مقالة منهجية

توليف للأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران تعديل مع جسيمات فضة نانوية وتقييم الخصائص السامة للخلايا والأنشطة المضادة للبكتيريا

DOI:

10.3791/57384

⸱

مايو 10, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomaterials, Biomedical Research Institute, Korea Institute of Science and Technology, 2School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 3Division of Synthetic Biology and Regenerative Medicine, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، تم تصنيعه المواد النانوية الميكروبات أكسدة الحمضية للأنابيب النانوية الكربونية مولتيواليد وترسب جسيمات فضة نانوية التخفيض اللاحقة. تم إجراء الاختبارات الميكروبات النشاط وسيتوتوكسيسيتي مع المواد متناهية الصغر كإعداد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، يعاملون الأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران (MWCNTs) مع حل مائي من حامض الكبريتيك تشكيل مجموعة وظيفية المستندة إلى الأوكسجين. موكنتس الفضي أعدها ترسب الفضة محلول مائي من إنيو3 في موكنتس المؤكسدة من التخفيض. نظراً للون فريد تجويدها، لم يكن ممكناً تطبيقها إلى الحد الأدنى من تركيز المثبطة أو سمية المتقدرية فحوصات لتقييم الخصائص السمية والمضادة للبكتيريا، نظراً لأنها سوف تتداخل مع فحوصات. وقيست بمنطقة تثبيط وتركيز جراثيم الحد الأدنى ل Ag-موكنتس ولايف/الميت وفحوصات تريبان الأزرق المستخدمة لقياس الخصائص السمية والمضادة للبكتيريا دون أن تتدخل مع لون تجويدها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف النهائي من هذه الدراسة هو جعل المواد النانوية المضادة للبكتيريا الصديقة للبيئة التي يمكن أن تمنع نمو البكتيريا هذا النموذج الأغشية الحيوية. هذه المواد المضادة للبكتيريا النانوية لديها القدرة على التغلب على مشاكل المقاومة السمية والمضادات الحيوية المستخدمة عادة المواد الكيميائية أو المضادات الحيوية مركبات كيميائية. بيوفيلم هو رطب خارج الخلية البوليمرية مادة (EPS) التي تتكون من السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون1،2. منع تسلل المؤثرات الخارجية الأغشية الحيوية ويساعد البكتيريا تنمو بقوة3،4. الأغشية الحيوية يسبب رائحة والأمراض المعدية المزمنة5،6. ميثيلوباكتيريوم spp.، على سبيل المثال، ينمو بالتمسك بأماكن دائماً توجد فيها مياه أو حيث من الصعب التأكد من القضاء على البكتيريا بصورة مستمرة، مثل المبادلات الحرارية لتكييف الهواء، وغرف الاستحمام، والأجهزة الطبية. هذه الأنواع من الأغشية الحيوية يسبب رائحة والأمراض المعدية المزمنة5،6.

عادة، يتم استخدام المواد الكيميائية أو المضادات الحيوية مركبات كيميائية تمنع نمو البكتيريا التي تشكل الأغشية الحيوية. ظهور البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، والشواغل المتعلقة بالسلامة في فيفو المواد الكيميائية تدفع الحاجة إلى تطوير مواد جديدة لمنع تكوين الأغشية الحيوية وتمنع نمو البكتيريا.

في هذه الدراسة، يتم توليفها المواد النانوية الميكروبات خالية من المقاومة للمضادات الحيوية وسمية. فضة عبارة عن مادة مضادات الميكروبات معروفة جيدا، والتطورات الأخيرة في علم وتكنولوجيا النانو قد أدت إلى نشطة للبحث في آثار جسيمات نانوية معدنية7،8مضادات الميكروبات. وأفادت الدراسات الأخيرة أن صغر الحجم وارتفاع نسبة السطح إلى الحجم جسيمات نانوية يسفر عن زيادة نشاط البكتيريا9،،من1011.

المواد النانوية المعروضة هنا الجمع بين جسيمات فضة نانوية مع زيادة خصائص مضادة للميكروبات والأنابيب النانوية الكربونية مع نسبة العرض إلى الارتفاع عالية، مما يؤدي إلى زيادة المساحة السطحية لوحدة التخزين. مركب أنابيب نانوية الكربون نانوحبيبات الفضة ملفقة معارض كبير خصائص مضادة للميكروبات والحد الأدنى من السمية للخلايا البشرية والحيوانية. العمليات التركيبية في الدراسات السابقة استخدام عوامل خفض الخطرة مثل4نأبه، ميثلامين، ديميثيلفورماميدي، والهيدرازين. العملية معقدة وخطيرة، وتستغرق وقتاً طويلاً. العملية التركيبية ذكرت هنا يستخدم الإيثانول كعامل تخفيض درجة كبيرة أقل خطورة.

وقيست بمنطقة تثبيط وتركيز جراثيم الدنيا (أم بي سي) Ag-موكنتس؛ يعيش الميت وفحوصات تريبان الأزرق استخدمت لقياس سمية وخصائص مضادة للجراثيم. لم تجر بسبب اللون غير عادية للأنابيب النانوية الكربونية التي ستكون قد تدخلت فحوصات تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) وفحوصات السمية الميتوكوندريا (MTT). وأخيراً، تقرر تركيز الحد الأدنى لمنع نمو ميثيلوباكتيريوم spp. دون التأثير على خلايا الثدييات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. أكسدة موكنت

  1. قياس 30-50 مغ موكنت إلى قنينة 50 مل. أضف ببطء 8 مل ح2حتى4: HNO الحل3 (تركيز 90 في المائة الأولى، المجلد 3:1/المجلد) ماصة مع نصائح ماصة 1 مل.
    تنبيه: يجب أن تجري هذه العملية التحضيرية في غطاء الأبخرة كيميائية.
    1. تسمح 30 دقيقة لرد فعل الطاردة للحرارة لإكمال.
  2. Sonicate الحل في 60-80 درجة مئوية و 160 ث عن ح 1 حتى موكنت يستقر أسفل القنينة.
    تنبيه: منسوب المياه في سونيكاتور ينبغي أن يكون أقل من الجزء العلوي من قنينة حيث أن الماء سيدخل لا القنينة.
  3. نقل الحل إلى أنبوب الطرد مركزي.
    1. مع ميكروبيبيتي، بإضافة 30 مل ماء المقطر دروبويسي إلى الحل موكنت-COOH.
      تنبيه: رد فعل الطاردة للحرارة قوي يحدث أثناء إضافة الماء المقطر. أضف ماء مقطر ببطء، وإتاحة الوقت للتبريد.
  4. الطرد المركزي الحل موكنت-COOH في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    تنبيه: عندما تعمل الطرد مركزي، ضمان النابذة تظل متوازنة عن طريق وضع أنبوب مع نفس الوزن مقابل أنبوب عينة.
  5. إزالة المادة طافية ماصة ونصيحة ماصة 1 مل. إضافة 5 مل إيثانول مع ماصة ونصيحة ماصة 1 مل. شطف جدران القنينة مع الإيثانول بيبيتيد إضافية. الطرد المركزي الحل في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    1. تحديد درجة الحموضة من المادة طافية مع ورقة الأس الهيدروجيني. تكرار الغسيل وسينتريفوجينج حتى يصبح الرقم الهيدروجيني طافية محايدة.
  6. قم بإزالة كافة المادة طافية. أضف 1 مل ماء المقطر التعجيل وتفريق موكنت-COOH بالتساوي في الحل. فريزيدري الحل عند-60 درجة مئوية تحت الفراغ حتى الجاف.

2-الفضة نانوحبيبات ترسب على موكنتس

  1. ضع 10 مغ من موكنت-COOH في أنبوب 50 مل مخروطية وتمييع مع 30 مل ماء المقطر. Sonicate الحل في 60 درجة مئوية و 160 ث عن ح 1.
  2. ضع 6 مل من 0.1 إنيو ن3 في أنبوب 50 مل مخروطية وتمييع مع 18 مل ماء المقطر. Sonicate الحل في 60 درجة مئوية و 160 ث عن ح 1.
    تنبيه: إضافة إنيو3 ما يتناسب مع الكتلة الإجمالية موكنتس أن الكتلة الإجمالية لحج لا تتجاوز 20 في المائة.
  3. إضافة الحل3 إنيو دروبويسي لحل موكنتس مع ماصة ونصيحة ماصة 1 مل بينما سونيكاتينج الخليط في 60 درجة مئوية و 160 W. سونيكاتينج متابعة ح 1 بعد إضافة إنيو3.
  4. الطرد المركزي الحل في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وإزالة المادة طافية. الطرد المركزي في الحل وإزالة المادة طافية مرتين إضافية.
  5. أضف 1 مل ماء المقطر إلى خليط موكنتس Ag، وتفريق متسرعا بالتساوي في الحل. إضافة 5 مل إيثانول، والسماح برد فعل على المضي قدما في درجة حرارة الغرفة ح 1.
  6. الطرد المركزي الحل في 12,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وإزالة المادة طافية.
  7. تحديد درجة الحموضة من المادة طافية مع ورقة الأس الهيدروجيني. تكرار الغسيل وسينتريفوجينج حتى طاف الأس الهيدروجيني المحايدة.
  8. أضف 1 مل ماء المقطر إلى موكنتس Ag، وتفريق بالتساوي في الحل. فريزيدري الحل في-70 درجة مئوية تحت الفراغ ح 24.

3-منطقة تثبيط اختبار

  1. مزيج 18.12 ز لاجار R2A و 1 لتر من الماء المقطر في قارورة. تعقيم المخلوط في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. السماح هلام لتبرد في درجة حرارة الغرفة. وضع 10 مل جل في أطباق بتري قبل تصلب إعداد متوسطة الصلبة.
  3. المكان 100 ميليلتر من البكتيريا في المتوسط الصلبة. تنتشر البكتيريا في المتوسطة الصلبة باستخدام الناشرة.
    تنبيه: يجب أن تجري هذا الإجراء بغطاء الأبخرة كيميائية مضاءة بمصباح الكحول.
  4. احتضان الأطباق عند 30 درجة مئوية ح 48.
  5. ز 3.12 مزيج من مرق R2A مع 1 لتر ماء المقطر في قارورة. تعقيم المخلوط في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. نقل المستعمرات نمت إلى متوسطة سائل باستخدام إبرة وحلقة واحتضان في حاضنة في 180 لفة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
  7. سجل القيمة OD (الكثافة البصرية) التي كانت الأشعة فوق البنفسجية في 600 نانومتر على أساس كل ساعة لقياس النمو الجرثومي.
    ملاحظة: R2A أجار استخدمت في هذا الاختبار، بدلاً من أجار مولر هينتون القياسية، لأن R2A أجار المفضل لنمو ميثيلوباكتيريوم spp.
  8. المكان 10 مل من استعداد R2A أجار في طبق بتري إعداد أجار السفلي.
    1. مزيج ز 3.12 من مرق R2A وز 8 من أجار مع 1 لتر ماء المقطر. تعقيم الخليط في اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمل 15 دقيقة 10 مكان هذا جل في أجار السفلي.
  9. تحميل 50 ميليلتر من حل موكنتس Ag على قرص ورقة عقيمة مع ميكروبيبيتي.
    1. الجاف وتعقيم العينة موكنتس Ag في فراغ غرفة تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة مدة 30 دقيقة.
  10. عينة مكان Ag-موكنتس في أجار.
  11. احتضان لوحة أجار عند 30 درجة مئوية ح 48.
  12. قياس منطقة تثبيط12.
    ملاحظة: يتم تضمين إرشادات للبرمجيات المستخدمة في المراجع.

4-مضاد الاختبار

  1. كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.7 بإعداد ثقافة البكتيرية.
  2. في التطوير التنظيمي كحد أقصى، تطعيم 100 ميليلتر من البكتيريا إلى 3 مل متوسطة السائلة الطازجة مع تلميح ماصة صغيرة ماصة و 100 ميليلتر.
  3. إعداد خمسة 50 ميليلتر عينات من الحل التحكم في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. أضف الأمر التالي إلى كل أنبوبة: 1) الميثانول؛ 2) 1000 ميكروغرام/مل موكنت-COOH؛ 3) 50 ميكروغرام/مل Ag-موكنتس؛ 4) Ag ميكروغرام/مل 40-موموكنتس؛ 5) Ag ميكروغرام/مل 30-موكنتس.
  4. احتضان في 180 لفة في الدقيقة و 30 درجة مئوية حتى عنصر التحكم نشطاً بشكل أقصى كما يحددها كانت الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح أعلاه.
  5. قياس قيمة التطوير التنظيمي لكل عينة وحساب تركيز هيئة التصنيع العسكري. قيمة OD ارتباطاً مباشرا بعدد الخلايا البكتيرية في المرق عينة.
  6. انتشار البكتيريا المستزرعة على وسيلة متينة مع الناشرة.
  7. احتضان الطبق عند 30 درجة مئوية ح 48.
  8. عد المستعمرات البكتيرية وقيم التدبير زيمبابوي لتحديد النشاط المضاد للبكتيريا12.
    ملاحظة: يتم تضمين إرشادات للبرمجيات المستخدمة في المراجع.

5-إمكانية الفحص

  1. بعد إزالة الخلايا الثقافة من حاضنة، شفط المتوسطة ويغسل ثلاث مرات مع يغسل dropwise مل 5 من برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 1 مل من التربسين-يدتا في برنامج تلفزيوني للخلية غسلها والشفط بعد 1 دقيقة.
    1. اضغط على اللوحة لإزالة الخلايا عالقة.
  3. إضافة 5 مل دميم (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو) ثم قم بإزالة الخلايا. الطرد المركزي هذه العينات في 200 غ س لمدة 3 دقائق وإزالة المادة طافية.
    1. أضف 1 مل دببس ومزيج.
    2. حساب عدد الخلايا في 10 ميليلتر من الحل مع جهاز عد الخلايا تلقائية.
      ملاحظة: يتم تضمين إرشادات لالة عد الخلايا المستخدمة في المراجع13.
  4. مكان 1 × 105 من الخلايا AML12 كل بئر في صفيحة ستة-كذلك يتضمن الحل دميم. المتوسط تحتوي على مصل بقرى الجنين 10% (v/v)، والمضادات الحيوية العقيمة 1%.
  5. احتضان لوحة ح 8-12 في 37 درجة مئوية في بيئة هواء 95%2CO 5%.
  6. شفط المادة طافية من الآبار مع المضخة.
    1. قم بإضافة كل عينة تتألف من عنصر التحكم والمتحف-[دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) 30-40 ميكروغرام/مل موكنت Ag إلى 1 مل دميم.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة جوية 95%2CO 5% ح 8.
  7. إزالة عينات طافية ويغسل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  8. أضف 1 مل من استعداد يعيش الميت كيت (20 ميليلتر من 2 مم اتهد-1 مع 5 ميليلتر من كالسين 4 ملم صباحا في [دمس] في 10 مل من برنامج تلفزيوني) دروبويسي للخلية.
  9. احتضان في room temperature لمدة 30-45 دقيقة أو 37 درجة مئوية لأدنى 10 fluorescence التدبير مع الفحص المجهري fluorescence القياسية 100 X أو 300 X.

6-تريبان الأزرق بالانزيم

  1. إعداد العينات وفقا للخطوات 5.1 من خلال 5.6.2 أعلاه.
  2. إزالة المادة طافية.
  3. أغسل لوحة مع 1 مل 1 x DPBS وصب.
  4. أضف 1 مل التربسين لوحة واحتضان لمدة 3 دقائق لفصل الخلايا من الثقافة. استخدام خلية الثقافة المتوسطة ليغسل لوحة وجمع الخلايا. مكان تجمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
  5. الطرد المركزي أنبوب 200 × g و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  6. تجاهل المادة طافية. أضف 1 مل متوسطة جديدة إلى الخلية بيليه وإعادة تفريق الخلايا.
  7. إضافة 10 ميليلتر من تريبان الأزرق مع 10 ميليلتر من الخلايا المتفرقة وحساب الخلايا مع جهاز عد الخلايا تلقائية.
    ملاحظة: يتم تضمين إرشادات لالة عد الخلايا المستخدمة في المراجع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأكيد نقل صور "المجهر الإلكتروني" (TEM) تشكيل MWCNTs Ag (الشكل 1A و 1B). وأكد على توليف ناجحة التغيير في تهمة السطحية. تم حساب حجم الجسيمات Ag أودعت في موكنتس (الشكل 1). وكان حجم الجسيمات المتوسط حوالي 3.83 شمال البحر الأبيض المتوسط. ويبين الشكل 1نمط زرد موكنتس Ag تصنيعه ك. يتوافق مع ذروة 20-30 درجة مئوية إلى موكنت؛ وتقابل قمم المتبقية Ag. ويبين الشكل 2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تقرير طريقة بسيطة لإعداد موكنتس بجسيمات نانوية Ag المودعة. يوضح هذا نانوماتيريال المحتوية على الفضة النشاط المضاد للبكتيريا كبيرة وإمكانات الحد الأدنى لامتصاص جسيمات فضة نانوية غير المنضبط في الجسم. نظهر أن 30 ميكروغرام/مل من موكنتس Ag المركب مستوى فعال من النشاط المضاد للبكتيريا ضد spp. ميثيلوباكتيريوم مع سيتوتوكسيسيتي لا يعتد بها للثدييات خلايا الكبد. على الرغم من التحسينات الإضافية وتقييمات السلامة الأحيائية ل Ag MWCNTs مطلوبة قبل التوسع في القطاع التجاري، استخدام الإيثانول كعامل تخفيض يمكن أن يساعد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة منح البحوث جامعة تشونغ إنغ (2016)، وبرنامج تطوير التكنولوجيا النانوية من خلال مؤسسة البحوث الوطنية Korea(NRF) تمولها وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (رقم 2017M3A7B8061942).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1 N نترات الفضةSIGMA-ALDRICH1090811000
أنبوب نانوي كربوني ، متعدد الجدرانشركة طوكيو للصناعة الكيميائية ، LTD308068-56-6
R2A أجارMBcellMB-R1129
مرق R2AMBcellMB-R2230
Methylobacterium spp.< / em>KCTC12618من مجموعة كوريا لثقافات النوع دايجون كوريا 12618 ، دايجون ، كوريا
طقم تصوير الخلية الحية / الميتةThermoFisher SCIENTIFICR37601
AML12من جامعة تشونغنام ، داجون ، كوريا
البشرية PBMCATCCPCS-800-011
TEMJEOLJEM-2100F
XRDRigakuD / MAX 2500مصدر الفوتون Cu K (40k< em>V, 100mA)
JuLI BrNanoEnTekJULI-BRSC 

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löndahl, J. Physical and Biological Properties of Bioaerosols. Bioaerosol Detection Technologies. , Springer. 33-48 (2014).
  2. Jennings, S., Moran, A., Carroll, C. Bioaerosols and biofilms. Biofilms in medicine, industry and environmental biotechnology. , IWA, London. 160-178 (2003).
  3. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  4. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (4), 999-1007 (2001).
  5. Doronina, N. V., et al. Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 52 (3), 773-776 (2002).
  6. Seo, Y., et al. Antibacterial activity and cytotoxicity of multiwalled carbon nanotubes decorated with silver nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 9, 4621-4629 (2014).
  7. Chen, X., Schluesener, H. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicologyletters. 176 (1), 1-12 (2008).
  8. Singh, M., et al. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 3 (3), 115-122 (2008).
  9. Morones, J. R., et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 16 (10), 2346(2005).
  10. Martinez-Castanon, G., et al. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes. Journal of Nanoparticle Research. 10 (8), 1343-1348 (2008).
  11. Lok, C. -N., et al. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry. 12 (4), 527-534 (2007).
  12. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide Home Page. , Available from: http://imageJ.nih.gov/ij/docs/guide (2010).
  13. NanoEnTek Inc. Juli Br User Guide. , Hwaseong, Korea. Available from: http://www.nanoentek.com/upload/product/11/JuLI%20Br_User%20manual%20(V.1.6).pdf (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة