Method Article

تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة لإعداد مجموعة متعدد المكروية خلوية اصطناعية (ماكمي) عن التلاعب الفائق الفيزيائية والكيميائية العظة محاكاة في فيفو ميكرونفيرونمينتس الخلوية وإلى تحديد البيئة المثلى الخلوية للخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) مع خلية واحدة التنميط.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميكرونفيرونمينتس الخلوية تتكون من مجموعة متنوعة من الرموز، مثل عوامل النمو ومصفوفات خارج الخلية والتفاعلات بين الخلايا. هذه الرموز هي مدبرة جيدا وذات أهمية حاسمة في تنظيم وظائف الخلية في نظام معيشة. على الرغم من أن عددا من الباحثين حاولوا التحقيق في العلاقة بين العوامل البيئية والوظائف الخلوية المرجوة، ما زال غير معروف. هذا إلى حد كبير بسبب عدم وجود منهجية سليمة لتقليد هذه الرموز البيئية في المختبر، وفي نفس الوقت اختبار منبهات بيئية مختلفة في الخلايا. هنا، نحن تقرير منصة متكاملة من القنوات موائع جزيئية ومجموعة نانوفيبير، يليها تحليل خلية واحدة عالية-المحتوى، لبحث تعمل الخلايا الجذعية التي غيرت بعوامل بيئية متميزة. وللتدليل على تطبيق هذا النظام الأساسي، تركز هذه الدراسة على تعمل ذاتيا تجديد الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). نقدم هنا، إجراءات إعداد مصفوفة نانوفيبير وهيكل موائع جزيئية في تلفيق صفيف متعدد المكروية الخلوية الاصطناعية (ماكمي). وعلاوة على ذلك، يتم وصف الخطوات الإجمالية من خلية واحدة التنميط، خلية تلطيخ مع عدة علامات مضيئة ومتعددة الأسفار التصوير، والتحليلات الإحصائية،.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (هبسكس)1،2 الذاتي تجديد غير محدود، وتفرق في مختلف الأنسجة الأنساب، التي يمكن أن تحدث ثورة في تطوير الأدوية والعلاجات المستندة إلى الخلية، وهندسة الأنسجة والطب التجديدي 3 , 4 , 5 , 6-أطباق الثقافة العامة ولوحات ميكروتيتير، ومع ذلك، ليست مصممة لتمكين التلاعب الخلية الجسدية والكيميائية الدقيقة على المستوى الخلوي مع طائفة من نانو إلى الصغرى-متر، وعامل حاسم لتوسيع الخلوية، التجديد الذاتي، والتمايز. ولمعالجة هذا العيب، حققت الدراسات أدوار ميكرونفيرونمينت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تلفيق الصفيف ماكمي

ملاحظة: يتم سرد جميع المواد والمعدات في "الجدول المواد".

  1. إعداد أقنعة لمجموعة نانوفيبير والعفن لهيكل موائع جزيئية
    1. إنشاء صور ثلاثية الأبعاد (3D) للاقنعة المستخدمة للمصفوفات نانوفيبير وقوالب لهياكل موائع جزيئية باستخدام حزم برامج الرسومات 3D الكمبيوتر (الجدول 1).
      ملاحظة: قراءة الصور الثلاثية الأبعاد وطباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. وقد أقنعة المطبوعة والعفن نفس الأبعاد مع الصور الثلاثية الأبعاد المحددة باستخدام برامج الرسومات في خطوة 1.1.1.
    2. طباعة أقنعة والعفن بناء على هذه التصاميم باستخدام طابعة 3D.
      ملاحظة: في هذ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صفائف ماكمي: التصميم والتصنيع: في تركيبة مع تكنولوجيا نانوفيبير، قمنا باستخدام موائع جزيئية خلية ثقافة وفحص التقنيات المستخدمة سابقا لتحديد الظروف المثلى هبسك الذاتي تجديد أو التمايز35،36 (الشكل 1). وهذا أيضا مناسبة لإنشاء الاختبارات المستندة إلى الخلية الفائق قوية نظراً لدقة يمكن السيطرة عليها وقابلة للتوسيع42،،من43

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يوضح طريقة الفحص الأولى ﻹنشاء نظام ثقافة قوية للصيانة هبسكس المؤهلين. أولاً، يمكننا وصف كيفية إعداد برنامج يضم ECMs الاصطناعية المتنوعة وخلية البذر الكثافة باستخدام جهاز موائع جزيئية متكاملة مع مجموعة نانوفيبير، الصفيف ماكمي. الكمية، والثاني يستند إلى صورة وحيدة الخلية phenotyping كان يؤديها50 لتقييم نتائج الخلوية الفردية والسلوكيات التي غيرت من ملامح البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية المتميزة. في هذا البروتوكول، تميزت البيئة تتكون من نانوفيبير جي تي وبروتينات ECM التحكم الإيجابي في.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الأستاذ أ. ناكاتسوجي في إيسيمس، جامعة كيوتو، لتوفير حقوق دإط الخلايا. ونشكر أيضا ماروياما ألف الأستاذ في "معهد طوكيو للتكنولوجيا" لدعمه في استخدام مجهر القوة الذرية. سخاء قدم التمويل من "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم" (JSPS؛ 22350104، 23681028، 25886006، و 24656502)؛ كما تم توفير التمويل "الطاقة الجديدة" ومنظمة تطوير التكنولوجيا الصناعية (نيدو) و "مؤسسة علوم الحياة تيرومو". WPI-إيسيمس معتمد من قبل في العالم رئيس الوزراء الدولي أبحاث المركز مبادرة (WPI)، ووزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان. جزء من هذا العمل يدعمه مركز تكنولوجيا النانو جامعة كيوتو ومرفق تجهيز نانو داريجا في "مشروع منصة تقنية النانو" تحت رعاية ي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
البوليسترين (PS)Sigma# 182435متوسط ميغاواط: 290،000 ، متوسط Mn: 130،000
بولي ميثيل جلوتاريميد (PMGI) MicroChemG113113
الجيلاتين (GT)SigmaG2625من جلد الخنازير ، مجموعة
المطاط الصناعي السيليكوني من النوع A Sylgard 184Doe Corning Toray# 1064291عامل معالجة PDMS وقاعدة المطاط الصناعي السيليكون هي مكونات هذه المجموعة.
OpenSCADهذا هو برنامج رسومات كمبيوتر ثلاثي الأبعاد مجاني (http://www.openscad.org/) يستخدم لتصميم قالب جهاز الموائع الدقيقة.
أوتوكاد 2014أوتوديسكهذا هو برنامج رسومات الكمبيوتر ثلاثي الأبعاد (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) يستخدم لتصميم القناع المستخدم في إعداد صفيف الألياف النانوية.
طابعة ثلاثية الأبعاد, AGILISTA-3000Keyence
راتنج قابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية, AR-M2Keyenceيستخدم هذا للطباعة ثلاثية الأبعاد بواسطة Agilista.
حمض الخليكسيجما# 338826&ge ؛ 99.99٪
أسيتات الإيثيلسيجما# 270989لامائية ، 99.8٪
تتراهيدروفوران (THF)سيجما# 401757
MSP-30Tجهازآلة الاخرق المغنطرون
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific# 242811هذه صفيحة أساسية من البوليسترين يتم إنشاء مجموعة الألياف النانوية عليها. حجم هذه اللوحة عادة ما يكون 127.7 × 85.5 مم.
آلة تفريغ الهالة من نوع البندقيةShinko Electric & أجهزةCFG-500هذا الجهاز العملي لتوليد الهالة لتنشيط السطح السفلي لطبقة PDMS في الخطوة 1.5 "تجميع مصفوفات MACME" في البروتوكول.
حقنة 5 ملTerumoSS-05SZ
إبرة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ (مقياس 23)Nipro# 2166القطر الخارجي والطول 0.6 و 32 مم على التوالي.
مصدر طاقة عالي الجهدTechDempaz
1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide ، هيدروكلوريدDojindoW001
N-HydroxysuccinimideSigma# 56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning# 354277يشار إلى هذا البروتين على أنه مصفوفة هلام غشاء القاعدي في البروتوكول.
CellAdhere Vitronectin ، Human ، SolutionSTEMCELL Technologies# 07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies# 05940وسيط ثقافة خال من المغذيات وخالية من xeno لصيانة خلايا ES و iPS البشرية
Y-27632Wako Pure Chemical Industries# 253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X) ، الفينول الأحمرThermo Fisher Scientific# 12605028هذا هو بروتياز مؤتلف يشبه التربسين لتفكك خلايا الثدييات الملتصقة.
مجموعة التصوير Click-iT EdU مع Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086تم إجراء وضع العلامات الفلورية على الخلايا المتكاثرة في تلطيخ الفلورسنت على اللوحة على طول دليل المنتج لهذه المجموعة.
الملحق الخامس ، أليكسا فلور 594 المترافقثيرمو فيشر العلميA13203
4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) الجسمالمضاد Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 (C-10)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-5279
الحمار المضاد للفأر IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875هذا جسم مضاد ثانوي يستخدم في تلطيخ الخلايا الفلورية على اللوحة.
ECLIPSE Ti-E Nikonهذا مجهر مضان مقلوب مجهز بعدسة موضوعية CFI Plan Fluor 4 & times ؛ / 0.13 NA (نيكون) ، كاميرا CCD (ORCA-R2 ، Hamamatsu) ، مصباح زئبق (Intensilight ، نيكون) ، مرحلة XYZ الآلية (Ti-S-ER المرحلة الآلية مع أجهزة التشفير ، نيكون) ، ومكعبات الترشيح لأربع قنوات مضان (DAPI ، GFP HYQ ، TRITC ، Cy5 ؛ نيكون)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonهذا هو برنامج تصوير مجهر يستخدم للحصول على الصور تلقائيا.
CellProfiler ، الإصدار 2.1.0هذا برنامج مفتوح مجاني لتحليل صور الخلية (http://cellprofiler.org/).
RSOM بواسطة حزمة kohonen من هذا البرنامج. هذا متاح مجانا (https://www.r-project.org/).
المجموعة 3.0هذا هو برنامج التجميع مفتوح المصدر (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). يتم إجراء التجميع الهرمي غير الخاضع للإشراف باستخدام هذا البرنامج.
Java TreeViewيستخدم هذا البرنامج مفتوح المصدر (http://jtreeview.sourceforge.net/) لتصور بيانات التجميع كخريطة تمثيلية ومخطط شجيرات.
H9 الخلايا الجذعية الجنينية البشريةWiCell Stem BankWA09
فراغ يستخدم يتم إجراء تحليل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles