Method Article

تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة لإعداد مجموعة متعدد المكروية خلوية اصطناعية (ماكمي) عن التلاعب الفائق الفيزيائية والكيميائية العظة محاكاة في فيفو ميكرونفيرونمينتس الخلوية وإلى تحديد البيئة المثلى الخلوية للخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) مع خلية واحدة التنميط.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميكرونفيرونمينتس الخلوية تتكون من مجموعة متنوعة من الرموز، مثل عوامل النمو ومصفوفات خارج الخلية والتفاعلات بين الخلايا. هذه الرموز هي مدبرة جيدا وذات أهمية حاسمة في تنظيم وظائف الخلية في نظام معيشة. على الرغم من أن عددا من الباحثين حاولوا التحقيق في العلاقة بين العوامل البيئية والوظائف الخلوية المرجوة، ما زال غير معروف. هذا إلى حد كبير بسبب عدم وجود منهجية سليمة لتقليد هذه الرموز البيئية في المختبر، وفي نفس الوقت اختبار منبهات بيئية مختلفة في الخلايا. هنا، نحن تقرير منصة متكاملة من القنوات موائع جزيئية ومجموعة نانوفيبير، يليها تحليل خلية واحدة عالية-المحتوى، لبحث تعمل الخلايا الجذعية التي غيرت بعوامل بيئية متميزة. وللتدليل على تطبيق هذا النظام الأساسي، تركز هذه الدراسة على تعمل ذاتيا تجديد الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). نقدم هنا، إجراءات إعداد مصفوفة نانوفيبير وهيكل موائع جزيئية في تلفيق صفيف متعدد المكروية الخلوية الاصطناعية (ماكمي). وعلاوة على ذلك، يتم وصف الخطوات الإجمالية من خلية واحدة التنميط، خلية تلطيخ مع عدة علامات مضيئة ومتعددة الأسفار التصوير، والتحليلات الإحصائية،.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (هبسكس)1،2 الذاتي تجديد غير محدود، وتفرق في مختلف الأنسجة الأنساب، التي يمكن أن تحدث ثورة في تطوير الأدوية والعلاجات المستندة إلى الخلية، وهندسة الأنسجة والطب التجديدي 3 , 4 , 5 , 6-أطباق الثقافة العامة ولوحات ميكروتيتير، ومع ذلك، ليست مصممة لتمكين التلاعب الخلية الجسدية والكيميائية الدقيقة على المستوى الخلوي مع طائفة من نانو إلى الصغرى-متر، وعامل حاسم لتوسيع الخلوية، التجديد الذاتي، والتمايز. ولمعالجة هذا العيب، حققت الدراسات أدوار ميكرونفيرونمينتس الخلوية في تنظيم قرارات مصير الخلية و وظائف الخلية4. في السنوات الأخيرة، أجريت عددا متزايداً من الدراسات لإعادة بناء ميكرونفيرونمينتس الخلوية في المختبر7،8. وقد أنشأت عمليات تصنيع نانو والصغرى هذه ميكرونفيرونمينتس من خلال التلاعب بالمواد الكيميائية9،10،11،،من1213، 14،15،،من1617 و المادية18،،من1920 العظة البيئية. وحتى الآن، لم ترد تقارير التحقيق بصورة منهجية الآليات الكامنة لمنبهات البيئية الكيميائية والفيزيائية في الخلية-مصير القرارات والمهام داخل منصة واحدة.

وهنا، نقدم استراتيجية تقوم على أساس مبادئ تصميم بسيط إنشاء منصة فحص قوية (الشكل 1). أولاً، يمكننا وصف الإجراء تطوير منهاج عمل موحد لإنشاء ميكرونفيرونمينتس الخلوية تنوعاً، الاصطناعية باستخدام مصفوفة نانوفيبير وبنية موائع جزيئية: صفيف متعدد اصطناعية الخلوية المكروية (ماكمي) (الشكل 1ألف و 2 ألف). يحتوي الصفيف نانوفيبير 12 ميكرونفيرونمينتس مختلفة في تركيبات مختلفة من المواد نانوفيبير والكثافة. واستخدمت اليكتروسبينينج لاختلاق النانو. المواد نانوفيبير، مثل البوليستيرين (PS)21، بوليميثيلجلوتاريميدي (بمجي)22و23من الجيلاتين (GT)، صممت لاختبار خواصها الكيميائية، التي قد تؤثر على التصاق الخلايا والحفاظ على بلوريبوتينسي ( الشكل 2ب). كانت تتفاوت كثافة نانوفيبير بتغيير الوقت اليكتروسبينينج وتم تعريف النانو التي تم إنشاؤها وفقا لهذه الكثافة (الفلبينية، مع د = إكسلوو/منخفض/منتصف/عالي). يتكون هيكل موائع جزيئية من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) إيواء 48 خلية ثقافة الدوائر، والذي يمكن وضعه على طول قياسي أبعاد ميكروسكوبية 96-جيدا. PDMS بوليمر متوافق حيويا وتبديل الغاز تستخدم عموما لاختلاق أجهزة موائع جزيئية24. كل قناة موائع جزيئية قد صمم ليكون 700 مكم واسعة و 8.4 ملم بوقت طويل وكان مداخل اثنين في الحواف (الجدول 1). الدوائر بارتفاعات مختلفة (250، 500، و 1000 ميكرومتر) للتلاعب الأولية البذر خلية الكثافة (0.3 و 0.6 1.2 × 105 خلايا/سم2)، التي قد ترتبط بالبقاء على قيد الحياة، والانتشار، والتفريق بين هبسكس25 (الشكل 2-ج). عدد الخلايا في المصنف إلى غرفة تتناسب مع كثافة العمود فوق أرضية الغرفة، وهكذا الخلية الأولى بذر الكثافة كان يسيطر عليها إدخال تعليق الخلية نفسها في دوائر الثقافة مع ارتفاعات مختلفة. جميع قنوات مصممة لتكون ≥ 250 ميكرون عالية26 التقليل من آثار التوتر المنخفض الأكسجين27 وإجهاد القص28 في الخلايا. يتم اختصار قناة آفاق من 250 و 500 و 1000 ميكرومتر هنا ك XCD مع X = منخفض، منتصف، وعالية، على التوالي. تم تقصير في البيئات مع كثافة نانوفيبير متميزة وكثافة البذر الخلية الأولى ك "الكثافة density_Cell Material_NF" (مثلاً، GT_HighNF_HighCD: بيئة تتسم بالكثافة GT النانو وخلية أولية عالية-البذر الكثافة).

وفي وقت لاحق، نحن تصف كيفية إجراء تحليلات خلية واحدة التحقيق بصورة منتظمة في سلوك الخلية استجابة للعوامل البيئية (الشكل 1ب). كإثبات لمفهوم، حددنا البيئة الخلوية الأمثل لتجديد هبسك المتمتعة بالحكم الذاتي، ومهمة رئيسية ل صيانة (الشكل 1ب) هبسك29. الخلوي المستندة إلى الصور، متبوعاً بالتحليلات الإحصائية، يسمح للتفسير الكمي الفردية الاستجابات المظهرية الخلوية للبيئات الخلوية. من بين مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، تقدم هذه الورقة إجراء مفصل تحديد الشروط المثلى للحفاظ على هبسك الذاتي تجديد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تلفيق الصفيف ماكمي

ملاحظة: يتم سرد جميع المواد والمعدات في "الجدول المواد".

  1. إعداد أقنعة لمجموعة نانوفيبير والعفن لهيكل موائع جزيئية
    1. إنشاء صور ثلاثية الأبعاد (3D) للاقنعة المستخدمة للمصفوفات نانوفيبير وقوالب لهياكل موائع جزيئية باستخدام حزم برامج الرسومات 3D الكمبيوتر (الجدول 1).
      ملاحظة: قراءة الصور الثلاثية الأبعاد وطباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. وقد أقنعة المطبوعة والعفن نفس الأبعاد مع الصور الثلاثية الأبعاد المحددة باستخدام برامج الرسومات في خطوة 1.1.1.
    2. طباعة أقنعة والعفن بناء على هذه التصاميم باستخدام طابعة 3D.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، وكان طابعة حبر نفاثة تشبه 3D مع الراتنج الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة30. دقة الطابعة هي 635 × 400 نقطة في البوصة و 15 ميكرون في X، Y و Z، على التوالي، ومع ذلك، X الفعلية، القرار Y كان تقريبا أقل بأربع مرات.
  2. نانوفيبير-صفيف الإعداد (3 الشكلA)
    1. إعداد حلول البوليمر اليكتروسبينينج.
      1. تمييع السائل بمجي 13% مع رباعي هيدرو الفوران بنسبة 9% (w/v)22.
      2. حل ز 0.08 من PS (عدد متوسط الوزن الجزيئي (بالمليون): 130,000) في21من THF:dimethylformamide (نسبة حجم 1:1)، وإضافة THF:dimethylformamide تحقيق حجم ما يصل إلى 1 مل النهائي (8% (w/v) ملاحظة: الحل).
      3. حل 0.1 غرام من جي تي في المياه: حمض الخليك: إيثيل اسيتات (نسبة حجم 1:1.6:2.1)، وإضافة المياه: حمض الخليك: إيثيل اسيتات لتحقيق حجم ما يصل إلى 1 مل النهائي (10% (w/v) GT الحل) كوصف23،31.
    2. استخدام ماغي اﻷخرق آلة، بإيداع طبقة رقيقة من البلاتين بسمك 5-شمال البحر الأبيض المتوسط على البوليستيرين (PS) اللوح الأساس (127.7 × 85.5 ملم)، الذي يعمل بوصفه كاثود في الإعداد اليكتروسبينينج.
    3. تحميل كل حل البوليمر في محقن 5 مل مزودة بإبرة حادة 23-ز الفولاذ المقاوم للصدأ.
    4. والربط حقنه بالإبرة في مضخة المحاقن مع 12-سم إلى جانب جامع للجهاز اليكتروسبينينج.
    5. الاتصال إبرة حقنه لإمدادات طاقة عالية الجهد، ومجموعة لتطبيقها على 11 كيلوفولت.
    6. تعيين معدل الضخ 0.2 مل/ساعة.
    7. الحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة في 30 درجة مئوية و < 30% (v/v).
    8. وضع القناع على اللوح الأساس إعدادها في الخطوة 1.2.2.
    9. اختﻻق النانو على اللوح الأساس من خلال الثقوب للقناع بكثافات مختلفة عن طريق تغيير الوقت اليكتروسبينينج (مثلاً، 20، 60 و 90 و 180 s).
    10. إزالة القناع من اللوح الأساس.
      ملاحظة. يمكن رش الإيثانول في النانو GT اليكتروسبون قبل إزالة القناع لتجنب تقشير قبالة النانو GT جنبا إلى جنب مع القناع.
    11. كرر الخطوة 1.2.4-1.2.10 حتى انتهاء تصنيع نانوفيبير--الصفيف.
    12. ضع الصفيف nanofiber في مجفف عند 25 درجة مئوية ح 16 تتبخر المذيبات المتبقية.
    13. GT التشعب النانو مع 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) كاربودييميدي هيدروكلوريد (تنمية الصادرات) و 0.2 م ن-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) في الإيثانول عند 25 درجة مئوية ل 4 ح23.
    14. شطف النانو GT مرتين مع الإيثانول 99.5% (v/v) والفراغ-جاف عند 25 درجة مئوية ح 16.
  3. تصنيع هياكل موائع جزيئية (الشكل 3ب)
    1. مزيج ز 2 لعلاج عامل و 20 غراما من قاعدة PDMS PDMS (01:10 الوزن نسبة؛ بريبدمس). 24
    2. صب الخليط قبل PDMS على العفن ملفقة في الخطوة 1.2.
    3. إزالة الغاز المخلوط قبل PDMS في مجفف لمدة 30 دقيقة.
    4. علاج PDMS قبل الخليط في فرن عند 65 درجة مئوية ح 16.
  4. صفائف "الجمعية ماكمي" (الشكل 3ب)
    1. تقشر الهيكل PDMS الشفاء في خطوة 1.3.4 من العفن ونظيفة مع الإيثانول 70% (v/v).
    2. علاج الغلاف الجوي كورونا التصريف في الجانب السفلي من الهيكل PDMS32.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، تبرأ الإكليل على كامل سطح الطبقة 3 أو 4 مرات مع جهاز تفريغ كورونا "مفيد". استعيض عن الأكسجين البلازما العلاج مع الغلاف الجوي كورونا التفريغ لتغيير أدهيسيفينيس السطحية.
    3. تجميع الهيكل PDMS مع مجموعة نانوفيبير بسرعة.
    4. فرن-خبز عند 65 درجة مئوية لمدة يومين.

2-تحميل هيسكس في "صفيف ماكمي"

  1. للثقافة الروتينية H9 البشرية الخلايا الجذعية الجنينية (هيسكس)، والحفاظ على خلايا خالية من كرة كيميائيا تعريف الثقافة المتوسطة هبسك صيانة33 تستكمل مع 10 ميكرون روك Y-27632 المانع34 (المسمى هبسك المتوسطة) في ثقافة خلية 35 ملم طبق مغلف بغشاء الطابق السفلي جل مصفوفة (MG).
  2. مرور خلايا كل 4 إلى 7 أيام باستخدام حوزتي مثل التربسين المؤتلف.
  3. تعقيم مجموعة ماكمي مع الإيثانول 99.5%، قبل التحميل إلى الدوائر لمدة 10 دقائق، ثم قم بإزالة في الإيثانول. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
  4. إدخال ميليلتر 12 ملغ، 10 ميكروغرام/مل فيترونيكتين (VN)، و 0.1% (w/v) جي تي في مراقبة الثقافة الدوائر، واحتضان الدوائر في 37 درجة مئوية ح 1 معطف لهم على السطوح غرفة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، اختيرت ملغ، VN، و GT كمرجع بروتينات التصاق الخلايا والثقافة. سبب ملغ و VN المصفوفات زراعة الخلايا القياسية المستخدمة للحفاظ على هبسك الذاتي تجديد، أنها تستخدم كعناصر إيجابية؛ طلاء GT ثنائي الأبعاد (2DGT) أو غير طلاء (NC) استخدمت كعناصر سلبية.
  5. إدخال هبسك قبل حرارة متوسطة في جميع الدوائر من الصفيف ماكمي. احتضان الدوائر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. أغسل H9 هيس مثقف على طبق 35 ملم مع دببس، إضافة 0.5 مل من حوزتي مثل التربسين المؤتلف إلى الطبق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ونضح بعناية في supernatants مختلطة بحوزتي فقط.
    ملاحظة: في خطوة طموح، لا يتم فصل الخلايا.
  7. فور إضافة هبسك المتوسطة، بلطف الاستغناء عن المتوسط ضد سطح الطبق مرارا وتكرارا فصل الخلايا ونقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  8. الطرد المركزي في 200 غ س للحد الأدنى 3 Aspirate المادة طافية وتعليق الخلايا في متوسط هبسك المعالجون مسبقاً.
  9. إدخال 12 ميليلتر من تعليق خلية (1.2 × 106 خلايا مليلتر) في كل دائرة من دوائر موائع جزيئية.
    ملاحظة: إدخال الخلايا إلى غرفة واحدة من آخر باستخدام ميكروبيبيتي. نظراً لأن عدد الخلايا في المصنف إلى الدوائر تتناسب مع كثافة العمود أعلاه الكلمة الدائرة، يمكن التحكم في كثافة البذر الخلية الأولى حتى ولو استخدمت عينات من نفس الخلية تعليق. ضمان بيبيتينج ويتم ذلك برفق. إزالة الزائدة المتوسطة من الدوائر باستخدام عصا القطن ذات الرؤوس بعد التحميل. الصفيف ماكمي متوافق مع مختبر استخداماً الماصات والنظم المؤتمتة ماصة، وأنه لا يتطلب أي معدات خاصة.
  10. تغيير هبسك المتوسطة كل ح 12 والثقافة لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: وحدات تخزين ثابتة من الوسط (1.6 و 3.2 و 6.4 ميليلتر) يتم الاحتفاظ باستخدام الدوائر ذات أحجام مختلفة. خلايا الثقافة تحت شرط ثابت لتقليل إجهاد القص باستثناء تبادل ال35،مستنبت الخلية36.

3-الكمية التنميط خلية واحدة

  1. على لوحة تلوين الخلية نيون
    ملاحظة:     لتحليل التغيرات المظهرية الذاتي تجديد هبسكس، هذا البروتوكول المحدد علامات المظهرية الرئيسية الثلاثة لهذا البروتوكول: OCT4، 2-5-اثينيل '--ديوكسيوريديني (إيدو)، و"الخامس أنيكسين"، لقياس حالة بلوريبوتينسي، والانتشار، والمبرمج ، على التوالي (الشكل 2ب). 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) يستخدم لتحديد نواة الخلية. OCT4 أحد العوامل الحاسمة النسخ من بلوريبوتينسي.
    1. احتضان هيسكس H9 في صفائف ماكمي في المتوسط هبسك تكملة مع 10 ميكرون إيدو ألكاين في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. بعد الغسل بربط annexin المخزن المؤقت (10 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4)، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 2.5 مم كاكل2)، وصمة عار الخلايا مع برتقالي الفلورسنت Annexin صبغ المتقارن الخامس في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. إصلاح الخلايا في برنامج تلفزيوني مع بارافورمالدهيد 4% (v/v) في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومن ثم يشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين.
    4. بيرميبيليزي الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مع 0.3% (v/v) X-100 تريتون في 20 درجة مئوية ح 16.
      ملاحظة: بارافورمالدهيد يضعف السندات بين لوحة قاعدة بلاستيكية وهيكلا موائع جزيئية PDMS. وهكذا، يمكن أيضا إجراء مفرزة طبقة PDMS من الصفيف في خطوة 3.2.1 الحق بعد هذه الخطوة.
    5. احتضان خلايا في رد فعل على أساس تريس المخزن المؤقت مع أزيد صبغ الأحمر نيون في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. احتضان الخلايا بحجب المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني مع مصل الماعز العادي 5% (v/v)، المصل حمار عادي 5% (v/v)، 3% (w/v) ألبومين المصل البقري، 0.1% (v/v) توين-20، و 0.1% (w/v) ن-دوديسيل-β-د-مالتوسيدي) في 4 درجات مئوية عن ح 16.
    7. احتضان في برنامج تلفزيوني مع 0.5% (v/v) حل X-100 تريتون والبشرية جسم OCT3/4 (الماوس IgG) في 4 درجات مئوية عن ح 16.
    8. احتضان في المخزن المؤقت حظر مع الماوس المضادة مفتش (H + L) حمار المسمى صبغ أخضر-فلوري في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    9. احتضان في برنامج تلفزيوني مع DAPI في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    10. استبدال DAPI برنامج تلفزيوني مع برنامج تلفزيوني.
    11. الحفاظ على الصفيف ماكمي عند 4 درجة مئوية لحين الحصول على الصور.
  2. التقاط صور (الرقم 4)
    1. تقشر الهيكل PDMS موائع جزيئية من الصفيف ماكمي.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني المتبقية من الصفيف ماكمي وتطبيق والغليسيرول 90%(v/v) في برنامج تلفزيوني على الخلايا ووضع كوفيرسليبس فوق الخلايا الملون.
    3. تعيين اللوحة رأسا على مرحلة المجهر المقلوب الأسفار.
    4. الحصول على الصور الملونة 12-بت تلقائياً باستخدام كافة مكونات محركات (المرحلة والمرشحات، مصراع، وأنظمة التركيز) التي كانت تسيطر عليها مجهر برامج التصوير.
      ملاحظة. في هذا البروتوكول، ويتم ضبط مرات التعرض للوصول إلى القرب من قيم الكثافة القصوى (أعلى كثافة بكسل: 4096)، لكنها لا تشبع، لكل صورة، DAPI، OCT4، أنيكسين الخامس، وايدو.
  3. معالجة الصور الموجهة بالحاسوب والأسفار إشارة التحديد الكمي (الرقم 5)
    ملاحظة:     هو إجراء تحليل صورة الخلية التالية استناداً إلى أسلوب تم وصفه مسبقاً37.
    1. تحويل الصور الملونة إلى تدرج الرمادي.
    2. حساب قيمة عتبة واحدة لكل صورة DAPI مع أسلوب أوتسو، وتصنيف بكسل أعلى من العتبة الأمامية وأدناه كخلفية. تأكد من تطابق القيمة المقدمة لشدة الفلورسنت DAPI.
      ملاحظة: عملية تحليل الصورة يحتوي على 5 خطوات؛ تحديد الكائنات الأولية في DAPI الصور، وتحديد الكائنات الثانوية في OCT4، أننيكسين الخامس، والصور إيدو، على التوالي، وقياس كثافة الكائن. ويوفر الشكل 3 صور واجهة المستخدم الرسومية (GUI) على الإعداد لمعالجة الصور.
    3. قياس كثافة الفلورسنت OCT4 وايدو على كل صورة.
    4. تحديد منطقة ملطخة "أننيكسين الخامس" مع أسلوب الدعوة، وقياس شدة الفلورسنت.
  4. 3.4. تحليل إحصائية لتصور فردية تعمل الخلوية في تصوير خلية واحدة
    1. تطبيع كثافات الفلورسنت الإدخال لكل علامة المظهرية بالتوسيط وتحجيم هذه المتغيرات لإعطائها وزنا متساويا.
    2. إجراء تحليل لخريطة (SOM) التنظيم الذاتي باستخدام بيئة برمجيات الحوسبة الإحصائية والرسومات كما هو موضح بالدراسات السابقة38،39.
      1. إنشاء 25 سوم العقد مع المميزة الأربعة "codebook ناقلات" المقابلة لشدة الفلورسنت أربع علامات، DAPI، إيدو، و "الخامس أننيكسين"، و OCT4.
      2. تعيين الخلايا الفردية في كل المكروية لعقدة "فوز" (معظم مماثلة)، والأرض كتواتر الخلية، موجبة ناقلات codebook العقدة الفائزة يتم تحديثها باستخدام متوسط مرجح، حيث الوزن هو معدل التعلم (هنا، 0.05 ك افتراضي).
        ملاحظة: حذف البيانات من الدوائر التي تحتوي على خلايا أقل من 1,000 لأن مجموعات البيانات التي تحتوي على بعض الخلايا ولم تقدم نتائج سوم إحصائيا ذات الصلة.
    3. القيام بتجميع التسلسل الهرمي غير خاضعة للرقابة مع القيم سوم-عقده استخدام أسلوب الربط في المتوسط بناء على ارتباط بيرسون من برامج تجميع40.
    4. تقدم بيانات التجميع في وجهات النظر ديندروجرام و heatmap41.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صفائف ماكمي: التصميم والتصنيع: في تركيبة مع تكنولوجيا نانوفيبير، قمنا باستخدام موائع جزيئية خلية ثقافة وفحص التقنيات المستخدمة سابقا لتحديد الظروف المثلى هبسك الذاتي تجديد أو التمايز35،36 (الشكل 1). وهذا أيضا مناسبة لإنشاء الاختبارات المستندة إلى الخلية الفائق قوية نظراً لدقة يمكن السيطرة عليها وقابلة للتوسيع42،،من43

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يوضح طريقة الفحص الأولى ﻹنشاء نظام ثقافة قوية للصيانة هبسكس المؤهلين. أولاً، يمكننا وصف كيفية إعداد برنامج يضم ECMs الاصطناعية المتنوعة وخلية البذر الكثافة باستخدام جهاز موائع جزيئية متكاملة مع مجموعة نانوفيبير، الصفيف ماكمي. الكمية، والثاني يستند إلى صورة وحيدة الخلية phenotyping كان يؤديها50 لتقييم نتائج الخلوية الفردية والسلوكيات التي غيرت من ملامح البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية المتميزة. في هذا البروتوكول، تميزت البيئة تتكون من نانوفيبير جي تي وبروتينات ECM التحكم الإيجابي في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الأستاذ أ. ناكاتسوجي في إيسيمس، جامعة كيوتو، لتوفير حقوق دإط الخلايا. ونشكر أيضا ماروياما ألف الأستاذ في "معهد طوكيو للتكنولوجيا" لدعمه في استخدام مجهر القوة الذرية. سخاء قدم التمويل من "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم" (JSPS؛ 22350104، 23681028، 25886006، و 24656502)؛ كما تم توفير التمويل "الطاقة الجديدة" ومنظمة تطوير التكنولوجيا الصناعية (نيدو) و "مؤسسة علوم الحياة تيرومو". WPI-إيسيمس معتمد من قبل في العالم رئيس الوزراء الدولي أبحاث المركز مبادرة (WPI)، ووزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان. جزء من هذا العمل يدعمه مركز تكنولوجيا النانو جامعة كيوتو ومرفق تجهيز نانو داريجا في "مشروع منصة تقنية النانو" تحت رعاية يأمرون، اليابان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
البوليسترين (PS)Sigma# 182435متوسط ميغاواط: 290،000 ، متوسط Mn: 130،000
بولي ميثيل جلوتاريميد (PMGI) MicroChemG113113
الجيلاتين (GT)SigmaG2625من جلد الخنازير ، مجموعة
المطاط الصناعي السيليكوني من النوع A Sylgard 184Doe Corning Toray# 1064291عامل معالجة PDMS وقاعدة المطاط الصناعي السيليكون هي مكونات هذه المجموعة.
OpenSCADهذا هو برنامج رسومات كمبيوتر ثلاثي الأبعاد مجاني (http://www.openscad.org/) يستخدم لتصميم قالب جهاز الموائع الدقيقة.
أوتوكاد 2014أوتوديسكهذا هو برنامج رسومات الكمبيوتر ثلاثي الأبعاد (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) يستخدم لتصميم القناع المستخدم في إعداد صفيف الألياف النانوية.
طابعة ثلاثية الأبعاد, AGILISTA-3000Keyence
راتنج قابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية, AR-M2Keyenceيستخدم هذا للطباعة ثلاثية الأبعاد بواسطة Agilista.
حمض الخليكسيجما# 338826&ge ؛ 99.99٪
أسيتات الإيثيلسيجما# 270989لامائية ، 99.8٪
تتراهيدروفوران (THF)سيجما# 401757
MSP-30Tجهازآلة الاخرق المغنطرون
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific# 242811هذه صفيحة أساسية من البوليسترين يتم إنشاء مجموعة الألياف النانوية عليها. حجم هذه اللوحة عادة ما يكون 127.7 × 85.5 مم.
آلة تفريغ الهالة من نوع البندقيةShinko Electric & أجهزةCFG-500هذا الجهاز العملي لتوليد الهالة لتنشيط السطح السفلي لطبقة PDMS في الخطوة 1.5 "تجميع مصفوفات MACME" في البروتوكول.
حقنة 5 ملTerumoSS-05SZ
إبرة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ (مقياس 23)Nipro# 2166القطر الخارجي والطول 0.6 و 32 مم على التوالي.
مصدر طاقة عالي الجهدTechDempaz
1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide ، هيدروكلوريدDojindoW001
N-HydroxysuccinimideSigma# 56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning# 354277يشار إلى هذا البروتين على أنه مصفوفة هلام غشاء القاعدي في البروتوكول.
CellAdhere Vitronectin ، Human ، SolutionSTEMCELL Technologies# 07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies# 05940وسيط ثقافة خال من المغذيات وخالية من xeno لصيانة خلايا ES و iPS البشرية
Y-27632Wako Pure Chemical Industries# 253-00513
TrypLE Express Enzyme (1X) ، الفينول الأحمرThermo Fisher Scientific# 12605028هذا هو بروتياز مؤتلف يشبه التربسين لتفكك خلايا الثدييات الملتصقة.
مجموعة التصوير Click-iT EdU مع Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086تم إجراء وضع العلامات الفلورية على الخلايا المتكاثرة في تلطيخ الفلورسنت على اللوحة على طول دليل المنتج لهذه المجموعة.
الملحق الخامس ، أليكسا فلور 594 المترافقثيرمو فيشر العلميA13203
4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) الجسمالمضاد Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 (C-10)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-5279
الحمار المضاد للفأر IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875هذا جسم مضاد ثانوي يستخدم في تلطيخ الخلايا الفلورية على اللوحة.
ECLIPSE Ti-E Nikonهذا مجهر مضان مقلوب مجهز بعدسة موضوعية CFI Plan Fluor 4 & times ؛ / 0.13 NA (نيكون) ، كاميرا CCD (ORCA-R2 ، Hamamatsu) ، مصباح زئبق (Intensilight ، نيكون) ، مرحلة XYZ الآلية (Ti-S-ER المرحلة الآلية مع أجهزة التشفير ، نيكون) ، ومكعبات الترشيح لأربع قنوات مضان (DAPI ، GFP HYQ ، TRITC ، Cy5 ؛ نيكون)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonهذا هو برنامج تصوير مجهر يستخدم للحصول على الصور تلقائيا.
CellProfiler ، الإصدار 2.1.0هذا برنامج مفتوح مجاني لتحليل صور الخلية (http://cellprofiler.org/).
RSOM بواسطة حزمة kohonen من هذا البرنامج. هذا متاح مجانا (https://www.r-project.org/).
المجموعة 3.0هذا هو برنامج التجميع مفتوح المصدر (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). يتم إجراء التجميع الهرمي غير الخاضع للإشراف باستخدام هذا البرنامج.
Java TreeViewيستخدم هذا البرنامج مفتوح المصدر (http://jtreeview.sourceforge.net/) لتصور بيانات التجميع كخريطة تمثيلية ومخطط شجيرات.
H9 الخلايا الجذعية الجنينية البشريةWiCell Stem BankWA09
فراغ يستخدم يتم إجراء تحليل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473(2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles