نقدم بروتوكول بسيط ويمكن الاعتماد عليها لقياس محتوى الحديد في الأنسجة النباتية باستخدام الأسلوب الأزرق البروسية اللونية.
مقالة منهجية
نقدم بروتوكول بسيط ويمكن الاعتماد عليها لقياس محتوى الحديد في الأنسجة النباتية باستخدام الأسلوب الأزرق البروسية اللونية.
الحديد، واحدة من أهم المغذيات الدقيقة في الكائنات الحية، وتشارك في العمليات الأساسية، مثل التنفس والتمثيل الضوئي. محتوى الحديد منخفضة بدلاً من ذلك في جميع الكائنات الحية، تصل في النباتات إلى حوالي 0.009% وزن الجاف. وحتى الآن، هو أحد الأساليب الأكثر دقة لقياس تركيز الحديد في الأنسجة النباتية لهب الامتصاص الذري الطيفي. بيد أن هذا النهج هو مضيعة للوقت ومكلفة وتتطلب معدات معينة لا توجد عادة في مختبرات مصنع. ولذلك، هناك حاجة إلى أسلوب أبسط، ولكن الدقيقة التي يمكن أن تستخدم بشكل روتيني. بشكل منتظم يستخدم الأسلوب الأزرق البروسية اللونية لنوعية الحديد تلطيخ في أقسام الأنسجة الحيوانية والنباتية. في هذه الدراسة، علينا تكييف الأزرق البروسية يترك طريقة لقياس كمية الحديد في التبغ. علينا التحقق من دقة هذا الأسلوب باستخدام التحليل الطيفي الذري والأزرق البروسي تلطيخ لقياس محتوى الحديد في نفس العينات ووجدت انحدار خطي (ص2 = 0.988) بين الإجراءين. ونحن نستنتج أن الأسلوب الأزرق البروسية لقياس كمية الحديد في الأنسجة النباتية دقيقة وبسيطة وغير مكلفة. ومع ذلك، قد لا يكون الانحدار الخطي المعروض هنا الملائمة للأنواع النباتية الأخرى، بسبب التفاعلات المحتملة بين العينة والكاشف. وهكذا يلزم إنشاء منحنى الانحدار للأنواع النباتية المختلفة.
الحديد (Fe) هو المغذيات هامة في جميع الكائنات الحية. في النباتات، هو المغذيات الدقيقة أساسية1 بسبب تورطها في العمليات الأساسية، مثل التنفس والتمثيل الضوئي والكلوروفيل الحيوي. ارتفاع تراكم أيونات الحديد مجاناً مضر لزرع الخلايا بسبب ردود الفعل التي أدت إلى الإفراج عن الجذور الحرة التي تسبب الأكسدة. للحفاظ على التوازن الحديد داخل الخلية النباتية، المخزنة في vacuoles الأيونات والمحتبس داخل فيريتينس والبروتين أقفاص المعنيين مباشرة بالحديد التوازن2 وبنية التخزين الرئيسي للحديد في جميع الكائنات الحية. في الوقت نفسه، يؤثر فقر الدم بعوز الحديد على نسبة كبيرة من السكان، أدى إلى تزايد حاجة إلى مصنع الحديد بيوفورتيفيكيشن. نظراً للخصائص الفريدة لمصنع فيريتين، يقدم إثراء الأغذية بالحديد فيريتين استراتيجية واعدة لمكافحة هذه المشكلة من سوء التغذية3.
أيونات الحديد أساسا وجدت في أكسدة دولتين، هما الحديدية (Fe ديفالينت2 + أو الحديد (II)) والحديديك (Fe تمكنت3 + أو الحديد (III)) أشكال. وتوجد عدة أشكال أخرى من الحديد، مثل كتل الحديد4، أيضا في الخلايا. يتم تخزين الحديد كأكسيد الحديد داخل الخلية ومن الطبيعي أشكال هيماتيتيس (Fe2س3) وفيريهيدريتيس ((Fe3 +)2س3•0.5 ح2س) تحت الظروف الفسيولوجية5. وقد هيدروكسيدات شكلت في ردود الفعل هذه، لا سيما النموذج الحديديك، الذوبان منخفضة جداً. الاحتفاظ بالحديد وبالتالي تتأثر درجة حموضة الحل، وهو إلى حد كبير في حالة صلبة الأس الهيدروجيني 56أعلاه.
نظراً لضعف القابلية للذوبان وتفاعلية عالية من الحديد، يجب أن يكون نقلها بين الأنسجة النباتية والأجهزة المرتبطة بها مع جزيئات شيلاتينغ مناسبة. وعلاوة على ذلك، يجب أن تسيطر الدول الأكسدة بين الأشكال الحديدية والحديديك1 . ضمن أوراق، وجدت في خلايا التمثيل الضوئي، نظراً لدورها الأساسي في نظام نقل الإلكترون، في التركيب الحيوي سيتوتشروميس، والكلوروفيل وغيرها جزيئات الهيم، حوالي 80% الحديد وفي تشكيل الحديد-S7مجموعات. وفي حالة الحديد الزائد داخل الخلية، الفائض هو ذوبانها في المنقبضة حيث يتم تخزين المعدن في جزيئات فيريتين8.
ويمكن قياس الحديد في الأنسجة النباتية من عدة طرق، بما في ذلك لهب الامتصاص الذري الطيفي9 (FAAS) أو فحوصات قياس الألوان10، السابقة ويجري الآن أكثر دقة من هذا الأخير. FAAS هو تقنية دقيقة للغاية التي تمكن واحد لتحديد تكوين عنصري من عينة على أساس الانبعاثات الكهرومغناطيسية للعناصر الفردية. تحويل FAAS الأيونات المعدنية إلى الدول الذري باللهب-تدفئة العينة، مما يؤدي إلى الإثارة أيون وانبعاث موجه محددة عندما يعود أيون معين إلى حالة الأرض. الانبعاثات من الأيونات مختلفة مفصولة مونوتشروماتور والكشف عنها بواسطة استشعار امتصاص11. وهكذا يقدم FAAS لقياس تركيزات الحديد مباشرة. ومع ذلك، من تتوفر تقنيات أخرى لتصور الحديد في الأنسجة البيولوجية. مطيافية الكتلة البلازما إلى جانب الحث (برنامج المقارنات الدولية-MS)12 تقنية دقيقة جداً لقياس الحديد وغيرها من العناصر النزرة ولكن بسبب نقص المعدات، سواء بالنسبة FAAS، وبرنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، مشكلة مشتركة. من ناحية أخرى، قياس الحديد ب قياس الألوان ثيوسيانات13 يفتقر إلى الدقة وفشل للكشف عن الاختلافات الصغيرة بين العينات. الأزرق البروسي تلطيخ،14،،من151617 أسلوب غير مباشرة استناداً إلى رد فعل فيروسيانيد البوتاسيوم الحديديك (ك4Fe(CN)6) مع الكاتيونات Fe، إنتاج لون أزرق قوي، وهو يستخدم للكشف عن نوعية الحديد في أقسام النسيجي للأنسجة الحيوانية والنباتية.
الحديد المعدني (صفر-بالينت) أمر نادر الحدوث في القشرة الأرضية. شكل أيونى غير الرصاصية المهيمنة من الحديد في البيئة معظمها تمليه كمية الأوكسجين في المناطق المحيطة بها، مع الحديد الحديدية يجري نسبيا أكثر وفرة في البيئات وصول والحديديك الحديد غلبة في مواقع الهوائية. وهذا الشكل الأخير أيضا المهيمنة في البيئات الحمضية جداً، على الرغم من أن العوامل المسببة لأكسدة الحديد الحديدية غالباً ما تختلف في محيط الحمضية ووصول18. عندما يتم سولوبيليزيد الحديد في 4% HCl (pH 0) في بيئة هوائية، يوجد الجزء الأكبر من الحديد المخفف كما تشكل الحديديك (Fe3 +)19،20.
ردود الفعل بين أيونات الحديد وك4Fe(CN)6 على ما يلي:
Fe3 +: فيكل3 +4ك Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2 +: 4 فيكل2 + 2 ك4Fe(CN)6 =4(Fe(CN)6) Fe2 + 8 بوكل
في هذه الدراسة، سألنا عما إذا كان تلطيخ الأزرق البروسي يمكن أن تكون مفيدة لقياس مستويات الحديد في الحل.
في البداية، يمكننا التحقق من العلاقة بين تركيز الحديد في محلول مائي وتلطيخ الأزرق البروسي. وتم قياس تركيز الحديد (فيكل2، فيكل3 أو 1:1 مزيج من الاثنين) في المحاليل كل من التحليل الطيفي الذري وامتصاص (OD) بعد إضافة الأزرق البروسية. ويبين الشكل 1 منحنيات الانحدار الخطي للقياسات التي تم الحصول عليها بكل طريقة. خلصنا إلى أنه يمكن استخدام الأسلوب الأزرق البروسي للتحليل الكمي لتركيز الحديد في الحل.

الشكل 1: قياس التراجع الخطي بين تركيز الحديد FAAS وامتصاص الضوء (OD، 715 nm) التي تم الحصول عليها بواسطة الأسلوب الأزرق البروسي. وتمثل المربعات الأزرق والخط Fe2 + الحل وتمثل المربعات الحمراء وخط الحديد3 + الحل والمربعات السوداء وخط تمثل خليط 1:1 بين Fe2 + و Fe3 +. تم الحصول على انحدارات التالية: [Fe2 +] = OD x 3 + 123، r = 0.996، ص2 = 0.989؛ [Fe3 +] = 1 + 292 OD x, r = 0.999، ص2 = 0.997؛ و [Fe2 + 3 +] = 11 + 146 OD x, r = 0.983، ص2 = 0.956. Fe2 + المانحين فيكل2 والحديد3 + المانحين فيكل3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكيف مع أسلوب الأزرق البروسي اللونية لتحليل كمية الحديد في الأنسجة النباتية، محتوى الحديد من رماد نبات التبغ تم قياسه بواسطة لهب الامتصاص الذري الطيفي وتلطيخ الأزرق البروسي. وكان هناك علاقة جيدة بين النتائج من قبل اثنين من التقنيات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1-زراعة المواد وظروف النمو
2-إعداد الأوراق لقياس الحديد
ملاحظات: يجب أن تكون جميع المواد التي ستستخدم خالية من الحديد بغية الحد من خطر التلوث بالحديد. تنظيف الهاون والمدقة مرتين بحل HCl 4% وجاف مع ورق الترشيح في كل مرة قبل الاستخدام. إذا كان يتم إعادة استخدام أي مادة، تنظيفه بحل HCl 4% مرتين وجاف مع أوراق الترشيح.
3-حرق الأوراق للرماد
ملاحظات: هو يعني استخدام حل انخفاض الأس الهيدروجيني (بالقرب من 0) من HCl زيادة قابلية الذوبان في الحديد. ويستخدم الصوف الصخري للحيلولة دون هروب القنينة أثناء حرق الغازات.
4-إعداد الرماد لقياس الحديد
ملاحظات: يتم حساب تركيز الحديد النهائية في العينة الأولى كوزن رماد مقسوماً على حجم HCl المضافة.
5-قياس تركيز الحديد ب FAAS
6-إعداد الأزرق البروسية تلطيخ الحل
7-توليد منحنى معايرة لأسلوب البروسية الأزرق باستخدام نتائج FAAS
ملاحظة: حساب تركيز الحديد في رماد باستخدام الصيغة التالية
معادلة 1
C: تركيز، حجم العينة، والخامس: w: الرماد الوزن (ز).
8-استخدام أسلوب الأزرق البروسية لتحديد مستويات الحديد في عينات أخرى من نفس نوع النبات
الملاحظات: وبالفعل أنشئت منحنى معايرة لهذا النوع من النبات، تركيز الحديد في أي عينات جديدة من نفس نوع النبات يمكن مباشرة حساب استخدام الصيغة الانحدار الخطي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
عندما نفذت هذا البروتوكول بشكل صحيح، واحد يجب أن تحصل على العلاقة الممتازة بين النتائج التي تم الحصول عليها بطرق التحليل الطيفي الأزرق البروسي والذرى. ولذلك، الأسلوب الأزرق البروسي بسهولة استخدامها للحصول قياس دقيق لتركيز الحديد في عينات النباتات، كما تنعكس في التجربة التالية.
نباتات التبغ قد نمت كما هو موضح في البروتوكول والمروية بالمياه التي تحتوي على تركيزات مختلفة من الحديد (0، 1، 2، 3، 4، 5 أو 6 مم) أكثر من 7 أيام. ثم حصاد ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
قياس الحديد في الأنسجة النباتية مهم جداً لتقييم آثار الري أو غيرها من الظروف البيئية. هنا، يمكننا وصف طريقة قياس ألوان سهلة ودقيقة لقياس محتوى الحديد في أوراق التبغ، الذي يمكن أن يسهل تكييفها للأنواع النباتية والأنسجة الأخرى.
في تحسين الظروف لأسلوب قياس الألوان، استخدمنا متوسط انخفاض الأس الهيدروجيني (درجة الحموضة < 1.0) للسماح للذوبان في الحديد. تم إجراء عملية الحرق للإفراج عن كافة أشكال الحديد والتأكد من أن لا من الملوثات الموجودة في العينات أن تعديل النتائج. فيما يتعلق بالتلوث بالحديد، واحد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
إسرائيل وزارة العلوم والتكنولوجيا وسباسيند تدعمها منحة من عالم كبير من وزارة الزراعة (#16-16-0003) الإسرائيلية هذا العمل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
كاشف لوحدة تصفية حقنة
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Hexacyanoferrate البوتاسيوم (II) | Fisher Chemical | 14459-95-1 | Pussian Blue |
| Millex ، فتحة القارورة 0.22 & مرشح SLGP033RS m | Millec | يستخدم لتصفية الرماد + 4٪ قارورة تلألؤ محلول حمض الهيدروكلوريك | |
| Fisherbrand | 03-337-4 | يستخدم للحفاظ على المواد النباتية الجافة أثناء إجراء الحرق. | |
| حقنة يمكن التخلص منها 10 مل | Medi-Plus | 1931 | حقنة تستخدم أثناء الترشيح |
| حمض الهيدروكلوريك | Sigma-Aldrich | 231-595-7 | تستخدم في محلول 4٪ حمض الهيدروكلوريك لتخفيف الرماد وتنظيف المواد |
| التبغ ، Nicotiana tabacum < / em > السيرة الذاتية Samsun NN | تم الحصول عليها من البروفيسور سيمون باراك وتستخدم بشكل روتيني في مختبر | زاكايBarak S ، Nejidat A ، Heimer Y ، Volokita M. التنظيم النسخي وما بعد النسخ لجين أوكسيديز الجليكولات في شتلات التبغ. البيولوجيا الجزيئية للنبات. 2001 مارس 1; 45 (4): 399-407. | صنف التبغ المستخدم في هذا البروتوكول |
| الصوف الزجاجي (الصوف الصخري) | Sigma-Aldrich | 659997-17-3 | يستخدم في إجراء حرق العينات في الفرن. |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن