هنا يمكننا وصف بروتوكول لإنشاء واستزراع المستمدة من الإنسان والفأر ثلاثية الأبعاد (3D) المعدة أورجانويدس، والطريقة لنقل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد إلى أحادي الطبقة 2-الأبعاد. كما يتم وصف استخدام أحادي الطبقة الظهارية المعدة مقايسة الصفر-الجرح رواية لدراسات التجديد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الدراسات في المختبر لإصلاح الجرح المعدة عادة ما ينطوي على استخدام خطوط خلايا سرطان المعدة في مقايسة الصفر-الجرح انتشار الهاتف الخلوي والهجرة. واحد الحد الحرج من هذه الاختبارات، غير أن على تشكيلة متجانسة من أنواع الهاتف الخلوي. الإصلاح هو عملية معقدة تتطلب التفاعل بين العديد من أنواع الخلايا. ولذلك، لدراسة ثقافة خالية من الأنواع الفرعية الخلوية، هو مصدر قلق يجب التغلب عليها إذا أردنا أن نفهم عملية الإصلاح. نموذج أورجانويد المعدة قد تخفف من هذه المسألة حيث المجموعة غير متجانسة من أنواع الخلايا ويعكس عن كثب ظهارة المعدة أو غيرها الأنسجة الأصلية في فيفو. تظاهر هنا هو الرواية، و في المختبر فحص الصفر-الجرح المستمدة من الإنسان أو نات بالماوس أورجانويدس 3 الأبعاد التي يمكن ثم نقل إلى أحادي الطبقة الظهارية المعدة أما أورجانويدس سليمة أو كتعليق خلية مفردة أورجانويدس. وهدف البروتوكول هو إنشاء مونولاييرس طلائي المعدة المستمدة من أورجانويد التي يمكن استخدامها في نظام رواية الصفر-الجرح مقايسة لدراسة تجديد المعدة.
المقدمة
استخدام فحوصات الصفر-الجرح طريقة شائعة لدراسة إصلاح وتجديد1،2،،من34،،من56. يمكن استخدام المنهجية المقترحة للدراسة على وجه التحديد التجدد المعدة واستعمار الملوية البوابية . في الماضي، استخدمت خطوط خلايا سرطان المعدة كوسيلة لدراسة الإصابة جرثومة الملوية البوابية (H. pylori)1،2 وحتى الإصابة بسرطان المعدة مؤخرا كانت خطوط الخلايا مثل الخلايا AGS يفضل1 ،2،،من34. واحد الحد من الثقافات خلية سرطان المعدة هو فشلهم في الخص الخلوية تنوع ظهارة المعدة. في محاولة لمعالجة هذا القصور، أثبت هنا هو إنشاء ونقل الأولية المستمدة الإنسان والفأر 3 الأبعاد فونديك المعدة أورجانويدس (فجوس) لأحادي الطبقة الظهارية المعدة لفحوصات شفاء الجرح استناداً إلى أسلوب تم تعديل الأول ووصف شلايرمان وآخرون. 7 نثبت أن المعدة مونولاييرس طلائي المستمدة من المنفصمة 3D فجوس المعدة أو المستمدة من فجو الخلايا المفردة الاحتفاظ تكوين خلوي استقطاب الذي يمثل تعاونا وثيقا ظهارة المعدة المجراة في. نظراً لأن خطوط خلايا سرطان المعدة لا تثبت تكوين الخلية يعرض هذا الأسلوب، قد البروتوكول الحالي ميزة على أساليب بديلة الصفر-الجرح المقايسة. وقد تم تحسين هذه المنهجية مونولاييرس يمكن المنشأة من أورجانويدس كله أو من تعليق خلية واحدة من أورجانويدس منفصلان ومطلي باستخدام مصفوفة غشاء أو الكولاجين-طلاء بموجبها. والهدف العام من هذا البروتوكول إنشاء أورجانويد اشتقاق ثقافات أحادي الطبقة الظهارية المعدة مقايسة شفاء جرح رواية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لتجنب التلوث، تنفيذ البروتوكول في مجملها داخل غطاء زراعة الأنسجة عقيمة. الأنسجة البشرية فونديك جمعت من المرضى الذين يخضعون للأكمام gastrectomy وفقا للبروتوكول المعتمد الكندي جامعة سينسيناتي (رقم بروتوكول مجلس الهجرة واللاجئين: 2015-4869).
وافق جميع الماوس الدراسات جامعة سينسيناتي مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (إياكوك) الذي يحافظ على منشأة "الرابطة الأمريكية للتقييم" والاعتماد لمختبر الحيوان الرعاية (آآلاك).
1-إنشاء المستمدة من الإنسان 3D المعدة فونديك أورجانويدس
ملاحظة: يستند هذا البروتوكول على الأبحاث المنشورة سابقا في هذا المختبر8.
- تحضير الوسائط أورجانويد ثلاثي الأبعاد الذي يتألف من وسائل الإعلام R-سبوندين مكيفة تكييفاً Wnt و 20% 50%.
- تحضير الوسائط Wnt مكيفة، وثقافة الخلايا L في المتوسطة النمو Wnt (دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين) لمدة 7 أيام، حصاد المتوسطة، والتصفية باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- تحضير الوسائط R-سبوندين مكيفة. تنمو خط خلية المبيضي HEK-293T R-سبوندين معدلة في المتوسطة النمو R-سبوندين (دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين). عند الإلحاق بعد ح 2، تغيير المتوسطة من هذه الخلايا للنمو أوبتيميم المتوسط، 1% البنسلين/ستربتوميسين. ثقافة الخلايا لمدة 7 أيام. ثم الحصاد وسائط الإعلام R-سبوندين مكيفة والتصفية باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: قد سبق نشرة هذا البروتوكول وبروتوكول أكثر تفصيلاً تشير إلى 6،،من78.
- ذوبان الجليد المصفوفة الغشاء المخفضة، وخالية من الفينول الأحمر عامل النمو ح 16 على الجليد في 4 درجات مئوية. جمع الأنسجة في الجليد الباردة Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس في حاوية بلاستيكية كبيرة. تخزين على الجليد حتى بداية خطوة 1.4.
ملاحظة: يتم جمع الأنسجة من المرضى الذين يخضعون جاستريكتومي كم. - استخدام الملقط، يغسل النسيج بقوة في كوب عقيمة التي تحتوي على 100 مل Ca2 +/Mg2 +-الحرة الفوسفات مخزنة المالحة (دببس دولبيكو). أغسل لحوالي 30 ثانية أو حتى إزالة الأنقاض والدم. استخدام شاش معقم، مسح المقبل، بعيداً من الطبقة المخاطية من الظهارة.
- استخدام الملقط الكبير، بشدة فهم طبقة العضلات من الأنسجة ومع القوة، كشط بعيداً ظهارة استخدام ملقط مرقئ منحنى كبيرة. جمع شظايا الظهارية كشط إلى طبق بتري معقم، البوليستيرين.
- فرم الأنسجة الظهارية في حوالي 2.0 x 2.0 مم2 الحجم الأجزاء باستخدام شفرات الحلاقة لتحسين هضم الأنسجة. تغسل الأجزاء الأنسجة مع Ca2 +/Mg2 + -الحرة دببس وتستكمل مع المضادات الحيوية (Ca2 +/Mg2 + -الحرة دببس، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 0.25 مغ/مل الامفوتريسين ب 10 ملغ/مل الجنتاميسين، 50 ملغ/مل كاناميسين)، حتى الغسيل بالدم. أداء يغسل متعددة إذا لزم الأمر. تجاهل إيقاف الغسيل بواسطة تصفية الغسيل من خلال شاش معقم عناية داخل دورق نفايات.
- جمع غسلها الشظايا في زجاج 125 مل جولة قارورة السفلي مع شريط إثارة 25 مم وحضانة المعالجون مسبقاً وسائل الإعلام (الإعلام القاعدية وتستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 10 مم "حبيس المخزن المؤقت"، 1 ملغ/مل كولاجيناز نوع 1، 2 ملغ/مل خلية ثقافة الصف ألبومين المصل البقري). ختم قارورة أسفل جولة مع سيتا المطاط.
- إدراج إبرة العمود الفقري ز 20 سيتا وتوصيله بدبابة الأوكسجين مع الخراطيم المطاطية. لتصفية أي ملوثات، إدراج المناديل الورقية في الأنبوب لإنشاء عامل تصفية. بدوره على تدفق الأكسجين منخفضة. إدراج الإبر تدفق 10-15 في سيتا لتجنب تمزق سيتا.
- تأمين المجموعة تصل إلى موقف خاتم استخدام المشابك ووضعه في حمام مائي معايرة إلى 37 درجة مئوية مع صفيحة ضجة لمدة 30-45 دقيقة. بعد قد تم تفرخ الأنسجة لمدة 15 دقيقة، إزالة 50 ميليلتر الوسائط الاحتضان والاختيار بصريا الغدد معزولة. إذا كانت الغدد ليست كثيفة أو قد لا يفصل بين الأنسجة، إجازة 5-10 لكل دقيقة إضافية.
- فور انتهاء الحاضنات، إضافة 50 مل قبل ساخنة DMEM/F12 لاحتضان الوسائط باستخدام ماصة مصلية عقيمة أو بسكب الخليط الحضانة مباشرة.
- تصفية الخليط الغدة من خلال شاش معقم في أربعة أنابيب مخروطية 50 مل. الحفاظ على فيلتراتي على الجليد لمدة 15 دقيقة للسماح الغدد المستخرجة تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية. احرص على عدم الإزعاج في الغدد تمت تسويتها، وإزالة وتجاهل قبالة رأس 40 مل من استخدام طافية ماصة مصلية. ريسوسبيند 10 مل المتبقية في 10 مل دببس وتستكمل مع المضادات الحيوية.
- توزيع الخليط بالتساوي في أنابيب الاختبار ثقافة الخلية 5 مل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز x 65 في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية بعناية باستخدام ماصة. ريسوسبيند بيليه الغدة في مصفوفة المذابة الغشاء باستخدام ماصة أو تلميح ماصة واسعة 200 ميليلتر. المزيج حتى متجانسة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان للقيام بهذه الخطوة على الجليد وتجنب البلمرة مصفوفة الغشاء بينما خلط. بالإضافة إلى ذلك، من المهم فحص كثافة الغدة بصريا بأخذ العينات على 50 ميليلتر. وتبلغ الكثافة المثلى كونفلوينسي ~ 70%. - وبعد ذلك، لوحة الغدد في 50 ميليلتر من الغشاء مصفوفة باستخدام ماصة واسعة ذات الرؤوس. تجنب إصدار أي فقاعات أثناء الطلاء.
- للسماح لمصفوفة الغشاء بلمرة، واحتضان لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إذا كان الطلاء في لوحة ثقافة 12-جيدا، أضف 1 مل من هفجو وسائل الإعلام (تم التعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة "دولبيكو متقدمة" وتستكمل مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، الامفوتريسين ب 0.25 مغ/مل 10 ملغ/مل الجنتاميسين، 50 ملغ/مل كاناميسين، 10 مم حبيس المخزن المؤقت، 1 مم ن-أكتييلسيستيني، 1 x 1 x B27، 50% مكيفة Wnt المتوسطة، 20% R-سبوندين-مكيفة المتوسطة وتستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر العظام مثبط البروتين مورفوجينيتيك، 1 نانومتر جاسترين، 50 نانوغرام/مل "عامل نمو البشرة"، 200 نانوغرام/مليلتر عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 10، 10 N2، مم نيكوتيناميد، و 10 ميكرون روك Y-27632 المانع) كل بئر. إذا لم يكن استخدام لوحة ثقافة 12-جيدا إضافة وسائط كافية تغرق فقاعة مصفوفة الغشاء.
- ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 خلية هوميديفيد ثقافة حاضنة. تغيير وسائل الإعلام كل 4-5 أيام.
2. إنشاء المستمدة من الماوس 3D المعدة فونديك أورجانويدس
ملاحظة: هذا البروتوكول قد نشرت سابقا 6. ذوبان الغشاء مصفوفة على الجليد وإعداد جميع الكواشف قبل بداية.
- التضحية الفئران باستخدام أسلوب وافقت عليها مؤسسة البحث حيث يتم إجراء البحوث. إزالة المعدة من الماوس وتشريح وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا 6. أغسل في 20 مل الجليد الباردة Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس.
ملاحظة: يتم استخدام الفئران C57BL/6، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع، للثقافات فونديك أورجانويد المعدة. وقد euthanized الفئران باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون تليها اليدوي التفكك عنق الرحم قبل إزالة المعدة. - تجريد طبقة العضلات من المعدة وأي الأوعية الدموية مرئية كما سبق ونشرت 6.
- فصل في النظارة من التجويف فاستخدام شفرة حلاقة عقيمة. قص النظارة باستخدام مقص الجراحية الصغيرة إلى شظايا حوالي 2.0 x 2.0 مم. استخدام الملقط، جمع الشظايا في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على المخزن المؤقت لحضانة يدتا (Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس، 5 ملم يدتا) واحتضان في 4 درجات مئوية عن ح 2 مع الانفعال لطيف.
- في غطاء عقيمة، ترك الأنبوبة المخروطية والشظايا على الجليد لحوالي 5 دقيقة استخدام ماصة لإزالة المخزن المؤقت حضانة قدر ممكن ترك الشظايا التي يمسها. إضافة 5 مل تهز المخزن المؤقت (ز 1 د-السوربيتول، السكروز ز 1.47 في 100 مل Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس) واهتز باليد بقوة بمقدار 2 تسمح بشظايا كبيرة لتسوية ومع التسرع واستخدام ماصة 1000 ف، وإزالة الأجزاء الصغيرة التي لا يزال يتعين تسوية في الطبقة العليا.
- تدور شظايا تمت إزالتها لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 65 س ز.
- مع تجنب فقاعات الهواء، إزالة المادة طافية، ريسوسبيند في مصفوفة الغشاء ويخلط حتى يصبح متجانساً.
- استخدام ماصة نصيحة واسعة لوحة المصفوفة الغشاء في 50 ميليلتر كل بئر واحتضان ثم في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- إضافة ما يكفي من وسائط النمو مفجو (متقدم دولبيكو تعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة وتستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 10 مم "هيبيس المخزن المؤقت"، 1 مم ن-أكتييلسيستيني، 1 x N2، 1 x B27، 50% مكيفة Wnt المتوسطة، 20% R-سبوندين-مكيفة تستكمل مع مثبطات البروتين morphogenetic العظام نانوغرام/مليلتر 100 10 نانومتر جاسترين، 50ng/mL "عامل نمو البشرة"، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية نانوغرام/مل 10 10 و 10 ميكرون روك Y-27632 المانع متوسطة) إلى غمر الفقاعة.
- ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية هوميديفيد ثقافة حاضنة. تغيير وسائل الإعلام كل 4-5 أيام.
3-الكولاجين طلاء لنقل 2D
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم يحدد خلاف ذلك. يبدأ الكولاجين طلاء 24 ساعة قبل نقل أورجانويدس 3D لأحادي الطبقة. الحفاظ على الكولاجين ذيل الفئران على الجليد ومحمية من الضوء. لوحات الكولاجين المغلفة جيدة لمدة تصل إلى أسبوعين. إذا لم تكن تستخدم لوحات المغلفة فورا، التفاف اللوحة في بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية حتى حاجة.
- يضعف الكولاجين ذيل الفئران إلى 50 ميكروغرام/مل باستخدام حمض الخليك مم 20.
- وتغطي بما فيه الكفاية على سطح البئر مع الكولاجين المخفف. لبئر واحدة في لوحة 12-جيدا قياسية، معطف مع حوالي 1 مل الكولاجين. تترك ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة في غطاء عقيمة.
- أغسل مرتين مع 1 مل Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس كل بئر وترك كشفت عن ح 2 في درجة حرارة الغرفة في غطاء عقيمة.
4-الغشاء مصفوفة الطلاء لنقل 2D
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم يحدد خلاف ذلك. يبدأ الغشاء مصفوفة الطلاء ح 2 قبل نقل أورجانويدس 3D لأحادي الطبقة. الاحتفاظ بالمصفوفة الغشاء على الجليد. لوحات المغلفة استخدامها فورا ولا يمكن تخزينها لفترة ممتدة من الوقت.
- تمييع المصفوفة الغشاء في أنبوب مخروطي 15 مل مع مياه الصف ثقافة خلية في 01:10 نسبة. تمييع على الجليد.
- استخدام ماصة إضافة 100 ميليلتر من مصفوفة الغشاء المخفف لكل بئر من صفيحة 12-جيدا القياسية. باستخدام مكشطة خلية، توزيع متساو المصفوفة الغشاء المخفف في جميع أنحاء البئر لمعطف حتى.
- احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
- إزالة المياه المتبقية باستخدام ماصة وجاف في درجة حرارة الغرفة ح 1 قبل نقل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد.
5-نقل m/هفجوس 3D إلى 2D "مونولاييرس الخلايا الظهارية المعدة"
- بعد 3D الماوس أو الإنسان-المستمدة من فجوس قد تم مثقف لمدة 6-7 أيام، وتبدأ بنقل أورجانويدس 3D لأحادي الطبقة 2D.
ملاحظة: لكل بئر أحادي الطبقة المطلوبة من المستحسن استخدام 300 أورجانويدس سليمة أو الخلايا المفردة المتأتية من أورجانويدس 300. من المتوقع في ثقافة قوية للحصول على حوالي 150 أورجانويد/جيدا داخل لوحة 12 ثقافة جيدا. - تأكد من لوحات المغلفة قبل نقل.
ملاحظة: لوحات مصفوفة مغلفة غشاء الطابق السفلي طبقة هلام شفاف، ومع ذلك، لن يكون لوحات الكولاجين مغلفة أي إشارة واضحة للطلاء. - إزاحة فقاعة مصفوفة 3D غشاء الطابق السفلي من اللوحة بشكل مباشر بيبيتينج 1 مل العقيمة Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس في وسط الفقاعة.
- استخدام ماصة، جمع الغشاء أورجانويد ومصفوفة الخليط في أنابيب الاختبار ثقافة الخلية. جمع بنسبة 2 فقاعات مصفوفة الغشاء كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 40 × ز و 4 درجة مئوية.
- باستخدام نظام الشفط، وإزالة المادة طافية وكثير مصفوفة الغشاء ممكن. ريسوسبيند في 4 مل من Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس، وإزالة المادة طافية، وكرر 2-3 مرات. بروتوكول نقل أورجانويد كله، انتقل إلى الخطوة 5.10. تابع إلى الخطوة 5، 7 لبروتوكول تعليق خلية مفردة.
- قبل الحارة الخلية المفرزة الحل إلى 37 درجة مئوية وإضافة 1 مل لكل أنبوبة الاختبار. المزيج بلطف بعكس أنابيب أو بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع ماصة. احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 2 مل من Ca2 +/Mg2 +-حرة دببس مباشرة إلى كل أنبوبة الاختبار.
- استخدام إبرة ز 26 والمحاقن الخليط 2-3 مرات. التحقق بصريا للخلايا المفردة. المحاقن 1-2 مرات أكثر إذا كان لا يزال هناك أورجانويدس أو مجموعات من الخلايا.
- أجهزة الطرد المركزي في 40 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه في 2D فجو وسائل الإعلام (الماوس 2D فجو النمو المتوسطة: تم التعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة "دولبيكو متقدمة" وتستكمل مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 مم البنسلين/ستربتوميسين، 10% مصل العجل الجنين، 10 مم "هيبيس المخزن المؤقت"، 1 x N2، 1 x B27، وتستكمل مع 10 نانومتر جاسترين 50 نانوغرام/مل "عامل نمو البشرة", 1 ميكرومتر TGF-β المانع و 10 ميكرون روك Y-27632 المانع. 2D المتوسطة النمو البشري في فجو: تعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة متقدمة دولبيكو وتستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 10 مم حبيس المخزن المؤقت، 10% "مصل العجل الجنين"، 10 مم نيكوتيناميد، 1 x N2، 1 x B27، وتستكمل مع 50 ملغم/مل كاناميسين، 50 نانوغرام/مل "نمو البشرة" عامل، و 10 ميكرون مثبط روك Y-27632، 1 ميكرومتر TGF-β المانع).
- لوحة تعليق على لوحات المغلفة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية. استبدال وسائط كل 4 أيام أو في وقت سابق إذا كانت وسائل الإعلام يتحول إلى اللون الأصفر. أحادي الطبقة يتطلب حوالي 4 أيام للنموذج.
6-الصفر المقايسة الجرح باستخدام الخلايا الظهارية المعدة 2D مونولاييرس
- باستخدام شفرة حلاقة، الصفر أحادي الطبقة عندما وصلت الثقافة كونفلوينسي 100%.
- فيكس مونولاييرس استخدام فورمالدهايد 3.7% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بيرميبيليزي مع 0.5% غير الأيونية المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كتلة التالية مونولاييرس مع المصل حمار 2% ح 1 في درجة حرارة الغرفة واحتضان مع تمييع 1: 1000 من ح+، ك+-ATPase الابتدائي جسم بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، يغسل مع 0.1% غير الأيونية المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني واحتضان مع تمييع 1: 100 حمار جسم الثانوي الماوس المضادة 488 و 10μg/مل من نواة الخلية هويشت وصمة عار ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- لتحديد الخلايا حفرة المخاطية السطحية في ثقافات أحادي الطبقة 2D المعدة المستمدة من الإنسان، وصمة عار الخلايا التي تحتوي على 20 ميكروغرام/mL من المتقارن فيتك أوروبي أليكس (الدولية). صورة مونولاييرس في مجهر [كنفوكل].
- التقاط صور للجرح كل حاء القليلة الصفر سيتم إعادة ابيثيلياليزي بين 24-48 ح اعتماداً على نوعية أحادي الطبقة والتباين بين المرضى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أورجانويدس مستمدة من الإحضار/جسم الإنسان أو النظارة من أنسجة المعدة الماوس (الشكل 1A). بعد كولاجيناز أو الهضم يدتا المستمدة من الإنسان أو الماوس أنسجة المعدة على التوالي، الغدد جزءا لا يتجزأ في مصفوفة الغشاء ومثقف لمدة 6-7 أيام (الشكل 1A). يوضح الشكل 1 باء تشكيل المستمدة من الإنسان المعدة أورجانويدس (هوفجوس) التي نقلت إلى أحادي الطبقة الظهارية المعدة (حاجم) ثم في الغشاء الدائرة المغلفة بمصفوفة الشرائ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تفاصيل البروتوكول الحالي بإنشاء مونولاييرس طلائي المعدة المستمدة من الإنسان والفأرة التي يمكن استخدامها لفحوصات الصفر-الجرح. البروتوكول يعتمد على مفهوم الخلايا الجذعية المقيمين العزل من الإنسان الأولية (أو الماوس) الأنسجة، وهو بروتوكول تعديل نشرت لأول مرة شلايرمان وآخرون7. على وجه الخصوص، لدينا الأمثل البروتوكول هنا لإنشاء روافد واستقطاب أحادي الطبقة الظهارية المعدة التي تعرب عن الرئيسية الخلية الأنساب التي يمكن العثور عليها داخل ظهارة المعدة في الجسم الحي. إصلاح قرحة المعدة هي ع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (نيدك) 5 منح R01 DK083402-07 (YZ).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وسط النسر / F12 المعدل من Dulbecco المتقدم (الوسائط القاعدية) | تقنيات الحياة | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | الحراري | العلمي SV30010 | |
| الأمفوتريسين B / الجنتاميسين | الحراري العلمي | R01510 | |
| كاناميسين | ثيرمو فيشر | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| مثبط BMP (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-& beta مثبط | Tocris | 2939 | |
| Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> خال من DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| مصل الأبقار الجنيني | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22 & micro ؛ مرشح M | فيشر | 099-720-004 | |
| 37 درجة ؛ C حمام | |||
| كولاجيناز نوع 1 | ورثينجتون | LS004214 | |
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (المناديل الورقية) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 مل قارورة | |||
| 1 بوصة (25 مم) شريط تحريك | |||
| مطاطي حاجز | |||
| شاش | |||
| معقمتحريك لوحة | |||
| حلقة الوقوف | |||
| حلقة حامل المشابك | |||
| طبق بتري | |||
| 18 جم إبر بطول 1.5 | ثيرمو فيشر | 305196 | |
| 20 جم إبر شوكية بطول 3.5 بوصة | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12 بئر لثقافة الخلايا لوحة معالجة | تم تقليل عامل النمو في الغرب الأوسط العلمي | 92012 | |
| ، الفينول الخالي من الأحمر Matrigel < sup>TM < / sup> (مصفوفة الغشاء القاعدي) | Fisher | CB-40230C | |
| شفرات | |||
| ملاقط | |||
| ملقط | |||
| 200 & مايكرو ؛ L أطراف ماصة عريضة | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 مل أنابيب اختبار زراعة الخلايا | فيشر | 14-956-3C | |
| خزان الأكسجين مع خراطيم مطاطية | |||
| 1 جرام D-Sorbitol | |||
| السكروز | فيشر | SS-500 | |
| تشريح المجهر | |||
| صينية | تشريح | ||
| هزاز الطاولة | |||
| ذيل الفئران الكولاجين نوع 1 | تقنيات الحياة | A10483-01 | |
| ثقافة الخلية الصف حمض الخليك الجليدي | فيشر | A38-212 | |
| ثقافة الخلية الصف المياه | Corning | 25-055-CV | |
| 2-بئر غرفة الشريحة | ثيرمو فيشر | 155380 | |
| 12 بئر Transwell (إدراج غشاء البوليستر) | مكشطة خلية Corning | 3460 | |
| Corning | 353086 | ||
| Accutase (محلول انفصال الخلية) | تقنيات الخلايا الجذعية | 7920 | |
| 263/8< / sup> G حقنة | Thermo Fisher | 309625 | |
| شفرة | |||
| L الخلايا | تم استلام الخلايا L ، وهي خط خلوي ينتج Wnt3a ، كهدية من الدكتور هانز كليفرز (معهد هوبريشت لبيولوجيا النمو وأبحاث الخلايا الجذعية ، هولندا). | N / A | |
| HEK-293T Rspondin تفرز | الخلايا تم الحصول على خط خلوي معدل HEK-293T R-spondin يفرز من الدكتور جيف ويتسيت (قسم طب الأطفال حديثي الولادة وبيولوجيا الفترة المحيطة بالولادة والرئة ، والمركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال وكلية الطب بجامعة سينسيناتي ، سينسيناتي ، الولايات المتحدة الأمريكية). | N / A | |
| HK-ATPase الجسم المضاد الأساسي | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 الجسم المضاد الثانوي (الحمار المضاد للفأر 488 الجسم المضاد الثانوي) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
المراجع
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663(2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
