هذه المخطوطة يوضح استنفاد التعبير الجيني في الأمامي للصراصير الألمانية عن طريق الابتلاع عن طريق الفم من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في الدهنية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الاستخدام العملي لتدخل الجيش الملكي النيبالي: التسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ناقلات الحويصلية للصراصير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) وقد طبقت على نطاق واسع للكشف عن الوظائف البيولوجية للعديد من الجينات، وتوخيت كالآفات مراقبة أداة تعمل عن طريق تعطيل الجينات الأساسية. ورغم أساليب مختلفة، مثل حقن، التغذية، وامتصاص، للنجاح في إيصال الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA)، الكفاءة [رني] من خلال التسليم الشفوي من دسرنا اختلافاً كبيرا بين مختلف مجموعات الحشرات. الصراصير الألمانية، جرمنيك Blattella، حساس بدرجة كبيرة إلى حقن دسرنا، كما أظهرت العديد من الدراسات التي سبق نشرها. ويصف هذه الدراسة وسيلة للبرهنة على أن دسرنا مغلفة مع الناقلين الحويصلية كافية تؤخر تدهور دسرنا عصير الأمامي. جدير بالذكر أن تغذية مستمرة من دسرنا المغلفة بواسطة الدهنية إلى حد كبير يقلل التعبير tubulin في الأمامي، وأدت إلى وفاة الصراصير. وفي الختام، لصياغة واستخدام ليبوبليكسيس دسرنا، التي تحمي دسرنا ضد نوكليسيس، يمكن أن يكون استخدام عملي من [رني] للسيطرة على الآفات الحشرية في المستقبل.
المقدمة
قد ثبت [رني] كطريقة فعالة للتعبير الجيني ضربة قاضية من خلال إليه طريقا إسكات بوستترانسكريبشونال فجرها جزيئات دسرنا في كثير من حقيقيات النوى1. على مدى العقد الماضي للدراسة، وقد أصبح [رني] أداة مفيدة دراسة وظائف الجينات من التنمية إلى سلوك طريق المستنفدة للتعبير عن جينات محددة عن طريق الحقن و/أو تغذية دسرنا في الأنواع المختلفة من الحشرات2،3. نظراً لخصوصية ومتانة أثر مستنفدة، يجري حاليا النظر التطبيق [رني] كاستراتيجية محتملة لمكافحة الآفات مراقبة إدارة4،5. ومع ذلك، الكفاءة [رني] اختلافاً كبيرا بين أنواع الحشرات، اعتماداً على جينات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تجميع وإعداد دسرنا
- تحديد المواقع المستهدفة دسرنا في المنطقة 3 ' غير مترجمة من الجينات المستهدفة. دستوب هو استخدامها لاستهداف الجين α-tubulin (الحوض) (رقم الانضمام إلى بنك الجينات: KX228233)، ودسيجفب كما تم تصميم عنصر تحكم دسرنا سلبية من التسلسل المحسن البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب؛ بنك الجينات رقم الانضمام: LC311024).
- تنفيذ معيار [بكر] تضخيم توليف قوالب دسرنا مع الإشعال الخاصة بالجينات التي تحتوي على تسلسل المروج T7 (-تاتاكجاكتكاكتاتاجج 5 '-3'). PCR التضخيم الشروط والمعلومات التمهيدي المستخدمة هي تلك المبلغ عنها بلين وآخرون. (2017) 12 (انظر الجدول للمواد).
- المضي قدما في إعداد دسرنا ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مخطط مبسط للبروتوكول لإيصال الفم دسرنا يرد في الشكل 1، حيث أظهرت الخطوات الأساسية لإعداد ليبوبليكسيس دسرنا.
من أجل التحقيق في الحماية الممنوحة الناقلين الحويصلية عند تدهور دسرنا في عصير الأمامي جرمنيك باءومقايسة السابقين فيفو حيث أجرى دستوب ليبوبليكسيس كانت المحتضنة مع عصير الأمامي وسلامة دسرنا وقد تم تحليل في وقت لاحق على 1.5% [اغروس] هلام. ويبين الشكل 2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول يقدم طريقة فعالة [رني] من خلال التسليم الشفوي من دسرنا ليبوبليكسيس، التي تشمل الحماية ضد الهضم ribonuclease في عصير الأمامي للصراصير الألمانية. كما هو مبين في الدراسات الأخرى في مختلف أنواع الحشرات، الأثر [رني] الفقراء من خلال التسليم الشفوي من دسرنا معظمهم ويعزى تدهور دسرنا8،،من910. وينتج هذا البروتوكول الدهنية التي تعمل كمركبات واقية في التسليم الشفوي من دسرنا ضد التدهور في القناة الهضمية. وبالإضافة إلى ذلك، إعد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من تايوان (وزارة العلوم والتكنولوجيا، وأكثر 100-2923-B-002-002-MY3 و 106-2313-B-002-011-MY3 إلى H.J.L.)، الجمهورية التشيكية (منح جامعة وكالة جنوب بوهيميا، جاجو منح 065/2017/ف Y.H.L)، وإسبانيا ( وزارة الاقتصاد الإسبانية، والقدرة التنافسية، والمنح المقدمة CGL2012 36251 و CGL2015-64727-ف X.B.، و "الحكومة الكاتالونية"، منح 2014 SGR 619 X.B.)؛ أيضا تلقي الدعم المالي من "الصندوق الأوروبي" "التنمية الإقليمية" (FEDER الأموال إلى X.B.) الاقتصادية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| GenJe Plus DNA في المختبر كاشف التعداء | SignaGen | SL100499 | لإعداد الدهون |
| Blend Taq plus | TOYOBO ؛ | BTQ-201 | ل PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | ل qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | لتحديد 3 'UTR |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | لتخليق dsRNA |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | إزالة قالب الحمض النووي من dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | ل dsRNA أو إجمالي استخراج الحمض النووي |
| الريبي RQ1 RNase Free Dnase | Promega | M6101 | إزالة قالب الحمض النووي من إجمالي الحمض النووي الريبي ؛ |
| الكلوروفورم | Sigma-Aldrich | C2432 | ل dsRNA أو استخراج الحمض النووي الريبي الكلي |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | ل dsRNA أو إجمالي استخراج الحمض النووي |
| الريبي الإيثانول | Sigma-Aldrich | 24102 | ل dsRNA أو استخراج الحمض النووي الريبي |
| الكلي ثنائي إيثيل بيروكربونات ، DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | لتحضير محلول الجلوكوز بالماء الخالي من RNase |
| Sigma-Aldrich | G3285 | لتحضير الدهون | |
| كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S7653 | تركيبة عازلة ملحية للحشرات |
| كلوريد البوتاسيوم ، KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | تركيبة عازلة ملحية للحشرات |
| كلوريد الكالسيوم ، CaCl 2< / sub> | Sigma-Aldrich | C1016 | تركيبة |
| عازلة ملحية للحشراتسداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم ، MgCl 2< / sub >.6H 2< / sub>O | Sigma-Aldrich | M2670 | تركيبة عازلة للحشرات |
| EGTA ؛ | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| تشريح مقص | FST | تسلخ الصراصير | |
| ملاقط غرامة | FST | تسلخ الصراصير | |
| ملاقط مرنة | FST | صراصير القابضة | |
| pipetman | RAININ | P10 | عينة إعداد |
| أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Axygen | ماصة تحضير | العينة PCR02C |
| ؛ | Axygen | Sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | إعداد العينة |
| جهاز طرد مركزي Minispin | The Gruffin Group | GMC 206 | للدوران السائل لأسفل |
| جهاز الطرد المركزي | ALC | PK121R | إعداد عينة |
| مقياس الأس الهيدروجيني ؛ | JENCO | 6071 | لضبط الأس الهيدروجيني |
| مقياس الطيف الضوئي الصغير | Quawell | Q3000 | الحمض النووي الكمي |
| PCR Thermal cycler | ABI ؛ | 2720 | لقالب PCR أو حضانة توليف dsRNA |
| PCR الكمي في الوقت الحقيقي | ABI | StepOne بالإضافة إلى | التعبير الجيني الكمي |
| مكثفات فراغ الطرد المركزي | eppendorf | 5301 | ل dsRNA أو إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي |
| Multipette ؛ | eppendorf | xstream | لتحميل عينة PCR في الوقت الحقيقي |
| Agarose I | amresco | 0710 | للحمض النووي الرحلان الكهربائي |
| حوض الجين specfifc الأمامي preimer | tri-I التكنولوجيا | GGG ACA AGC CGG AGT GCA | |
| GA حوض الجين specfifc عكس preimer | ثلاثي I التكنولوجيا | الحيوية TCC TGC TCC TCC CTC CTC GCT GA | |
| dsTub قالب إلى الأمام التمهيدي | ثلاثي I التكنولوجيا | TAA TAC GAC TCA CTA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub قالب التمهيدي العكسي | ثلاثي I التكنولوجيا | TAA TAC GAC TCA CTA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP قالب إلى الأمام preimer | ثلاثي I التكنولوجيا | TAA TAC GAC TCA CTA علامة GGT ATG GTG AGC AGC GGC GAG | |
| GAG dsEGFP قالب التمهيد العكسي | ثلاثي I التكنولوجيا | TAA TAC GAC TCA CTA علامة GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| حوض qPCR التمهيدي الأمامي | ثلاثي I التكنولوجيا | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| حوض qPCR العكسي preimer | ثلاثي I التكنولوجيا | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR إلى الأمام التمهيدي | ثلاثي I التكنولوجيا | CGC TTG AGG AGA AAA TCA AGG | |
| A ef1 qPCRreverse preimer | tri-I التكنولوجيا | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
المراجع
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010). ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
