مقالة منهجية

الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

DOI:

10.3791/57422

⸱

يوليو 15, 2018

 ,  ,  , 
1Plant Molecular and Cellular Biology Program, University of Florida, 2Department of Biology, University of Florida, 3Genetics Institute (UFGI), University of Florida, 4Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University, 5Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (ICBR), University of Florida

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول وصف أسلوب إعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب مفيد للدراسات البيولوجية الفسيولوجية وغيرها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة خلايا الحرس ضروري لمعرفة المساهمات المحددة لهذا النوع من الخلية للدالة الشاملة للنباتات. ومع ذلك، غالباً ما يصعب عزل وهكذا دراستها غالباً ما يوفر تحديا.

تحدد هذه الدراسة أسلوب إثراء stomatal حارس خلية. ويستخدم البروتوكول اﻻسكتلندي لعزل خلايا الحرس واستخراج البروتينات من الخلايا. هذا الأسلوب يحسن السلامة والعائد لحراسة الخلية أثناء العزل وتوفر نموذج موثوق بها لدراسة عمليات إرسال الإشارات في الخلية، وكيفية الربط بين حركة ستوماتال تعمل. في هذا الأسلوب، أوراق النبات تم تقسيمه بين جزأين من الشريط ومقشرة بعيداً لإزالة الجانب أباكسيال. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة أوراق نبات لعزل خلايا الحرس. الخلايا تعامل مع فلوريسسين اسيتات (FDA) لتحديد جدوى وحمض التسقيط (ABA) لتقييم حركة الثغور في الاستجابة لرابطة المحامين الأمريكية. وفي الختام، يثبت هذا البروتوكول مفيدة لإعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب وعزل البروتينات. الحصول على نوعية الخلايا والبروتينات هنا تمكين الفسيولوجية والدراسات البيولوجية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الثغور دوراً هاما في علم وظائف الأعضاء واللياقة البدنية للنباتات عموما. هذه الهياكل محطة صغيرة محددة يتم تشكيلها من قبل اثنين من خلايا البشرة المتخصصة المعروفة باسم خلايا الحرس وتم العثور على الأكثر وفرة على سطح الأوراق أباكسيال. الثغور ضرورية لتبادل الغازات بين النبات والغلاف الجوي، فضلا عن السيطرة على فقدان الماء عن طريق النتح. تنظيم خلايا الحرس الفتحة الثغور من خلال التكامل الخارجي مختلفة (مثلاً، والضوء، والرطوبة، والممرض الاتصال، مستويات ثاني أكسيد الكربون) والداخلية (على سبيل المثال.، الهرمونات الذاتية) المحفزات1،2. في السنوات العشرين الماضية، أصبح هذا النوع خلية نظام نموذجي لدراسة الخلية إشارات العمليات في مصانع. هذه الخلايا تشكل نسبة ضئيلة من مجموع الخلايا في ورقة؛ وهكذا، للتحقيق على الخلوي فريدة من نوعها، الخصائص الكيميائية الحيوية والجزيئية في طريقة وحيدة الخلية، ومن الضروري أن عزلها عن سائر أنواع خلية ورقة. في الماضي، كثيرا ما شملت الدراسات خلية الحرس إعداد خلية الحرس بروتوبلاستس (GCP)3،،من45. هذا عادة يتطلب استخدام كميات كبيرة من الإنزيمات المهينة جدار الخلية واو تعطل الميكانيكية عن طريق مزج، وقد ثبت أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لأنه يأخذ عادة عدة ساعات لإعداد عينة GCP، كثيرا ما مرات مع العائد القليل. الأهم من ذلك، لأنه بمثابة خلايا الحرس أزواج كاملة لتنظيم الفتحة الثغور، استخدام GCP يمكن اعتبار نظام مصطنع لدراسة مما يشير إلى خلية الحرس.

هنا، قمنا بتطوير أسلوب إعداد الثغور التي هي إثراء سليمة الحرس الخلايا والحفاظ على الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات. هذه الطريقة مستوحاة من أسلوب الذي تم استخدامه لعزل mesophyll خلية بروتوبلاستس6،7. في أسلوبنا، تعد الثغور باستخدام واضحة اﻻسكتلندي لأول مرة فصل غالبية الخلايا mesophyll يعلق على طبقة أداكسيال نبات من طبقة أباكسيال التي تحتوي على خلايا الحرس والرصيف. يتم ذلك عن طريق لصق قطعة من الشريط لكل جانب من النبات وتقشير لهم عن بعضها البعض. الخلايا من طبقة أباكسيال يسمح باسترداد تحت الضوء في المخزن مؤقت فتح الثغور. بعد تتم إزالة الخلايا الأرصفة المتبقية باستخدام كمية صغيرة من جدار الخلية اللاإنسانية الإنزيمات، تاركة وراءها الحرس الخلية التي يتم إثراء على الشريط.

في هذه الطريقة البسيطة، خلايا الحرس ستوماتال تكون قابلة للاستمرار وتستجيب بسرعة وكفاءة تكون مستعدة، مع أخذ أقل من ساعة واحدة للحصول على خلايا الحرس ستوماتال المخصب من القشور 50 مع أدنى حد من التكلفة. الأسلوب هنا يفرض أقل ضررا على الخلايا النباتية من الأساليب السابقة حيث يتم إعداد بروتوبلاستس. وباﻹضافة إلى ذلك، المواد التي جمعت من هذا الأسلوب الغلة البروتين المرغوب فيه المبالغ. الأهم من ذلك، لأن الورقة لا تخضع لمزج أو خلايا الحرس وأوقات الهضم طويلة تبقى على حالها، ونتائج الدراسات سوف أوثق تكون ذات الصلة بعلم الأحياء الطبيعية خلية الحرس. مع هذا الأسلوب، يمكن الربط بين حركات stomatal في الوقت الحقيقي مع التغيرات على المستوى الجزيئي. وبالتالي، سيكون من المهم إلى فهم أكثر شمولاً لخلية الحرس مما يشير إلى المعرفة المكتسبة من استخدام هذا الأسلوب في إعداد الدراسات.

كنا النبات نبات التمويل كنموذج؛ ومع ذلك يمكن تطبيق هذا البروتوكول في إثراء stomatal خلايا الحرس في الأنواع النباتية الأخرى مثل نابوس كرنب مع بعض التعديلات الصغيرة في وقت الهضم. كدليل على المفهوم، لقد أظهرنا أن خلايا الحرس ستوماتال المخصب عن طريق هذا الأسلوب ناجعة وسريعة الاستجابة للمحفزات كما هو موضح بمقايسة اسيتات (FDA) fluorescein ودراسات استخدام حمض التسقيط هرمون النبات (ABA)، على التوالي. وباﻹضافة إلى ذلك، أثبتنا أن البروتينات عالية الجودة يمكن أن تكون معزولة من هذه الخلايا الحرس. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لهذه العملية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-زراعة النباتات

  1. تنبت البذور في بوتينغ الخليط. تنمو النباتات في حجرة نمو مع شدة ضوء 140 µmol الفوتونات م2 ق 1 وكبيرة ح 8 الضوء على 22 درجة مئوية و 16 ح الظلام عند 18 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
  2. زرع شتلات أحجام مماثلة على حدة في القطر الأواني 4 "التي تحتوي على التربة وتنمو لمدة 3 أسابيع في نفس الظروف إضافية الموضحة في الخطوة 1، 1.
    ملاحظة: المياه والنباتات بماء الصنبور مرتين في أسبوع للحفاظ على رطوبة التربة.

2-إعداد الثغور مخصب

  1. إزالة أوراق النباتات التمويل ألف- 5-الأسبوع القديمة الفردية مع مشرط.
  2. إرفاق كل ورقة إلى قطعتين من الشريط سكوتش واضحة، مع التمسك بالجانب (السفلي) أباكسيال قطعة واحدة وقطعة أخرى الانضمام إلى الجانب (العلوي) أداكسيال من الورقة. ترك الشريط على ورقة 5 s.
  3. لطيف قشر عدا قطعتين من الأشرطة باستخدام السبابة والإبهام على كل جهة لفصل الجانب أباكسيال مع الرصيف وخلايا الحرس والجانب أداكسيال مع خلايا mesophyll.
  4. مكان القشور من الجانب أباكسيال من الأوراق في 60 مل الثغور فتح المخزن المؤقت (50 مم بوكل، 10 مم مس-كوه، تعديل درجة الحموضة 6.2 مع 1 م كوه) في حجم 40 ملم × 12 ملم بيتري الأطباق كما التي تم جمعها.
    1. كرر الخطوات أعلاه حتى يتم تجميع جميع العينات القشور.
  5. ضع أطباق بيتري المحتوية على القشور في غرفة النمو تحت ظروف الإضاءة المذكورة في الخطوة 1، 1. اترك القشور تحت الضوء ح 2 لفتح الثغور تماما.
  6. مكان القشور إلى 150 ملم × 20 ملم طبق بتري يحتوي على 50 مل جدار الخلية هضم خليط إنزيم (0.7% سيلولاسي R-10 ماسيروزيمي 0.025% R-10، 0.1% (w/v) بوفيدون-40 والبومين المصل البقري 0.25% (w/v) في الحل الأساسي 55% (0.55 م السوربيتول، 0.5 مم كاكل2، مجكل 0.5 مم2، وحمض الأسكوربيك 0.5 مم، 10 ميكرون خ2ص4، 5 ملم عدد حمض 4-مورفولينيثانيسولفونيك (MES) على درجة الحموضة 5.7 تعديلها مع 1 م كوه).
  7. اهتز القشور على شاكر المعاملة بالمثل في طبق بتري 50 لفة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
  8. إزالة القشور من إنزيم الحل مع الملقط بعد 20 دقيقة نقل القشور إلى طبق بتري حجم 150 ملم × 20 ملم التي تحتوي على 50 مل الماء.
  9. استخدام ماصة نقل، شطف القشور لمدة 15 ثانية مرتين مع 10 مل الماء لإزالة أي حل الإنزيم المتبقية.
  10. استخدام الملقط لوضع القشور في طبق بتري حجم 150 ملم × 20 ملم مع 50 مل الثغور جديدة فتح المخزن المؤقت المستخدم في الخطوة 2، 4. احتضانها ح 1 في ضوء الظروف المذكورة في الخطوة 1.1 للسماح الثغور لاسترداد.

3-حمض التسقيط (ABA) العلاج والفحص حركة الثغور

  1. في طبق بتري حجم 150 مم × 20 مم. احتضان القشور الثغور المخصب عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 50 مل من المخزن المؤقت افتتاح ستوماتال أو في 50 مل من المخزن المؤقت افتتاح ستوماتال بتركيز نهائي من 10 ميكرون أبا لوقت العلاج المناسب.
  2. وضع القشور على شاكر 50 لفة في الدقيقة لمدة 5 و 15 و 30 دقيقة. بعد كل فاصل الوقت إزالة قشر مع ملاقط واتبع الخطوات التصوير في الخطوة 3، 3.
  3. التقاط صور الثغور قبل العلاج أبا، وفي نقاط زمنية مختلفة بعد العلاج أبا مع مجهر ضوء.
    1. يأخذ قشر ووضعه على شريحة الميكروسكوب زجاجية.
    2. ضع الشريحة في مرحلة مجهر وضبط المرحلة بحيث يمكن تصور صورة قشر.
    3. ضبط الغرامة والتركيز على المجهر للحصول على صورة واضحة لخلايا الحرس بالطبع.
    4. تتخذ عدة صور من الثغور متعددة في 40 X التكبير.
  4. قياس 60 فتحات ستوماتال باستخدام إيماجيج8.
  5. حساب الخطأ القياسي وأهمية في قيمة p < 0.05 من القياسات الفتحة ستوماتال 60.

4-البروتين استخراج وفصل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة

  1. تطحن القشور لمدة 15 ثانية في النتروجين السائل ما يكفي لتغطية القشور باستخدام مدافع الهاون مبردة ومدقة.
  2. كل القشور 50، أضف 3 مل فينول تريس المشبعة (pH 8.8) المخزن المؤقت لاستخراج البروتين 3 مل (0.9 م السكروز، 0.4% 0.1 M تريس-HCl، يدتا 0.01 متر، 2-ميركابتوثانول، 10 ميليلتر من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز 1 مم) مع ماصة لقذائف الهاون وثم تطحن القشور لعدي 5 دقيقة الدولي ه في غطاء دخان.
  3. استخراج استخدام ماصة نقل والقشور استخدام ملاقط معدنية ل Oakridge الطرد المركزي أنبوب وتحرض على شاكر 50 لفة في الدقيقة ح 1 في 4 درجات مئوية.
  4. إزالة القشور من أنبوبة الطرد المركزي Oakridge والطرد المركزي المقتطف في غ س 5,000 لمدة 10 دقائق. ثم نقل في مرحلة الفينولية العلوي إلى أنبوب تنظيف مايكرو--أجهزة الطرد المركزي جديدة باستخدام ماصة.
  5. متسرعا الفينول استخراج البروتينات بإضافة 5 مجلدات من خلات الأمونيوم 0.1 م المثلج في الميثانول 100%. الدوامة بإيجاز واحتضان بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
  6. الطرد المركزي في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وصب المادة طافية بصب ببطء من الخروج من الأنبوب ويحتفظ بيليه البروتين في الأنبوب.
  7. أغسل بيليه البروتين مرتين مع خلات الأمونيوم 0.1 متر في الميثانول، ومن ثم مرتين مع الأسيتون 80% ومرة مع الأسيتون البارد 100%.
    ملاحظة: يغسل تتم بإضافة 10 مل كاشف المحدد إلى أنبوب البروتين. تحرض على شاكر 50 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، متبوعاً بالطرد المركزي في 15,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم صب الكاشف خارج الأنبوبة الإبقاء فقط البروتين بيليه.
  8. أضف 1 مل الأسيتون البارد 100% لبيليه، وإعادة تعليق ببطء بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  9. نقل تعليق البروتين خلال ماصة لأنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 2 مل ثم الطرد المركزي في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة الأسيتون بالصب عليه من الأنبوب وجاف بيليه في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق.
  11. حل البروتين في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي مع 200 ميليلتر من انحلال المخزن المؤقت (م 8 اليوريا، 0.5% الحزب الديمقراطي الصربي, 30 ملم تريس-HCl في الأس الهيدروجيني 8.5) ودوامه عن 30 دقيقة للطرد المركزي في 20,000 ز x عند 15 درجة مئوية 20 دقيقة وجمع المادة طافية في أنبوب جديد.
  12. قياس تركيز البروتين بعد بروتوكول تحديد مقدار البروتين9.
  13. استخدام عينات البروتين لفصل البروتين بالتفريد جل بعد البروتوكول10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صورة تمثيلية لنبات الحرس الخلايا قبل وبعد الهضم mesophyll وخلايا البشرة ويرد في الشكل 1. ويمكن ملاحظة صلاحية خلية الحرس قبل وبعد إزالة mesophyll وخلايا البشرة باستخدام إدارة الأغذية والعقاقير لقياس النشاط الأنزيمي وسلامة غشاء الخلية (الشكل 1 باء و دال 1). ويبين الشكل 2 حركة ستوماتال من نبات استجابة للعلاج أبا. الفتحة ستوماتال يقلل أكثر من 50 في المائة بعد 30 دقيقة علاج مع رابطة المحا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا الحرس نظام نموذجي لدراسة آليات توصيل الإشارات في النباتات ومن المهم التأكد من أن إعداد العينات المستخدمة في هذه الدراسة هو الأكثر ملاءمة للإجابة على الأسئلة البيولوجية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بخلايا الحرس داخل مجتمع البحوث النباتية، هناك لا يوجد طريقة عالمية على كيفية إعداد الخلايا الحرس ستوماتال التي سوف تسمح لكل من حركة ستوماتال وعلم وظائف الأعضاء فضلا عن التغيرات الجزيئية دراستها في أحد النظام. التحدي لعزل لهم يمكن أن يعزى في جزء كبير منه لصغر حجمها، ووفرة منخفضة وبنية فريدة من نوعها، التي يمكن أن تجعل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر دانيال تشن من "الرقمية الفيديو إنتاج فريق من بوشهولز المدرسة الثانوية" للمساعدة في تحرير الفيديو. دعمت هذه البحوث stomatal الحرس الخلايا والبروتينات وجميع في مختبر تشن من المنح المقدمة من "لنا المؤسسة الوطنية للعلوم" (0818051 و 1158000 و 1412547). ويدعم "مجلس المنح الدراسية الصيني" كونغ فنون. الدكتور قيوينج بانغ معتمد من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31570396).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

الفولاذ

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المقاوم للصدأ مشرط جراحيريشة   NC9999403
شريط سكوتش (3M)ULINES-9781
طبق بتريسيجما ألدريتشBR455701
السليولاز (Onozuka R-10)  Yakult صناعة الأدوية المحدودة21560003-3
Macerozyme R-10Yakult Pharmaceutical Industry Co.، Ltd.21560003-4
DM6000B المجهر كوكتيلات لايكا مايكروسيستمز
البروتياز والفوسفاتيز مثبطاتثيرمو فيشر العلمية   PI78443
أوك ريدج أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة PPCOالحرارية فيشر العلمية3119-0030
EZQ مجموعة كمية البروتينThermo Fisher ScientificR33200
Fluorescein Diacetate (FDA) ThermoFisher ScientificF1303
حمض الأبسيسيكSigma-AldrichA4906
Metro Mix 500BWI الشركات TX-500
Laemmli عينة عازلةBio-Rad161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250)Bio-Rad161-0786
أنبوب الطرد المركزي الدقيق (2 مل) الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية ، Inc.1620-2700
برنامج ImageJالمعهد الوطني للملاقط الصحية
 Sigma-AldrichF4017-1EA
12٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصبBio-Rad456-1043
شرائح مجهرFisherbrand12-550-A3

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
  2. Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
  3. Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
  4. Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
  5. Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
  6. Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10(2009).
  7. Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
  8. Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  9. Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
  10. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
  11. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
  12. Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE

مقالات ذات صلة