مقايسة بسيطة وسريعة، والكمية لقياس إصلاح الحمض النووي-البروتين كروسلينكس على البلازميدات Transfected في خلايا الثدييات

المبينة في هذا التقرير تحليل القائم على بكر يسمى الالتهاب قبكر. والغرض من هذا الأسلوب هو للتحديد الكمي لإصلاح DPC في بلازميد transfected الحمض النووي في خلايا الثدييات ناقصة ويتقن تصليح. هذا الفحص السريع، والكمية، ومرنة للغاية، ومباشرة إجراءات إصلاح النشاط. وبينما يركز هذا التقرير على استخدام هذه المنهجية لدراسة إصلاح Dpc، توضيح النتائج الواردة أدناه أن إصلاح أي الآفة الذي يمنع [تق] [بولمرس] يمكن دراستها باستخدام هذه المنهجية.

أن الأساس المنطقي وراء تطوير هذا الأسلوب هو التبصر في الآليات التي من خلالها إصلاح خلايا الثدييات Dpc. وخلافا لأنواع أخرى من تلف الحمض النووي، استدعاءات dpc واسع متنوع^1،2. وقد أثبتت الدراسات أن مئات بروتينات الخلوية يمكن أن تصبح كروسلينكيد للحمض النووي، وأن لكل بروتين يوجد، من حيث المبدأ، في العديد من سلاسل الجانب الأحماض الأمينية التي يمكن أن تصبح يعلق تساهمي ل الحمض الخلوي الصبغي الخلوي³. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من نقاط مرفق الكيميائية للبروتينات على العمود الفقري الحمض النووي، بما في ذلك عدة مناصب على أساس النوكليوتيدات وكذلك على^4،ريبوز السكر⁵. وهذا التنوع الكيميائي يثير احتمال أن المسارات البيوكيميائية متميزة قد يمكن الاعتماد عليه لإصلاح أنواع مختلفة من Dpc. كان هذا القلق في الاعتبار أن وضع مقايسة الالتهاب قبكر.

وقد وضعت عدة تقنيات التبصر في البيولوجيا الجزيئية الخلوية DPC إصلاح. فيما يلي لمحة عامة عن النهج الرئيسية التي تم تطويرها، مع موجز لأهم نقاط القوة والضعف كل أن يمتلكها. يجدر التأكيد على أنه بينما يركز هذا الموجز على دراسات لإصلاح DPC في خلايا الثدييات ثقافة النظم، مساهمات كبيرة للنموذج الحالي لإصلاح DPC قد بذلت استخدام النظم الميكروبية وخالية من الخلايا التي لا يتم مناقشتها في هذا مخطوطة.

ولعل أسهل الاستراتيجية التي يمكن اتخاذها للتبصر في علم وراثة إصلاح DPC هو تقييم حساسية كل منهما إلى موت الخلية في الخلايا البرية من نوع ومتحولة معرضة للعوامل التي تحفز Dpc^6،7. هذه الاستراتيجية هو سريع نسبيا، وغير مكلفة، ولا تتطلب خبرات متخصصة تتجاوز القدرة على تنفيذ تقنيات استزراع الخلايا الأساسية. موازنة هذه المزايا هي القيود العديدة لهذا النهج، بما في ذلك ما يلي. أولاً، لا تقيس المقايسة إصلاح الحمض النووي مباشرة. افتراض العمل الأساسية لهذه الاستراتيجية هو أن يخمد الطفرات في الجينات ترميز البروتينات إصلاح الحمض النووي ذات الصلة النتائج في تراكم الحمض النووي الضرر أن موت الخلايا المبرمج المشغلات. بيد الطفرات في الجينات ترميز البروتينات غير إصلاح الحمض النووي يمكن، الرئيسية، تعزيز (أو خفض) الخلوية حساسية لموت الخلايا المستحثة إكسينوبيوتيك. وثانيا، العوامل التي تخلق Dpc دائماً الحث على أنواع أخرى من تلف الحمض النووي (الاستثناء الوحيد 5-عزة-2 '--ديوكسيسيتاديني، ولكن هذا العامل أيضا يستنزف methyltransferase الخلوية مستويات⁸). ونتيجة لذلك، فمن المتصور أن فرط الخلوية المعززة للوكيل في السؤال قد تعكس العيوب في إصلاح كروسلينكس إينتيرستراند أو غيرها من الآفات. ثالثا، كما ذكر أعلاه، Dpc تمثل فئة غير متجانسة إلى حد كبير يتألف من أنواع مختلفة من كروسلينكس الكيميائية، التي تنطوي على بروتين مختلف الشركاء. فمن الممكن أنه بينما قد يكون تغيير إصلاح أنواع فرعية واحدة أو أكثر من هذه الآفات في خلفية وراثية معينة، هذا الاختلاف قد لا تكفي ليغير كثيرا من فرط الخلوية للوفيات الناجمة عن هذا الوكيل. وخلاصة القول، بينما هذه الاستراتيجية تمثل نقطة انطلاق جذابة، القيود المبينة أعلاه تسليط الضوء على أهمية اتباع أساليب أخرى، وأكثر مباشرة لدراسة الحركية إصلاح DPC.

قد وضعت عددا من النهج ذات الصلة لتحقيق هذا الهدف. على سبيل المثال، وضعت المحققين أساليب التمييز بين الحمض النووي 'الحرة' و 'البروتين-منضم' الحمض النووي^9،،من¹⁰¹¹. باستخدام هذه النهج، من الممكن لمقارنة مستويات مستقرة Dpc أو بعد التعرض لعامل إنتاج شركة ظفار في الخلفيات الوراثية المختلفة. وتشمل الاستراتيجيات اثنين التي استخدمت على نطاق واسع يفصل DPC التي تحتوي على الحمض النووي DNA مجاناً باستخدام استراتيجية ملزمة غشاء النيتروسليلوز أو بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي هطول الأمطار^12،13. في النهج السابق تفكيك الخلايا وتمريرها من خلال مرشح النيتروسليلوز. لأنه يربط النيتروسليلوز البروتين، عامل التصفية تحتفظ بالحمض النووي المرتبطة بالبروتين، والسماح للحمض النووي مجاناً لتمرير من خلال. في استراتيجية الأخير يفصل ربط البروتين الحمض النووي الحمض الحر يستند إلى حقيقة أن الحزب الديمقراطي الصربي بربط البروتين ولكن ليس من الحمض النووي، ويمكن أن تكون عجلت بإضافة بوكل. ونتيجة لذلك، يصبح الحمض النووي المرتبطة بالبروتين غير قابلة للذوبان بينما يبقى الحمض النووي غير منضم في الحل. DPC التي تحتوي على الحمض النووي يمكن أن تكون كوانتيتاتيد ثم استخدام thymidine راديولابيليد (إذا كان في البداية أيضي المسماة الخلايا) أو بصبغة فلورسنت الحمض النووي انتقائية مثل هويشت 33258. هذه الأساليب هي استنساخه وتتطلب عدد قليل من الخطوات. ومع ذلك، لا توفر معلومات بشأن الطبيعة التشعب الكيميائية التي من خلالها يتم إرفاقه البروتين الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، من المهم ملاحظة أن هذه الاختبارات قد تقدر الإفراط DPC إصلاح بواسطة زورا وسجل إصلاح غير مكتملة، أي، proteolytic تجهيز لأصغر crosslinks الببتيد الحمض النووي قد لا يكون محاصراً بسهولة أو عجل، كالحمض النووي حسن النية إصلاح.

يمكن استخدام فحوصات المذنب تصور تشكيل DPC في الخلايا¹⁴. في هذه التجارب، وتقليل وجود Dpc الهجرة الحمض النووي الذي يمكن عكسه ثم تقشير مع بروتيناز ك. ولذلك، يمكن استخدام طول الذيل لتقدير تشكيل DPC. ومع ذلك، كما ذكر أعلاه، المخدرات تشكل DPC إنشاء أنواع أخرى من تلف الحمض النووي الذي يمكن أن يؤدي تغيير طول ذيل. هذا البروتوكول هو أيضا درجة عالية من التقنية ويتطلب الخبرة والتدريب في مجال التصوير [كنفوكل].

يمكن استخدام الطيف الكتلي لدراسة حركية الإصلاح قد أبرمت بعد العلاج مع crosslinking وكلاء^15،،من¹⁶¹⁷. علاج الخلايا مع وكلاء شركة ظفار تشكيل هذه التجارب وعزل Dpc عبر البيوتين الالتقاط أو الفينول: كلوروفورم الاستخراج (1:1). ثم يمكن استخدام الطيف الكتلي لتحديد البروتينات كروسلينكيد أو كوانتيتاتي مبلغ DPCs التي تشكلت على مر الزمن. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو طبيعة البيانات المنتجة. فمن الممكن على وجه التحديد كتالوج أنواع البروتينات التي تصبح كروسلينكيد عقب التعرض إلى إكسينوبيوتيك، ولكن هذا البروتوكول مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وهي محدودة بنوع التشعب يمكن الكشف عنها.

مايزلس et al. المتقدمة حساسة 'رادار' (النهج السريع للحمض النووي adduct الاسترداد) المقايسة كوانتيتاتي إيمونوديتيكشن بروتين الحمض النووي adducts كذلك رادار على أساس أليسا مقايسة^18،19. هذه الاختبارات مفيدة بشكل خاص لمحاصرة وسيطة الحمض النووي-بروتين عابر في الخلايا وتوليد نماذج مناسبة للتحليل الطيفي الشامل لتحديد البروتين الجديد أدوكتس. هذا الإنزيم إيمونوديتيكشن يعتمد على وجود الأجسام المضادة لالتقاط التشعب البروتين الحمض النووي، وعليه، قد لا تكون قادراً على الكشف عن الحمض النووي-ببتيد المتدهورة adducts هذا النموذج أثناء إصلاح. في الآونة الأخيرة، إصلاح DPC محددة المسار مرتبطة بتكرار الحمض النووي، وتعتمد على الحمض النووي ميتالوبروتيسي المتقشف اكتشفت في Dpc التي يتم بروتيوليزيد على الببتيدات أصغر أثناء إصلاح^20،21. الموروثة من الطفرات في هذا الجين المرتبطة بمتلازمة راييس-آلفس في البشر، وهو مرض يتسم بعدم الاستقرار المجيني والشيخوخة المبكرة وسرطان الكبد²². عرض الفئران بعيوب الجينات المهندسة وراثيا المتقشف مماثلة تعمل²³.

وقد استخدمت تنشيط الخلية المضيفة نشاط النسخي لدراسة إصلاح آفات محددة موجودة على transfected بلازميد الحمض النووي ركائز^24،25. في هذه التجارب، بلازميد يحتوي على Dpc (أو أنواع أخرى من الآفات الحمض النووي) التي منع النسخ من مراسل، مثل لوسيفراس، وهي ترانسفيكتيد في الخلايا. إصلاح التﻷلؤ القياسات في وقت لاحق اتخذت 24-72 ح ثم يرتبط مع DPC. بيد أن هذه الاختبارات غير المباشرة إصلاح عاجزة عن الكشف عن أحداث إصلاح أقدم من تعداء بعد 24 ساعة ولا يميز بين تجاوز بوليميريز الحمض النووي الريبي من ركائز إصلاح جزئي واستكمال إصلاح.

كل واحد من الأساليب المذكورة أعلاه ومزايا وساهم النموذج الحالي لإصلاح DPC. ومع ذلك، الإنزيم qPCR الالتهاب تلتف العديد من القيود المرتبطة بهذه النهج الأخرى وبالتالي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة DPC إصلاح آليات أكثر تحديداً. على سبيل المثال، قياس الإنزيم qPCR الالتهاب مباشرة إصلاح Dpc الخاصة بالموقع على الحمض النووي في خلايا الثدييات سليمة. هذا الأسلوب هو تنوعاً، وقد استخدمت للحصول على نتائج إصلاح عقب تعداء في الهامستر وخطوط الخلايا البشرية. تعداء بلازميد يمكن أن يؤديها باستخدام ليبوفيكشن أو انهانسر في خطوط خلايا الثدييات. كما يضمن أن يقاس فقط إصلاح Dpc محددة، ولا أنواع أخرى من تلف الحمض النووي الناجم عن معظم وكلاء تشكيل DPC. الالتهاب-قبكر سهلة لتنفيذ وغير مكلفة وسريعة. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الفحص اكتشفت أحداث إصلاح لها في أقرب وقت تعداء بعد ح 2. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراسة المتغيرات التي قد تؤثر على نتائج إصلاح DPC بطريقة حساسة وفعالة. على سبيل المثال، دور النسخ في إصلاح DPC لم يتم تقييم صارم. بسبب مرونة الإنزيم qPCR الالتهاب، يمكن التلاعب بها موقع كروسلينكينج شركة ظفار لمعالجة هذه المسألة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مقدمة مصدر للنسخ المتماثل إلى بلازميد DPC الحاملة لمعالجة تأثير النسخ المتماثل على إصلاح DPC. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إنشاء كروسلينكس متعددة على بلازميد دراسة الاختلافات في إصلاح DPC واحد مقابل كروسلينكس متعددة. هذه هي الأسئلة التي سيكون من الصعب الإجابة باستخدام الحمض النووي صبغية ولكن يمكن معالجتها بسهولة باستخدام مقايسة الالتهاب قبكر. عموما، يتطلب الفحص qPCR الالتهاب تنقيته، بلازميد الحمض النووي في كميات ميكروغرام المحتوية على آفة موقع معروف. أدوكتس إلى جانب DPC يمكن أن تستخدم في هذا التحليل، ولكن يجب أن الآفة قادرة على منع امتداد من [تق] [بولمرس].

1-جيل بلازميد المحتوية على شركة ظفار

1. الجمع بين بمول 80 من اليغنوكليوتيد التي تتضمن بقايا 8-أوكسوجوانيني (20 ميليلتر) مع 10 وحدات من T4 بولينوكليوتيدي كيناز (1 ميليلتر) في المخزن المؤقت ليجاسى x 10 (5 ميليلتر). إضافة الماء تصل إلى إجمالي حجم 50 ميليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي ساخن.
   1. الجمع بين اليغنوكليوتيد فوسفوريلاتيد (50 ميليلتر)، بمول 80 من الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (80 ميكروليتر)، 100 وحدة بوليميراز بوليميراز (20 ميليلتر) في 10 x Taq رد فعل المخزن المؤقت (25 ميليلتر)، ATP 100 مم (20 ميليلتر)، دنتبس 10 مم (20 ميليلتر)، NEB المخزن المؤقت 2 (25 ميليلتر)، و 8 ميكروغرام جيش صرب البوسنة (20 ميليلتر) مجموع 260 ميليلتر. إينكوباتي عينة في ثيرموسيكلير تعيين عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك إضافة 60 يو T4 بوليميراز (20 ميليلتر)، 8,000 T4 يو ليجاسى (20 ميليلتر)، 100 ملم ATP (20 ميليلتر)، دنتبس 10 مم (20 ميليلتر)، NEB المخزن المؤقت 2 (15 ميليلتر)، و 8 ميكروغرام جيش صرب البوسنة (20 ميليلتر) مجموع 375 ميليلتر. احتضان رد فعل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية (الشكل 1A).
2. إنشاء مزيج فينول: كلوروفورم العازلة المشبعة 50: 50. إضافة كميات متساوية من كل مكون، مزيج، وتدور في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي في 21,130 س ز لأدنى 5 كلوروفورم محركات المياه من الفينول العازلة المشبعة بتشكيل طبقتين: طبقة علوية، والمائية والقاع، والطبقة العضوية. إضافة ميليلتر 375 من الطبقة الدنيا، والعضوية إلى رد فعل التمديد التمهيدي، مزيج، وتدور في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي في 21,130 س ز لمدة 5 دقائق.
   تنبيه: الفينول كلوروفورم والمواد الخطرة وينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب ملامسة الجلد أو العينين.
   1. عقب الطرد المركزي، بعناية استخراج الطبقة العليا وخلط مع خلات الأمونيوم إضافة إلى تركيز نهائي من 0.3 M متبوعاً بكميات الإيثانول 100% 2. تخزين الحل في-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل.
   2. تدور العينة في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي في 15000 لفة في الدقيقة العاشرة في 4 درجات مئوية عن 10 دقيقة إزالة المادة طافية وتغسل بيليه في 1 مل إيثانول 70%. تدور العينة في أعلى الجدول للطرد مركزي في 15000 لفة في الدقيقة العاشرة في 4 درجات مئوية كحد أدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من الماء.
3. الجمع بين 50 ميليلتر من الحمض النووي من الخطوة السابقة مع ميليلتر 16 6 س جل-تحميل صبغ و 34 ميليلتر المياه ورهنا بالتفريد على نسبة 0.8% ذوبان منخفضة [اغروس] هلام المحتوية على 0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. تشغيل الهلام في الخامس/سم 2 على جل 10 سم ح 6 في المخزن المؤقت x TAE 1. المكوس الفرقة سوبيركويليد باستخدام شفرة حلاقة وتزن الشريحة هلام (الشكل 1A). تشغيل عنصر تحكم إيجابية ليكون بمثابة علامة حيث يهاجر الحمض النووي تساهمي مغلقة، سوبيركويليد.
   تنبيه: اثيديوم بروميد مطفر وينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب ملامسة الجلد. أيضا، من المهم تقليل الوقت الذي عينة بلازميد يتعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل الحد من تشكيل برومة الأشعة فوق البنفسجية.
   1. هضم الشريحة جل بإضافة 10% β-أجاراسي رد فعل المخزن المؤقت لكل ملغم من وزن هلام. احتضان عند 65 درجة مئوية 10 دقيقة وباردة إلى 42 درجة مئوية. إضافة 10 يو من β-أجاراسي واحتضان في 42 درجة مئوية ح 1.
   2. حضانة التالية، قياس الحجم وإضافة خلات الأمونيوم إلى تركيز نهائي 0.3 م والبرد على الجليد ل 15 دقيقة للطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجمع المادة طافية، وإضافة وحدات التخزين 2 من الايزوبروبانول. البرد في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   3. الطرد المركزي في الحمض النووي المنقي، سوبيركويليد لمدة 10 دقائق في 15000 لفة في الدقيقة العاشرة في أعلى الجدول للطرد مركزي في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه في 40 ميليلتر من الماء.
4. Pmol 12 التشعب (15 ميليلتر) من الحمض النووي إلى 36 بمول من جليكوسيلاسي أوكسوجوانيني (1 ميليلتر) في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100 مم كلوريد الصوديوم (3 ميليلتر)، 1 مم مجكل₂ (3 ميليلتر)، 20 تريس-HCl pH 7.0 (6 ميليلتر)، و 10 ملم الصوديوم سيانوبوروهيدريدي (2 ميليلتر) للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 30 ميليلتر في 37 درجة مئوية ل ²⁶من 30 دقيقة. إزالة 1 ميكروليتر من عينة كروسلينكيد وتمييع في 500 ميليلتر من الماء ليكون بمثابة ح 0 نقطة البيانات وتحليل PCR في الخطوة 3.

2-بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي هطول الأمطار

1. تصور الكفاءة كروسلينكينج، هضم تقييد 1 ميكروغرام من بلازميد كروسلينكيد مع 1 ميكروليتر DI باهوجان ساماجفي المخزن المؤقت x 10 في 37 درجة مئوية ح 1 لتوليد أجزاء الحمض النووي الحجم مختلفة اثنين.
   ملاحظة: سيتم بلغة واحدة كروسلينكيد للبروتين (4.4 كيلو بايت) وأخرى لن (2.8 كيلو بايت) (الشكل 1B).
   1. تقسيم العينات إلى النصف، إضافة الحزب الديمقراطي الصربي على حد سواء إلى تركيز نهائي من 0.5%، واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. إضافة بوكل (تركيز نهائي 100 مم) إلى واحدة من العينات واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
   3. الطرد المركزي كل العينات في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وتشغيلها في supernatants على [اغروس] هلام لتقدير نسبة تصريف البروتين للحمض النووي¹².
      ملاحظة: يتم استخدام الأمطار بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي لمراقبة الجودة، وعدم إعداد سفلية.

3-تعداء في خلايا الثدييات

1. يوم واحد قبل تعداء، لوحة 0.5 × 10⁶ خلايا/بئر في لوحة 6-جيدا. في اليوم التالي، مزيج 1.5 ميكروغرام (30 ميليلتر) من بلازميد المحتوية على شركة ظفار (من الخطوة 1، 6) مع 300 ميليلتر لوسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل. في أنبوب آخر، مزيج ميليلتر 12 من كاشف تعداء و 300 ميليلتر لوسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل. والجمع بين 300 ميليلتر من الحمض المخفف مع 300 ميليلتر من كاشف تعداء المخفف واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 250 ميليلتر من المجمعات إلى كل من بئرين واحتضانها للحد أدنى من 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
2. بعد الحضانة، قم بإزالة الوسائط وإضافة 1 مل يدتا الحزب الديمقراطي الصربي/0.01 M 0.6 في المائة، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لتتخلص الخلايا باستخدام شرطي مطاط من 10-15 دقيقة ونقل إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. إضافة 200 ميليلتر من "كلوريد الصوديوم م" 5 (تركيز نهائي 1 م)، عكس بلطف 5 مرات، واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها²⁷.
3. الطرد المركزي هذه العينات في س 21,130 ز في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وجمع متسرعا الإيثانول طافية، كما هو موضح أعلاه، وريسوسبيند في 50 ميليلتر من الماء.

4-الالتهاب--قبكر

1. مزيج معا 1 ميليلتر من الحمض النووي تم استردادها من كل وقت نقطة (بما في ذلك 0 ح)، 2 x ميكس سيد بكر سيبر الخضراء (30 ميليلتر)، 27 ميليلتر من الماء، و 1 ميليلتر (بمول 100) للتمهيدي يكمل حبلا الضرر من بلازميد (R التمهيدي، الشكل 2). إجراء PCR استخدام الشروط التالية: الأولى تذوب قبل 10 دقيقة عند 90 درجة مئوية، تليها 8 دورات: 90 درجة مئوية، 15 ثانية، 65 درجة مئوية، 1 دقيقة. عند انتهاء دورة إضافة 8 1 ميليلتر (بمول 100) للتمهيدي الثاني بإجمالي 60 ميليلتر (L التمهيدي، الشكل 2)²⁸ (انظر الجدول للمواد للحصول على تفاصيل الكاشف).
2. استرداد ميكس 1 ميليلتر من unamplified الحمض النووي من كل وقت نقطة (بما في ذلك 0 ح)، 2 x ميكس الرئيسي (30 ميليلتر)، 27 ميليلتر من الماء، و 1 ميليلتر من كل التمهيدي (بمول 100) لعدد 60 ميليلتر.
3. تحميل لوحة بكر 96-جيدا مع العينات من الخطوات 4.1 و 4.2 (20 ميليلتر/جيدا، في ثلاث نسخ) وأداء qPCR لدورات 30 استخدام الشروط الموضحة أعلاه.
4. متوسط القيم CT من كل مجموعة من ثلاث عينات. طرح القيم المقطعية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 1 من تلك الموجودة في الخطوة 4، 2 للحصول على دلتا نهر قيمة الأشعة المقطعية لكل عينة. طرح النقطة 0 ح الوقت من قيمة دلتا CT لإزالة أي خلفية (انظر نتائج ممثل قسم للحصول على وصف مفصل).
5. تحويل دلتا نهر CT قيمة إصلاح النسبة المئوية باستخدام الصيغة:
   

من أجل الاستفادة من التحليل الالتهاب qPCR لتقييم الإصلاح DPC الخلوي، يجب إعداد كمية كافية (المبالغ ميكروغرام) من الركازة إصلاح DPC عالية الجودة. للحصول على هذا المنتج، كان اليغنوكليوتيد التي تحتوي على بقايا 8-أوكسوجوانيني الملدنة ليكمل الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل، التمهيدي الموسعة، وجل المنقي لضمان استخدام المنتج دائرية مغلقة فقط تساهمي، ترانسفيكشنز (الشكل 1A). ويركز هذا التقرير على ركائز فيها تعويض بورهيدريد يستخدم لإنشاء من التشعب التساهمية بين جليكوسيلاسي أوكسوجوانيني البشري الماشوب ووحدة ريبوز في جزيء بلازميد دائري مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، على الرغم من تماثل النهج يمكن استخدامها للحصول على ركائز DPC كيميائيا المتنوعة. وتتمثل الاستراتيجية الملائمة جليكوسيلاسي/بورهيدريد أوكسوجوانيني جاذبية خاصة نظراً لكفاءة عالية للغاية من رد فعل كروسلينكينج. كما هو مبين في الشكل 1 باء، هطول الأمطار بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي يقوم على الركازة DPC التي قد تم هضمها إلى قسمين الشظايا بشكل انتقائي والكمية تقريبا المنضب جزء الحمض النووي على إيواء في DPC. هذه النتائج تؤيد الاستنتاج بأن أساسا 100% جزيئات الركازة بلازميد يتضمن من التشعب بروتين.

والرزن qPCR الالتهاب الموصوفة في المقطع بروتوكول يستخدم القيم المقطعية التي تم إنشاؤها بواسطة qPCR لحساب النسبة المئوية لإصلاح DPC عقب تعداء في خلايا الثدييات. وكما يبين الشكل 2 ، كتل التشعب البروتين [تق] [بولمرس] من توسيع التمهيدي 'R' تعتيق حبلا المحتوية على شركة ظفار. ميزة حاسمة، والثاني من هذا التحليل هو إدراج ثماني جولات من تفاعلات الالتهاب (باستخدام الدليل التمهيدي R) قبل إجراء الفحص قبكر. بينما الحمض النووي غير التالفة (أو إصلاحه) سيمتد خلال هذه التفاعلات الالتهاب، إنشاء موقع ربط للتمهيدي 'ل' المصب، تلف الحمض النووي (أو الحمض النووي غير كامل تم إصلاحه) سوف لا تمدد. ونتيجة لذلك، يزيد الالتهاب الوفرة من كل حبلا غير التالفة (أو إصلاحه) قبل اايتفولد. وهذا يعني أن إصلاح العينات التي قد أنجز خطوة الالتهاب قبل qPCR سيتم عرض قيمة الأشعة المقطعية ثلاث وحدات أقل من تلك التي تم الحصول عليها لنموذج مطابق الذي أنجز الالتهاب لا قبل قبكر (الشكل 2). الفرق الثلاثة-الوحدة في القيم المقطعية للعلاجات اثنين، يشار إلى ΔCT، ويعكس الحقيقة أن 8 = 23. يمكن استخدام هذا دلتا قيمة الأشعة المقطعية لحساب الحمض الخلوي إصلاح النشاط باستخدام الصيغة: نسبة إصلاح الحمض النووي = (2ΔCT/23) x 100. وأكدت تجارب التحكم أن دلتا CT قيمة حوالي 3 لوحظ استمرار عندما تعرض والبلازميدات الركيزة غير التالفة للالتهاب-قبكر (البيانات لا تظهر).

يصف الجدول 1 القيم المثال الأشعة المقطعية التي تم إنشاؤها من ركائز بلازميد المحتوية على DPC التي كانت تعافي من الهامستر الصيني الرئة الليفية 3 ح وح 8 بعد تعداء (الجدول 1A)، فضلا عن من الوقت صفر العينات، أي، العينات التي تم إعداد كما هو موضح في المقطع بروتوكول، ولكن لا ترانسفيكتيد داخل الخلايا (الجدول1 باء). ويقدم الجدول أيضا ΔCT، وإصلاح المئة القيم (محسوبة باستخدام الصيغة 2ΔCT23 x 100) التي تم الحصول عليها من هذه العينات. كما هو موضح في الجدول 1 ألف، إصلاح النسبة المئوية محسوبة من عينات المقطوع ح 3 وتعداء بعد ح 8 كان 66% و 93% على التوالي. يتم طرح هذه القيم ثم من التي تم الحصول عليها من تحليل العينة 0 ح لتحديد النسبة المئوية لإصلاح. يصف الجدول 1 باء القيم المقطعية لعينات مختلفة 0 ح اثنين الذي كان crosslinking كفاءة أو لم يتحقق قبل تعداء. كفاءة كروسلينكيد عينة أسفر دلتا CT قيمة 0.8 حين عينة كروسلينكيد سيئة أدت إلى دلتا CT قيمة 2.5. وحتى الآن، لم يمكن دقة تحديد مصدر الإشارات الخلفية 0.8 في كفاءة كروسلينكيد 0 ح عينة. فإنه من غير المحتمل أن هذه الخلفية ويعكس تدني مستوى أما إزالة DPC عفوية، أو هو بسبب انخفاض مستوى بوليميراز بوليميريز 'تجاوز' التوليف عبر الآفة DPC: تجارب واسعة النطاق أجريت على تنقية عالية الركيزة M13 واحد-الذين تقطعت بهم السبل استمرار أسفرت عن دلتا CT قيمة 0.8 تقريبا، أيمطابقة أساسا لهذا 'الخلفية' ملحق ينظر في الركازات المحتوية على DPC. ونتيجة لذلك، فمن المحتمل أن هناك درجة صغيرة من سوء فتيلة التمهيدي 'R' أثناء الالتهاب الذي يؤدي إلى توليد كمية صغيرة من المنتجات التي يمكن توسيعها فيما بعد عندما تتم إضافة التمهيدي 'ل' و qPCR تنفيذه. أن الجهود المبذولة للقضاء على هذه الخلفية عن طريق التلاعب في شروط PCR، حتى الآن، فشل في تصحيح هذا الخلل. ومع ذلك، يسمح استراتيجية الطرح الوارد وصفها أعلاه تقدير دقيق لنشاط إصلاح DPC. أنه يستحق مشيراً إلى أن كروسلينكينج غير فعالة من البروتين على بلازميد سيؤدي إلى قيمة مرتفعة خلفية. ويرد هذا في نموذج البيانات المقدمة في الجدول 1 باء حيث أسفر crosslinking عدم كفاءة البروتين-الحمض النووي دلتا أعلى قيمة الأشعة المقطعية للوقت 0. ولذلك، تجري تجارب التحكم دائماً قبل الشروع في ترانسفيكشنز وركائز مع دلتا CT قيم مرتفعة أعلاه 0.8 يتم تجاهل مستوى العتبة. كما ورد في بروتوكول قبكر، ينقسم كل عينة إلى الآبار 3 لضمان اتساق بيبيتينج. ثم يتم حساب متوسط هذه replicates الحصول على قيمة الأشعة المقطعية لهذه العينة. وإنشاء نسخ متماثلة على إلغاء تنحرف أكثر من ± 0.1 من مجموعة البيانات. إذا replicates الثلاثة جميع تنحرف أكثر من ± 0.1 من بعضها البعض، هو إعادة بنائه الإنزيم qPCR الالتهاب حتى يتم الحصول على القيم متسقة. وتبين التجربة أنه يجب إجراء ترانسفيكشنز مستقلة على الأقل 3 للحصول على متوسط قيم موثوق بها ثم يمكن إخضاعها للتحليل الإحصائي لتحديد تأثير المعلمات المختلفة على كفاءة إصلاح DPC.

رقم 1. جيل من بلازميد المحتوية على DPC. (أ) اليغنوكليوتيد المحتوية على تعتيق واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (دائرة أسود غامق) بقايا 8-أوكسو-جوانين (أحمر) وتمتد إلى إنشاء مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل بلازميد (تمديد التمهيدي المنتج المبين بخط متقطع). وبعد التفريد في اثيديوم بروميد، اقتطعت من ذوبان منخفضة [اغروس] هلام الفرقة المقابلة للحمض النووي سوبيركويليد (المربع الأحمر) وهضمها مع β-أجاراسي. الممرات: (1) الوزن الجزيئي ماركر، الحمض النووي (2) واحد الذين تقطعت بهم السبل، الحمض النووي (3) المزدوجة الذين تقطعت بهم السبل، (4) التمهيدي تمديد العينة. (ب) أوكسوجوانيني جليكوسيلاسي (hOGG1 المختصر، وصفت دائرة أورانج) كروسلينكيد لبقايا 8-أوكسو-جوانين عبر سيانوبوروهيدريدي الصوديوم والركيزة DPC الناتجة عن هضم لتوليد زوج قاعدة 2,800 والحرة الحمض النووي جزء من 4,400 زوج قاعدي بلغة يعلق على البروتين. الحزب الديمقراطي الصربي إضافة إلى العينة ثم ينقسم إلى جزأين، أحدهما هو تعامل مع بوكل وتثفيل للرواسب DPC التي تحتوي على الحمض النووي (وصفت بيليه برتقالي). المادة طافية من هذا النموذج الأخير (يصور كالأزرق مائع في أنبوب الطرد المركزي) والعينة لا يتعرض إلى بوكل يتعرضون لجل التفريد. الممرات: (1) الوزن الجزيئي ماركر، (2)-بوكل، (3) + بوكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: التحديد الكمي بلازميد التالفة عن طريق الالتهاب-قبكر- بلازميد الحمض النووي هو التشويه والتحريف وتمهيدي يكمل حبلا التالفة (R) هو تعتيق والموسعة. يتم تكرار هذه العملية لما مجموعة 8 دورات. مع الركازة تالفة (أعلى)، [تق] [بولمرس] يتم حظره بواسطة الآفة DPC ولن تنتج خيوط منتج كامل طول. وفي المقابل، مع الركازة إصلاحه (أسفل)، [تق] [بولمرس] سوف تنتج خيوط كامل طول المنتج الذي يحتوي على الموقع ملزم للتمهيدي ل. بعد 8 دورات، تتم إضافة التمهيدي ل، وقيم العتبة دورة مصممون على استخدام قبكر. يوضح المثال تضخيم النتائج لركائز المعطوبة وغير التالفة على الحق مع الخط الأحمر الذي يمثل الحمض النووي الذي خضع لتمديد التمهيدي قبل قبكر والأزرق يمثل الحمض النووي الذي لم يكن التمهيدي الموسعة قبل قبكر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: حساب المئة إصلاح استخدام قيم CT المتولدة من الالتهاب-قبكر- (أ) إصلاح الركازة المحتوية على DPC transfected في V79 الهامستر الصيني الرئة الليفية 3 ح وح 8 تعداء بعد. (ب) الالتهاب qPCR العينات 0 ح لا ترانسفيكتيد داخل الخلايا. كان في عينة واحدة فعالية رد فعل crosslinking بين الحمض النووي وأوكسوجوانيني جليكوسيلاسي عالية (هذه العينة أسفرت عن قيمة دلتا منخفضة CT) بينما في العينة الأخرى كفاءة crosslinking البروتين كان منخفضا (هذه العينة أسفرت عن دلتا عالية نسبيا قيمة CT). انظر النص من النتائج ممثلة للحصول على التفاصيل.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.