الكشف عن حساسية عالية من ميكروميتاستاسيس المتولدة عن التجارة والنقل ترانسدوسيد لينتيفيروس أورجانويدس مثقف من ورم القولون المستمدة من المريض

ملخص

للسماح للكشف عن درجة عالية من الحساسية لسرطان القولون والمستقيم البشرية نشر الخلايا (CRC) استعمار الأنسجة، نعرض هنا بروتوكولا لكفاءة توصيل الجسيمات لينتيفيرال البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) إلى خلايا أورجانويد المستمدة من PDX CRC قبل الحقن في الفئران المستفيدة، مع ملاحظة مجهرية ستيريو-الأسفار.

الملخص

وعلى الرغم من التقدم الحالي في علاج سرطان القولون والمستقيم البشرية (CRC)، علاجات جذرية قليل فعالة للمراحل المتأخرة من اتفاقية حقوق الطفل. للتغلب على هذا التحدي السريرية، والورم إكسينوجرافت الماوس نماذج استخدام الراسخة قد وضعت خطوط الخلايا البشرية سرطان والعديد من نماذج الماوس المحورة وراثيا بالأورام كنماذج الإكلينيكية. جزئيا تحاكي ملامح السرطانات البشرية، ولكنها غالباً ما تفشل بإيجاز الجوانب الرئيسية للأورام الخبيثة البشرية بما في ذلك الغزو، وورم خبيث. وهكذا، طال انتظار النماذج البديلة التي تمثل أفضل تطور خبيث في البشرية اتفاقية حقوق الطفل.

هنا نعرض جيل تكثيفها الورم المستمدة من المريض (بدكسس) بغرس تحت الجلد الصغيرة الشظايا CRC تشريح جراحيا من مريض. القولون بدكسس تطوير ويشابه هيستوباثولوجيكالي اتفاقية حقوق الطفل في المريض. ومع ذلك، ميكروميتاستاسيس عفوية قليلة قابلة للاكتشاف في المقاطع العرضية التقليدية المتأثرة الأجهزة البعيدة في نموذج PDX. لتيسير الكشف عن نشر المنتشر في الأجهزة البعيدة، استخرجنا الخلايا السرطانية أورجانويد من بدكسس القولون في الثقافة والمصابين منهم lentivirus التجارة والنقل قبل الحقن في شدة العوز إيماءة/شي-إخضاعها IL2Rγ^{فارغة (null)} الفئران (وتد). الخلايا أورثوتوبيكالي حقن CRC المستمدة من PDX أورجانويد دائماً شكل الأورام الأولية الإيجابية للتجارة والنقل في الفئران المستفيدة. وعلاوة على ذلك، وضع عفويا ميكروميتاستاتيك المستعمرات معربا عن التجارة والنقل لا سيما اكتشاف في الرئتين من هذه الفئران بالفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، حقن إينتراسبلينيك من أورجانويدس لجنة حقوق الطفل كثيرا ما تنتج الاستعمار الكبد. أخذت معا، تشير هذه النتائج إلى المسمى بروتينات فلورية خضراء في الخلايا أورجانويد PDX المستمدة من اتفاقية حقوق الطفل أن يكون بصريا يمكن اكتشافها أثناء عملية متعددة الخطوات ووصف تتالي غزو خبيث. وتشمل البروتوكولات وصف إنشاء بدكسس البشرية اتفاقية حقوق الطفل، وثقافة 3D من الخلايا أورجانويد CRC المقابلة ترانسدوسيد بجسيمات لينتيفيرال التجارة والنقل.

المقدمة

سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي الثاني لوفيات السرطان في جميع أنحاء العالم¹. عدم كفاية الاستجابة للعلاجات التقليدية للمرضى الذين يعانون من المرض مرحلة متقدمة تشير إلى عدم فعالية المحاولات الرامية إلى علاج جذري المجتمعي. وضع نهج علاجية أكثر فعالية، تم إنشاء مختلف نماذج الماوس الإكلينيكية للسرطان التي تحاكي خصائص مراكز التأهيل المجتمعي. مختلف خطوط الخلايا في اتفاقية حقوق الطفل قد استخدمت على نطاق واسع لتوليد تكثيفها الورم سبب راحة وسهولة التلاعب. ثقافة طويلة الأجل لخطوط خلايا السرطان، ومع ذلك، غالباً ما يسبب اختيار السكان الخلايا الفريدة التي التكاثري تماما تحت شرط ثقافة معينة، مما يؤدي إلى نتائج لا يمكن الاعتماد عليها والقيود الحاسمة في العقاقير السريرية التنمية.

دون أن يكون مثقف في المختبر، كما تم إنشاؤها تكثيفها الورم المستمدة من المريض (بدكسس) بواسطة غرس في نماذج حيوانية للأنسجة البشرية CRC تشريح جراحيا من المرضى^2،،من³⁴. بدكسس معروفة على نطاق واسع كما لخص أهم الميزات التشريحية المرضية والتعديلات الوراثية الموجودة أصلاً في أورام المرضى التي اشتقت منها. وعلاوة على ذلك، أورجانويدس الورم المستمدة من المريض تتألف من خلية الورم ووضعت مجموعات الثقافة ظروف 3D الذي يحاكي عن كثب الخصائص البيولوجية للأورام الأصلي^5،6. وطبقت هذه أورجانويدس الورم أيضا لفحص المخدرات الفائق، مما يسمح للعلاجات مخصصة لتكون مصممة⁵. بيد غير متجانسة على نحو ملحوظ CRC السكان يفترض أن تكون موجودة داخل ورم الجماهيري. قد بشكل انتقائي تتكاثر خاصة CRC السكان وتوسيع خلال السلسلة في الجسم الحي وفي المختبر من الممرات PDX والورم أورجانويدس، على التوالي. قد يسمح هذا أيضا ملامح التعبير الجيني الشاملة وبرنامج التحصين الموسع والوراثية مركز من مراكز التأهيل المجتمعي المتأثرة تغيير، مما يؤدي إلى تشابه الحد الأدنى لاتفاقية حقوق الطفل الوالدية.

أورجانويدس CRC المستمدة من المريض وتلك المستخرجة من القولون البشرية نونكانكيرووس إجراء هندسة عكسية للميناء مجموعات من الطفرات النمطان استخدمت أيضا للتحقيق في السمات المميزة للخلايا السرطانية البشرية المتمثلة بغزو الورم وورم خبيث ^67،،،من⁸⁹. ومع ذلك، حدوث منخفضة جداً من ورم خبيث العفوية الناشئة عن أورثوتوبيك غرس CRC المستمدة من المريض في الفئران العوز، جعلت من الصعب لدراسة عملية متعددة الخطوات لتتالي غزو خبيث يحتوي على المحلية الغزو، إينترافاسيشن، النقل في مجرى الدم، والتسرب واستعمارها للأجهزة البعيدة^4،10. ميكروميتاستاسيس كممثلة بورم الخلايا ترسب مم دي تو، شكلتها المستمدة من المريض أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل، وغالباً ما تم تجاهله في تحليل نسيجية للأقسام من الأجهزة البعيدة المتضررة في النماذج التجريبية الماوس. التصور ميكروميتاستاسيس عفوية وقد الحد الأدنى في فيفو نظراً لصعوبة كفاءة إدخال علامات مضيئة في الخلايا السرطانية أورجانويد قبل الحقن في الفئران المستفيدة. في هذه الدراسة، وضعنا بروتوكولا كفاءة ترانسدوسي lentivirus التجارة والنقل إلى الخلايا أورجانويد المستمدة من PDX CRC في الثقافة 3D قبل الحقن في الفئران المستفيدة والسماح للكشف عن درجة عالية من الحساسية، استخدام الفحص المجهري ستيريو-الأسفار، لما استعمار أجهزة مختلفة للنموذج ميكروميتاستاسيس.

البروتوكول

قدم المريض الموافقة الخطية وتمت الموافقة المشروع قبل "لجنة أخلاقيات البحوث" كلية الطب في جامعة جونتيندو. تجارب الماوس أيضا موافقة "لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية" جونتيندو كلية الطب.

1-إنشاء لجنة حقوق الطفل بدكسس في الفئران العوز

ويرد في الشكل 1Aالإجراءات التجريبية لوضع "بدكسس" (الخطوة 1) من اتفاقية حقوق الطفل.

1. إعداد الأنسجة CRC الابتدائي فورا بعد الاستئصال الجراحي للورم من المريض.
2. أغسل الأنسجة CRC الأولية بالانفعالات لطيف عدة مرات في 30 مل من الفوسفات العقيمة المثلج مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 50 مل مخروطية وإبقائه على الجليد.
3. ضع الأنسجة على طبق بيتري 10 سم باستخدام ملاقط معقمة وإزالة مناطق نخرية على نطاق واسع قدر الإمكان باستخدام مقص معقم وقطع أنسجة الأورام الصلبة إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم³ في الحجم) باستخدام شفرات الحلاقة العقيمة.
   ملاحظة: مناطق نخرية غالباً أكثر بياضا وأكثر نعومة وقابلة للتفتيت أكثر من المناطق المحيطة بها.
4. ضع قطعة صغيرة من الورم باستخدام ملاقط معقمة في 2 مل من المثلج PBS العقيمة على لوحة 6-جيدا.
5. تولد 6 أسبوع IL2Rγ إيماءة/شي-مشمولان فارغة (وتد) شدة العوز الفئران ظروف حرة ومحددة الممرض–جرثومة–الحرة.
6. تخدير الفئران مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%. أؤكد بالمعدل العادي وعمق التنفس وغياب منعكس قرصه تو أنيسثيتيزيشن السليم. مرهم البيطرية في العيون خيار، لمنع جفاف العين في حين تحت التخدير.
7. تعقيم كل الأدوات الجراحية باستخدام التعقيم الحرارة الجافة وثم استخدام هذه الأدوات لجميع الإجراءات لمنع عدوى الجرح في الفئران المستفيدة.
8. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في موقف معرضة على مقاعد البدلاء المختبر. إجراء شق صغير في الأجزاء السفلي من الجناحين الأيمن والأيسر للماوس المتلقية لتوليد جيوب تحت الجلد لزرع الأنسجة باستخدام مقص معقم. الحرص على عدم ثقب الغشاء البريتوني. ينبغي أن يكون هناك نزيف قليلاً مع هذا الإجراء.
9. بلطف وتراجع أعلاه إعداد أجزاء الورم إلى 50 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية وثم زرع لهم في الأجزاء السفلي من اليمين واليسار جيوب تحت الجلد.
10. خياطة الشق مع مقاطع الجرح في الفئران تمر الإجراءات الجراحية. تأكد من أن توجد أنسجة الورم مزروع في بعض المسافة من شق تحت الجلد.
    ملاحظة: وفقا للتقليل إلى أدنى حد من العمليات الجراحية، كانت تدار لا علاجات للإصابة والألم بعد الجراحة في هذه الدراسة.
11. ضع الماوس على وسادة دافئة، والحفاظ على موقف راقد القصية حتى يتم استعادة الوعي الكافي. متى تعافي تماما وقادرة على الجلوس في كل أربعة أرجل، يمكن إرجاع الفئران إلى اقفاصها المنزل. لمنع اﻻفتراس، لا تسمح بتربية مع الحيوانات غير تعمل في نفس القفص.
12. التحقق من وجود تسرب خياطة وتأكيد أن الفئران هم في حالة مستقرة في اليوم التالي، في المجموعة المعالجة جراحيا. تحقق من الفئران لعلامات المرض وقياس حجم الورم في كل الماوس، مرة في أسبوع، استخدام الفرجار.

2-تشريح لحقوق الطفل بدكسس من الفئران

ويرد في الشكل 1Bالإجراءات التجريبية لتشريح "بدكسس" (الخطوة 2) من اتفاقية حقوق الطفل.

1. تسمح الورم ينمو تحت الجلد إلى ~ 1 سم³ في الحجم، والذي عادة ما يستغرق حوالي 1 – 3 أشهر.
2. تخدير الماوس مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%.
3. ضع الماوس في وضع عرضه على مقاعد البدلاء المختبر. جداً الجلد وتعريض الورم وفصل الجلد من الورم باستخدام مقص معقم بعناية. بعد إزالة الورم، وضعه على 10 سم طبق بيتري وإزالة أي مناطق نخرية صارخ من الورم، ثم شطف مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: مناطق نخرية غالباً أكثر بياضا وأكثر نعومة وقابلة للتفتيت أكثر من المناطق المحيطة بها.
4. مكان الورم على الجليد وتقسيمه على قدم المساواة إلى مالا يقل عن 4 أجزاء لتطبيقات مختلفة بما في ذلك 1) حقوق الطفل أورجانويد الثقافة، 2) زرع في الثانوي الفئران، فحص 3) النسيجي و 4) تجميد وتخزين أجزاء الورم.
   1. لجيل أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل، بوضع أنسجة الأورام الصلبة على طبق بيتري 6 سم يحتوي على 1 مل PBS العقيمة. الحفاظ على النسيج على الجليد حتى تجهيز (الخطوة 3).
   2. لإنشاء نموذج PDX للبشرية اتفاقية حقوق الطفل، ممر بدكسس CRC الطازجة في ماوس ثانوي. قطع الأنسجة الورم إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم³ في الحجم) باستخدام شفرات الحلاقة العقيمة وتراجع هذه الشظايا الأنسجة بلطف إلى 50 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية. ثم زرع هذه الأجزاء إلى الأجزاء السفلي من جيوب تحت الجلد الأيمن والأيسر للماوس وتد، كما هو موضح في الخطوة 1، 1.8 – 11.
   3. للتحليل النسيجي، إصلاح العينات في 5 مل من 10% فورمالين مخزنة محايدة في أنبوب مخروطي 15 مل في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
   4. لنعد، قطع الأنسجة الورم إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم³ في الحجم) وتراجع بلطف العينات إلى 500 ميليلتر من الخلية تجميد الحل في أنابيب كريوفيال 1 – 1.5 مل. ثم قم بنقل الأنبوب لثلاجة-80 درجة مئوية.

3-استخراج بدكسس في تعليق خلية لثقافة أورجانويد لجنة حقوق الطفل

ويرد في الشكل 1Bالإجراءات التجريبية للانفصال من "بدكسس" (الخطوة 3) من اتفاقية حقوق الطفل.

1. وشظايا مكان الورم استعداد (الخطوة 2.4.1) أعلاه على 10 سم طبق بيتري.
2. فرم الأجزاء باستخدام شفرات الحلاقة العقيمة وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 8 مل مصل العجل الجنين 10% (FCS)-المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) مع 80 ميليلتر من الأسهم إنزيم كولاجيناز (انظر الجدول للمواد).
3. أغلق الأنبوب محكم والتفاف الغطاء مع بارافيلم لمنع التسرب. أن تنأى بشظايا ورم مفروم في تعليق خلية، تحرض عليه برفق ح 2 في 37 درجة مئوية. علما أنه سيكون هناك لا تزال أجزاء كثيرة من عسر الهضم الأنسجة المتبقية في الأنبوب.
4. الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية. حل بيليه الخلية باستخدام 10 مل من 10% دميم FCS جعل تعليق خلية.
5. لإزالة الحطام الأنسجة عسر الهضم، تصفية تعليق خلية مرتين باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. ثم الطرد المركزي خلال التدفق في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وإبقاء بيليه على الجليد.

4-جيل أورجانويدس CRC مثقف في المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية

ويرد في الشكل 1Bالإجراءات التجريبية لثقافة حقوق الطفل أورجانويد بدكسس القولون (الخطوة 4).

1. إنشاء وسيلة ثقافة مناسبة أورجانويدس المستمدة من PDX CRC (انظر الجدول للمواد، "حقوق الطفل أورجانويد الثقافة المتوسطة") توظيف وسائل الإعلام المذكورة سابقا للبشرية القولون أورجانويدس¹¹.
2. تطبيق 150 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية (انظر الجدول للمواد) كل جيدا على لوحة 12-جيدا على الجليد واحتضان ثم أنه لمدة 30-60 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة ترسيخ المواد الهلامية.
3. تعليق بيليه الخلية من الخطوة 3.5 مع متوسط الثقافة أورجانويد اتفاقية حقوق الطفل (من الخطوة 4، 1) مع 5 ٪ السفح لتحقيق التكيف مع 3 × 10⁵ خلايا/مل. ثم البذور 1 مل المتوسطة إلى اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة لوحة إعدادها في الخطوة 4، 2. واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت 5% CO₂. استخدام هيموسيتوميتير لعد عدد الخلايا السرطانية بما في ذلك الخلايا المفردة ومجموعات متعددة الخلايا (مجموعة من الخلايا ملتصقة) في تعليق خلية.
   ملاحظة: يتم استخدام 5 ٪ السفح إخماد النشاط الأنزيمي المتبقية من كولاجيناز في هذه الدراسة.
4. بعناية جمع المتوسطة الثقافة، بما في ذلك العائمة الخلايا التي قد فصل من لوحة المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية الاصطناعية، إلى 1.5 مل الطرد المركزي الأنبوب في اليوم التالي والطرد المركزي أنه في س 1,400 ز لمدة 5 دقائق. ثم إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 70 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية على الجليد.
5. زيادة صلاحية خلية CRC، تراكب الورم الذي يحتوي على الخلية الاصطناعية خارج الخلية المصفوفة على أورجانويد ورم الخلايا تعلق على لوحة المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية الاصطناعية واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة ترسيخ طلاء المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية. ثم احتضان أنه مع 1 مل من اتفاقية حقوق الطفل أورجانويد خلية الثقافة المتوسطة مع السفح 1% في 37 درجة مئوية تحت 5% CO_2.
6. تغيير ثقافة المتوسط كل يوم الثاني. كما أورجانويدس CRC ملء المتوسطة، فقد يصبح من الضروري تغيير في المتوسط يوميا.

5-جيل وتخصيب جزيئات لينتيفيرال بروتينات فلورية خضراء

ويرد في الشكل 1الإجراءات التجريبية لتوليد وتخصيب جزيئات بروتينات فلورية خضراء لينتيفيرال (الخطوة 5).

1. الثقافة HEK293T الخلايا مع روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10% FCS و إعداد ستة أطباق 10 سم (2 × 10⁶ خلايا كل طبق) تعداء الإجراء التالي.
2. تعداء كل طبق، وإعداد 500 ميليلتر من المخلوط بما في ذلك 20 ميليلتر من الكاشف تعداء في دميم مع ناقل برل-التجارة والنقل (5 ميكروغرام)¹² وهما والبلازميدات التغليف لينتيفيرال، مثل بكمف-منظمة-G (1 ميكروغرام) ودفبر بكمف-dR8.2 (5 ميكروغرام)، في معقم 1.5 مل microtube. الاحتفاظ بهذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم تراكب على كل من الأطباق 10 سم واحتضانها لهم ح 18.
3. إزالة المتوسطة وإضافة 5 مل من الطازج المتوسط 1640 FCS RPMI 10% لكل طبق، وترك مكانة ح 24.
4. جمع المتوسطة مكيفة من كل طبق في أنبوب 50 مل الطرد مركزي وتخزين ما مجموعة 30 مل الوسط عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إضافة 5 مل من 1640 RPMI جديدة على كل طبق وترك مكانة ح 24.
5. جمع المتوسطة مكيفة من كل طبق في أنبوب 50 مل الطرد المركزي والحفاظ، في المجموع، 30 مل من الوسط على الجليد. وبعد ذلك، تجاهل الخلايا.
6. تصفية 60 مل الوسط (من الخطوة 5، 4 – 5.5) من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرون لإزالة الخلايا وتقسم هذه الكمية إلى اثني عشر أنابيب الطرد المركزي البوليبروبيلين 5 مل تنبيذ فائق.
7. إلى تركيز الفيروس، الطرد المركزي لهم استخدام دوار دلو يتأرجح (انظر الجدول للمواد) في 85,327 س ز ح 1.5 في 4 درجات مئوية.
8. على الفور إزالة المتوسطة. حل فيروس مركزة بيليه، ضع 250 ميليلتر من خليط F-12 "المغذيات حم" (F12)/المتوسطة دميم دون FCS في كل من اثني عشر أنابيب والحفاظ عليه في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. علما بأن الفيروس بيليه في كثير من الأحيان غير مرئية.
9. بلطف "الماصة؛" وسيلة لجمع 3 مل تركيز 5 x GFP lentivirus المخزون، في المجموع، يفترض بما في ذلك الجسيمات لينتيفيرال التجارة والنقل مع 10⁸ وحدات ترانسدوسينج كل مل (تي يو/mL). ثم تخزين microtubes 1.5 مل اثنا عشر (بما في ذلك 250 ميليلتر كل أنبوب) تحت ظروف معقمة في-80 درجة مئوية لتصل إلى سنة. إعداد العديد من مختبرين الصغيرة الحل الأصلي لتجنب عدة دورات ذوبان تجميد–.

6-وضع العلامات CRC أورجانويد الخلايا التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء جسيمات لينتيفيرال المستزرعة في المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية

ويرد في الشكل 1الإجراءات التجريبية لوضع العلامات الخلايا أورجانويد CRC مع التجارة والنقل لينتيفيروس (الخطوة 6).

1. السماح أورجانويدس CRC إعدادها في الخطوة 4.6 تنمو دون تدخل لمدة 7 – 10 أيام وحصادها آليا باستخدام مكشطة خلية عقيم وثم تحويلها إلى microtube 1.5 مل.
   ملاحظة: نمو أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل في الثقافة يعتمد على طبيعة الأورام الأصلي من المرضى. تجنب فرط أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل، بإبقائها في التقاء 60 – 70% السابقة لنقل بنسبة 1:2 تقسيم على جديدة اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة جيدا 12 لوحة.
2. الطرد المركزي في microtube لمدة 3 دقائق في س 1,400 ز، وإزالة المتوسطة الثقافة وحل بيليه الخلية في 500 ميليلتر لبرنامج تلفزيوني عن طريق التنصت لطيف.
3. الطرد المركزي في microtube لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز والقضاء على برنامج تلفزيوني.
4. أن تنأى أورجانويدس CRC ملتصقة، إضافة 500 ميليلتر من حل الخلية المفرزة من proteolytic وبيليه في الأنبوب الإنزيمات كولاجينوليتيك للخلية ومزجها بالتنصت على لطيف. ثم ترك هذه الأنابيب تسوية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. بلطف جداً "الماصة؛" تعليق خلية مع ميليلتر 500 إضافية 1% دميم FCS عدة مرات في microtube 1.5 مل فصل الخلايا تقريبا. جيل خلايا المفردة من أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل قبل بيبيتينج قاسية ملحوظ يقلل بقاء الخلية. وبالتالي، من الضروري ترك كتلة الخلايا يمكن كشفها بصريا في تعليق خلية بها بلطف جداً بيبيتينج في microtube 1.5 مل.
6. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز وإزالة المادة طافية.
7. حل بيليه الخلية مع خليط من 100 ميليلتر من 5 x GFP lentivirus الأسهم (> 10⁸ تو/mL) و 400 ميليلتر من متوسط الثقافة أورجانويد CRC في microtube 1.5 مل عن طريق التنصت لطيف للتكيف بتركيز من 5 × 10⁵ فصل الخلايا السرطانية الواحدة 500 ميليلتر . استخدام هيموسيتوميتير لعد عدد الخلايا السرطانية، بما في ذلك مجموعات من الخلايا والخلايا المفردة في تعليق خلية، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 3).
8. إعداد اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة جيدا 12 صفيحة، كما هو موضح في الخطوة 4، 2. ثم ضع 500 ميليلتر من تعليق خلية إعدادها في الخطوة 6.7 على اللوحة وترك الأمر ح 18 في 37 درجة مئوية تحت 5% CO₂.
9. جمع المتوسطة مع الخلايا عائمة منفصلة عن لوحة المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية الاصطناعية في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. الطرد المركزي أنه في س 1,400 ز ومن ثم إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 70 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية على الجليد.
10. زيادة صلاحية خلية CRC، تراكب الورم الذي يحتوي على الخلية الاصطناعية خارج الخلية المصفوفة على أورجانويدس الورم تعلق اصطناعية خارج الخلية المغلفة بمصفوفة جيدا 12 لوحة، كما هو موضح في الخطوة 4، 5. المقبل، احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة ترسيخ طلاء المصفوفة خارج الخلية الاصطناعية وثم الثقافة أنه مع 1 مل المتوسط الثقافة أورجانويد CRC مع السفح 1% في 37 درجة مئوية تحت 5% CO₂.
11. مراقبة الخلايا في 3 أيام بعد الإصابة تحت مجهر الأسفار لتأكيد ما يقارب 100% بروتينات فلورية خضراء الإيجابية نتيجة لاستخدام عيار عال جسيمات لينتيفيرال (انظر الشكل 2 أ).
12. الثقافة أورجانويدس CRC لفترات 7-10 أيام لتوسيع نمو الخلايا قبل الحقن في الفئران المستفيدة.

7-جيل الانبثاث من أورجانويدس التجارة والنقل المسمى CRC في الفئران المستفيدة

ويرد في الشكل 1الإجراءات التجريبية لتوليد الانبثاث باستخدام أورجانويدس بروتينات فلورية خضراء المسمى CRC (الخطوة 7).

1. لننأى أورجانويدس بروتينات فلورية خضراء المسمى CRC في تعليق خلية، حصادها آليا باستخدام مكشطة خلية عقيم وتحويلها إلى microtube 1.5 مل، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 6، 1).
2. الطرد المركزي microtube لمدة 3 دقائق في س 1,400 زوإزالة متوسط الثقافة، وحل بيليه الخلية في 500 ميليلتر لبرنامج تلفزيوني عن طريق التنصت لطيف.
3. الطرد المركزي في microtube لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز والقضاء على برنامج تلفزيوني.
4. تراكب 500 ميليلتر من محلول مفرزة الخلية على بيليه الخلية في الأنبوب ومزجها بالتنصت على لطيف. بعد ذلك، ترك مكانة الخليط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة فصل انزيماتيكالي أورجانويدس CRC ملتصقة، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 6، 4).
5. بلطف جداً "الماصة؛" تعليق خلية مع ميليلتر 500 إضافية 1% دميم FCS عدة مرات في microtube 1.5 مل تقريبا فصل الخلايا، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 6، 5). جيل خلايا المفردة من أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل قبل بيبيتينج قاسية ملحوظ يقلل بقاء الخلية. وهكذا، ترك يمكن كشفها بصريا في تعليق خلية كتلة الخلايا التي بيبيتينج بلطف جداً في microtube 1.5 مل.
6. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 1,400 س ز وإزالة المادة طافية.
7. وضع نموذج ماوس عفوية ورم خبيث من "بدكسس اتفاقية حقوق الطفل":
   1. إعداد تعليق خلية بما في ذلك 5 × 10⁵ خلايا في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 50% مصطنعة المصفوفة خارج الخلية الواحدة والماوس. الإبقاء على تعليق على الجليد قبل الاستخدام. استخدام هيموسيتوميتير لعد الخلايا السرطانية، كما هو مبين في الخطوة 4، 3.
   2. تخدير بماوس مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%، كما هو مبين في الخطوة 1، 6.
   3. ضع الماوس وتد في موقف ضعيف على مقاعد البدلاء المختبر. فهم مخاطية المستقيم بملاقط معقمة واسحبه برفق خارج فتحه الشرج. ثم حقن فورا تعليق خلية إعدادها في الخطوة 7.7.1 إلى سوبموكوسا المستقيم من الماوس باستخدام حقنه (إبرة الحجم: 22 ز). وتستخدم الفئران 4 – 6 كل مجموعة بشكل روتيني، لتقييم النتائج.
8. لإنشاء نموذج تجريبي ورم خبيث من "بدكسس لجنة حقوق الطفل":
   1. إعداد تعليق خلية أورجانويد اتفاقية حقوق الطفل بما في ذلك 4 × 10⁴ خلايا في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للماوس. الإبقاء على تعليق على الجليد قبل الاستخدام. استخدام هيموسيتوميتير لعد الخلايا السرطانية (الخطوة 4، 3).
   2. تخدير بماوس مع استنشاق إيسوفلوراني باستخدام جهاز التخدير استنشاق الحيوانات الصغيرة وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%، كما هو مبين في الخطوة 1، 6.
   3. ضع الماوس وتد أنيسثيتيزيد في موقف معرضة على مقاعد البدلاء المختبر. إجراء شق صغير في الجزء السفلي من الجناح الأيسر وثم قطع الصفاق فضح الطحال باستخدام مقص معقم والملقط بعناية. فهم في الأنسجة الدهنية التي تعلق على الطحال مع ملاقط معقمة، ثم ببطء بحقن 50 ميليلتر من تعليق خلية (أعدت الصيغة الواردة أعلاه، خطوة 8.1) الطحال. تكون على يقين من أن تعليق خلية يتم حقن مناسب دون التسرب إلى الخارج، ومن الطحال. وتستخدم الفئران 4 كل مجموعة بشكل روتيني، لتقييم النتائج.
9. ضع جميع الفئران على وسادة دافئة بعد الجراحة والحفاظ على موقف راقد القصية حتى يتم استعادة الوعي الكافي، كما هو موضح في الخطوة 1، 11. وبمجرد الفئران شفوا تماما، إعادتها إلى اقفاصها المنزل. لمنع اﻻفتراس، لا تسمح بتربية مع الحيوانات غير تعمل في نفس القفص.
10. التحقق من وجود تسرب خياطة وتأكيد أن الفئران هم على قيد الحياة، في المجموعة المعالجة جراحيا، في اليوم التالي. تحقق من الفئران لعلامات المرض وقياس أحجام الورم، استخدام الفرجار، في الفئران كل مرة واحدة في أسبوع.
11. مراقبة الفئران للكشف عن ورم خبيث عفوية (لفترات تصل إلى 2.5 أشهر) وخبيث التجريبية (1 شهر) بعد الحقن.
12. التضحية الفئران عن طريق التخدير والتفكك عنق الرحم في الأيام المشار إليها. تشريح الأورام الأولية والأنسجة المختلفة بما فيها الكبد والرئتين. ضع تشريح الأورام والأجهزة في 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج على 10 سم طبق بيتري وتخزينها على الجليد.
13. للكشف عن الخلايا أورجانويد CRC الحاملات للتجارة والنقل، مراقبة تشريح الأنسجة تحت مجهر ستيريو-الأسفار. الحصول على الصور مع كاميرا CCD وإعداد باستخدام برامج معالجة الصور القياسية.

النتائج

وقد تم غدية القولون الابتدائي شخصت باعتدال متمايزة مستأصل جراحيا من امرأة عمرها 76 تنم في تصنيف، المرحلة IIIa، متبوعاً بالعلاج الكيميائي بعد الجراحة. إيمونوهيستوتشيميكالي الخلايا CRC الابتدائي الملون إيجابية لكي-67 و carcinoembryonic antigen وعموم سيتوكيراتين ه-كادهيرين. تم زرع قطعة من الورم ريسيكتيد أيضا تحت الجلد في الفئران وتد لتوليد نموذج PDX القولون. ثم استخلصت الخلايا أورجانويد CRC لزراعة الأنسجة من PDX القولون التي وضعت تحت الجلد في هذه الفئران. أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل كانت ق...

المناقشة

على الرغم من أن نموذج PDX اتفاقية حقوق الطفل قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة نمو الورم الرئيسي، ما إذا كان هذا النموذج ينطبق أيضا على التحقيق في ورم خبيث قد لا بعد تم تماما توضيحها. وكانت أيضا الانبثاث العفوية بالكاد يمكن كشفها في الكبد والرئتين من مختلف عن القولون PDX نماذج^4،10. للكشف عن ميكروميتاستاسيس مع حساسية عالية، يمكننا وضع بروتوكول ترانسدوسينج جزيئات بروتينات فلورية خضراء لينتيفيرال في أورجانويدس المستمدة من PDX حقوق الطفل قبل أورثوتوبيك والحقن الوريدية ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
NOD / Shi-scid IL2R & gamma ؛ الفئران الفارغة (NOG)	المعهد المركزي لحيوانات التجارب ، كاناغاوا ، اليابان		تولد الفئران الذكور البالغة من العمر 6 أسابيع في ظل ظروف خالية من الجراثيم وخالية من مسببات الأمراض
الجرح 2 & مرات ؛ تصنيع 10 مم	Natsume ، اليابان	#C-21-S	الأوتوكلاف قبل استخدام
حقنة هاميلتون حجم الإبرة: 22 مقياس	طوكيو للعلوم ، اليابان		تطهير مع 70٪ كحول و PBS معقم.
6 آبار لوحة	BMBio	# 92006
12 بئر لوحة	BMBio	# 92412
15 مل أنبوب مخروطي	سوميتونو باكليت	MS-57150
50 مل أنبوب مخروطي	سوميتومو باكليت	MS-57500
أنبوب ميكرو	إيبندورف	# 0030120086	الأوتوكلاف قبل الاستخدام
الدم	Erma	# 03-202-1
40 و مو ؛ مصفاة الخلايا m	Corning	# 352340
مصفوفة الغشاء القاعدي Matrigel	Corning	# 354234	تخزين aliqupts عند -20 درجة مئوية ؛ ضعها على الثلج حتى تستخدم
الكولاجيناز نوع 1	سيجما	#C1030	150 مجم / مل من نوع الكولاجيناز 1 في 1 & مرات ؛ برنامج تلفزيوني. تخزين aliqupts عند -20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة
Accutase	Innovate Cell Technologies	#5V2623A	قم بتخزين في 4 درجات مئوية.
DMEM / F-12 مع GlutaMAX & trade ؛	Gibco	# 10565018	Store عند 4 درجات مئوية دافئ عند 37 درجة مئوية ؛ C قبل الاستخدام
Cell banker 1plus	ZENOAQ	# 628	Store at 4 درجات مئوية استخدم في غضون شهر
واحد Penicillin	Gibco	# 15140122	Store at 4 درجات مئوية استخدم في غضون شهر
واحد Streptomycin	Gibco	# 15140122	Store at 4 درجة مئوية استخدم في غضون شهر
واحد hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	يخزن في -20 درجة مئوية أضف إلى متوسط في نفس يوم الاستخدام
Y27632 ، مثبط ROCK	Wako	# 253-00591	يخزن في -20 درجة مئوية ، أضف إلى الوسيط في ><نفس اليوم الذي يستخدم
	الثقافة Gibco		DMEM / F-12 مع GlutaMAX & trade مكمل غذائي مكمل بنسبة 5٪ FBS و 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكرو ؛ جم / مل ستربتومايسين. يخزن في 4 درجات مئوية. استخدم في غضون 1 شهر.
وسيط ثقافة العضوية CRC مع 1٪ أو 5٪ FCS			DMEM / F-12 مع مكمل GlutaMAX & trade (Gibco # 10565018) مكمل مع 1٪ أو 5٪ FCS ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكرو ؛ جم / مل ستربتومايسين ، 2 نانوغرام / مل hEGF و 10 & ميكرو ؛ M Y27632 ، مثبط ROCK. مخزن في 4 درجات مئوية. استخدم في غضون 1 شهر.
الوصي على التعداء FuGENE 6	Roche	11814 443001
Minisart 0.45 & micro ؛ مرشح m	Sartorius stedim	17598-K
5 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلين	بيكمان كولتر	326819
ناقلات PRRL-GFP	هدية من الدكتور روبرت أ. واينبرغ
pCMV-VSV-G	هدية من الدكتور روبرت أ. واينبرغ
pCMV-dR8.2 dvpr	هدية من الدكتور روبرت أ. واينبرغ
دلو التأرجح SW55Ti الدوار	بيكمان كولتر
أ زايس أكسيوبلان 2 مجهر تيريو	فلوري زايس