقا للخطوة 3.7.
ملاحظة: استخدام مضختين متوازية متصلة عبر 3-طريقة-محبس الحنفية. لا يمكن الحصول على أقصى ضغط 1,500 ملم زئبق مع مضخة واحدة.
- عزل الوريد البابي والشريان الكبدي شيوعاً والقناة الصفراوية بالمقص في بيديكلي haptic. المشبك الوريد البابي مع ملقط أوفيرهولت واضطر مع خياطة مونوفيل 4-0. المشبك الشريان الكبدي الشائعة ملقط أوفيرهولت واضطر مع خياطة مونوفيل 4-0.
- إدخال قسطرة Ch-16 في القناة الصفراوية المشتركة، واضطر مع خياطة حرير 2-0. الاتصال القسطرة بالمضخات التلقائية، وتركيب محبس الحنفية 3-الطريقة مع الضغط متر (الشكل 3).
- ملء المحاقن التروية مع المالحة.
- بدء تشغيل المضخات التلقائية مع معدل إنجاز لمل 99/ح.
- مراقبة الكبد متر قطع السطح والضغط للتسرب وسجل ضغط الانفجار.
ملاحظة: لتسهيل الاعتراف بالتسرب، الأزرق البراءات يمكن إضافة إلى المحلول الملحي (2 مل البراءات الأزرق + المالحة مل 18). أنه من الأسهل لمراقبة ضغط الانفجار التي يلاحظ وقت فقدان الضغط على مؤشر الضغط.