طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر التي تلت المستشفى تصريف^1،2،،من^34،،من⁵⁶. وفي معظم الحالات، تحدث الوفاة بنوع من الفشل نهاية الجهاز بما في ذلك الكلي، الرئة، القلب، أو أحداث الكبد، فضلا عن السكتة الدماغية^5،6. والسبب في ارتفاع معدل الوفيات في هذا المريض السكان أنشأ ابدأ.

ويصنف الالتهاب الرئوي أما يجري اكتسب المجتمع أو المكتسبة في المستشفى (المستشفيات)، والعوامل التي يمكن أن تسبب الالتهاب الرئوي وتشمل البكتيريا والفيروسات والفطريات والمواد الكيميائية. واحد من الأسباب الرئيسية لالتهاب رئوي المستشفوي هو بكتيريا الزائفة الزّنجاريّة. P. الزّنجاريّة هو كائن الغرام الذي يستخدم نظام إفراز نوع الثالث لنقل مختلف الجزيئات المستجيب، يسمى اكسونزيميس، مباشرة إلى السيتوبلازم للخلايا الهدف^7،8. خلال عدوى خلايا غشائي الرئة، اكسونزيميس استهداف مختلف البروتينات داخل الخلايا، بما في ذلك شكل من أشكال بطانية من البروتينات المرتبطة microtubule تاو^{9،10،11،12} ، مما أدى إلى انهيار حاجز غشائي الناتجة في ذمة رئوية حادة، انخفضت وظائف الرئتين، وفي كثير من الأحيان، الموت.

وكما ذكر سابقا، المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي الأولى يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر ال 12 الأولى بعد التخريج من المستشفى. إليه ممكنة لتفسير هذه الظاهرة هو أن يتم إنشاء نوع من السمية طويلة الأمد خلال العدوى الأولية التي تؤدي إلى سوء نتائج طويلة الأجل. ملاحظتان تدعم هذه الإمكانية. تفشل خلايا غشائي الرئة أولاً، مثقف التي تعامل في البداية مع P. الزّنجاريّة تنتشر لتصل إلى أسبوع بعد قتل البكتيريا بالمضادات الحيوية من¹³. ثبت البريونات ثانيا، المعمرة والوكلاء مع الخصائص بريون في مختلف الأمراض البشرية والحيوانية، لا سيما الأمراض المرتبطة بال^14،العصبي¹⁵.

وقد وصف أساليب لدراسة إمكانية إنتاج العوامل السامة للخلايا المعمرة خلال العدوى الرئوية ابدأ. ويرد هنا سلسلة من فحوصات بسيطة في المختبر التي يمكن استخدامها للتحقيق في إنتاج سيتوتوكسين والنشاط بعد الإصابة باستخدام مشتركة الالتهاب رئوي تسبب عامل, P. الزّنجاريّة. ينبغي أن تكون هذه الاختبارات القابلة للتكييف وفقا للتحقيق التعريفي سيتوتوكسين ممكن بعد الإصابة باستخدام العوامل الأخرى التي تسبب الالتهاب الرئوي، وسوبيرناتانتس التي يتم إنشاؤها أيضا ينبغي أن تكون مفيدة للتحقيق في آثار سيتوتوكسينس في الجامعة الأجهزة أو الحيوانات. أخيرا، سوف تكون الاختبارات التي ترد هنا على الأرجح قابلة للتكيف لاختبار السوائل البيولوجية الحيوانية والبشرية لإنتاج cytotoxins أثناء الالتهاب الرئوي.

واستعرضت جميع الإجراءات الحيوان ووافق المؤسسية ولجنة العناية بالحيوان من جامعة ألاباما جنوب وأجريت وفقا لجميع اللوائح الاتحادية والولائية والمحلية. تم الحصول على الثقافات الأولية من الفئران خلايا بطانية ميكروفاسكولار الرئوية (بمفيكس) من "مرفق خلية الثقافة الأساسية" في مركز جامعة ألاباما جنوب "البيولوجيا الرئة". وتم إعداد الخلايا استخدام الإجراءات الموصوفة سابقا¹⁶.

1-جيل سوبيرناتانتس السامة للخلايا

ملاحظة: هنا، يمكننا استخدام اثنين من سلالات مختلفة من P. الزّنجاريّة: PA103، الذي يحتوي على نوع سليمة الثالث إفراز نظام قادر على نقل اكسونزيميس أكسو، وعزة إلى الخلايا المستهدفة خلال العدوى، و ∆PcrV، الذي يفتقر إلى نوع نظام إفراز الثالث وهو غير قادر على نقل اكسونزيميس إلى خلايا الهدف بعد التطعيم.

1. متتالية البكتيريا على لوحات أجار بونر فوغل (VB)¹⁷ وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
   1. لإعداد لوحات، جعل حل الأسهم التالية (أملاح بونر فوجل؛ الأسهم x 10): قياس ز 2 MgSO₄، ز 20 حمض الستريك (حمض الحرة)، 100 غ ك₂بو₄و 35 ز نة₂بو₄. إضافة ddH₂س 1 لتر والاوتوكلاف لمدة 15 دقيقة مع العادم بطيئة.
   2. ضع أجار ز 7.5 في 450 مل ddH₂س والاوتوكلاف المذكورة أعلاه.
   3. بعد التعقيم، ضع كل الحلول في حمام مائي 50 درجة مئوية لتبرد.
   4. إضافة 50 مل من محلول الملح الأسهم 10 في x VB لاجار.
   5. إضافة كاربينيسيلين إلى 400 ميكروغرام/مل (للسلالات من P. الزّنجاريّة المستخدمة)، ومزيج جيد من قبل يحوم في قارورة.
   6. مل 5 مكان الحل أجار VB في الأطباق الفردية الثقافة العقيمة، والسماح لاجار لترسيخ وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية حتى اليوم من البذر البكتيرية.
   7. في يوم البذر البكتيرية، قبل الحارة صفيحة إلى 37 درجة مئوية ومتتالية ثم البكتيريا على لوح استخدام حلقة عقيمة. مكان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2. التحقق من النقاء بمفيك تلطيخ إيجابية مع نيون سيمبليسيفوليا جريفونيا يكتين وتلطيخ السلبية مع نيون بوماتيا اللولب يكتين (علامة لخلايا بطانية الشرياني). خلايا الكوة والتجميد في النيتروجين السائل.
3. للتجارب، والحفاظ على الخلايا في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، وتنمو خلايا في حاضنة 37 درجة مئوية التي تحتوي على 5% CO₂. استخدام الخلايا في الفقرات 5-15.
   1. لجيل سوبيرناتانتس السامة للخلايا، لوحة 2 × 10⁶ خلايا في الأطباق الفردية 150 سم وتنمو لمدة 3-4 أيام حتى يتم تحقيق التقاء. استخدام لوحات اثنين كل تجربة (انظر أدناه).
   2. لتحليل سوبيرناتانتس السامة للخلايا، طبق بلايت 1 × 10⁵ خلايا في الآبار الفردية من 6-بئر وتنمو لمدة أربعة أيام حتى يتم تحقيق التقاء.
4. لإنتاج المادة طافية، يغسل واحدة من أطباق سم 150 اثنين من بمفيكس من الخطوة 1.3.1 مع الفوسفات مخزنة المالحة، تريبسينيزي، وثم عد الخلايا (نحن استخدام عداد الآلي خلية واتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة؛ انظر الجدول للمواد). أغسل الطبق الأخرى من بمفيكس مع موازنة الملح الحل (حبس هانك) وتصيب ثم مع أما سلالة من P. الزّنجاريّة في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 20:1. ويتحقق ذلك على النحو التالي:
   1. P. الزّنجاريّة، التطوير التنظيمي₅₄₀ 0.25 = 2 × 10⁸ كفوس مليلتر. لإعداد هذا التخفيف، إضافة 1 مل حبس إلى 1 مل ومبومو المتاح. تتخلص من البكتيريا كافية الخروج من اللوحة التي أعدت في الخطوة 1، 1 حتى يتم تحقيق التطوير التنظيمي₅₄₀ من 0.25 عندما تقاس باستخدام جهاز المطياف الضوئي. الخطوة التالية سوف توفر حساب كم ستكون هناك حاجة البكتيريا.
   2. حالما يتم تحديد العدد بمفيكس في الطبق الثقافة (الخطوة 1، 4 أعلاه)، تحديد العدد المناسب من البكتيريا المراد إضافتها إلى الطبق الثاني، غير تريبسينيزيد والثقافة التي تحتوي على بمفيكس. على سبيل المثال، إذا ما تقرر أن طبق الثقافة بمفيكس تحتوي على 1.3 × 10⁷ الخلايا، ثم إعداد 1.3 × 10⁷ خلايا x 20 البكتيريا/خلية x 1 مل/2 × 10⁸ كفوس = 1.3 مل البكتيريا.
   3. تمييع مل 1.3 من البكتيريا إلى حبس لوحدة تخزين نهائي من 20 مل، حيث أن كامل سطح صحن 150 سم يمكن تغطيتها بسائل، ثم إضافة البكتيريا المخفف اللوحة بمفيكس.
   4. احتضان بمفيكس تلقيح مع البكتيريا في 37 درجة مئوية في 5% CO₂ حاضنة ح 4-5، حتى يمكن رؤية الثغرات تشكيل في أحادي الطبقة الخلية عندما يلاحظ اللوحة مجهريا (انظر الشكل 1 للمستوى المناسب لتكوين الفجوة).
   5. جمع المادة طافية، ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2,000 ز العاشر في أجهزة الطرد مركزي منضدية لإزالة الحطام الخلوية.
      ملاحظة: أي قادرة على توليد ز كافية للطرد المركزي الجدول أعلى قوة لبيليه أونليسيد الخلايا والخلايا الكبيرة الشظايا التي يمكن استخدامها لهذه الخطوة.
   6. من أجل المادة طافية في محقن يحتوي على فلتر 0.2 ميكرون يعلق على نهايته، ثم تمرير المادة طافية من خلال عامل التصفية لإزالة البكتيريا.
   7. استخدام قاسمة من المادة طافية العقيمة لاختبار سيتوتوكسيسيتي (انظر 2.1) وتجميد بقية المادة طافية في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

2-تحليل سوبيرناتانتس السامة للخلايا

1. تحليل سيتوتوكسيسيتي
   1. النمو بمفيكس في أطباق 6-جيدا حتى التقاء. آبار المياه والصرف الصحي مرة واحدة مع حبس، ثم إضافة 1.5 مل من المادة طافية تعقيم التصفية (التي تم جمعها من الخلايا أما طعمت PA103 أو ∆PcrV) إلى الآبار الفردية. إضافة حبس العقيمة إلى بئر أخرى كعنصر سلبي.
   2. ضع اللوحة في حاضنة₂ CO ح 21-24، ثم مراقبة للخلية قتل/سيتوتوكسيسيتي (انظر الخطوة التالية). استخدام سوبيرناتانتس الذي يحمل سيتوتوكسيسيتي لمزيد من التجريب، وتجاهل تلك التي لا تظهر قتل الخلية.
   3. كوانتيتيشن لقتل الخلايا
      1. وأوصى قياس لاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) الإصدار من الخلايا الميتة باستخدام "مجموعات المقايسة رابطة حقوق الإنسان" متاحة تجارياً والشركة المصنعة للإجراءات.
      2. وبدلاً من ذلك، التحديد الكمي لقتل الخلايا مجهريا باستخدام البرمجيات إيماجيج. لذلك، سجل الصور المجهرية ومجالات الثقافة الطبق الذي يحتوي على خلايا سليمة، ثم تحديد حجم المناطق التي تفتقر إلى الخلايا (يدل على موت الخلايا في أحادي الطبقة) باستخدام ماكرو إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة) مخصص (انظر "ملف الترميز التكميلية" ). إذا رغبت في ذلك، القيام بالخطوات الماكرو يدوياً كما يلي:
         1. إدخال الصور (تنسيق RGB أو Tiff) في الماكرو وضبط التباين إلى 15 ٪ المشبعة بكسل. تكرار الصور ضبط التباين وقم بتنفيذ الأمر "طرح الخلفية" للحصول على صورة عالية التباين للمنطقة كل من الخلية والفجوة داخل مجال الرؤية.
         2. طرح هذه الصورة من الصورة الأصلية، والجمع بين الصورة الناتجة مع الصورة الأصلية باستخدام الحاسبة الصورة الدالة "AND". تحويل الصورة الناتجة إلى الأسود (الثغرات) وقناع أبيض (الخلايا) باستخدام الدالة عتبة (الحد الأدنى 0, 5 كحد أقصى)، واستخدام الدالة "تآكل ثنائي" لإزالة الضجيج من الصورة.
         3. قياس النسبة الأسود إلى الأبيض بكسل داخل الصورة الناتجة باستخدام قياس "منطقة الكسر". الأرض والتعبير عن المجالات كسرى لكل نقطة وقت المعالجة في المئة من مساحة الفجوة القصوى.
         4. حساب الوسائل ومقارنة استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار توكي للمخصص بعد، مع قيم p أقل من 0.05 تعتبر هامة.
   4. استخدام تحليل إيمونوبلوت لإثبات وجود اميلويد وتأو oligomeric Aβ في supernatants ثقافة. إجراء تحليل إيمونوبلوت باستخدام إجراءات معيارية^10،11،12، باستثناء التركيز supernatants ثقافة الوقت على الأقل قبل التفريد.
      1. تركيز المادة طافية، ضع 1-2 مل من المادة طافية في وحدة الطرد المركزي تصفية الأغشية التي قد وقف وزن الجزيئي كاتشين 10. ثم، ضع وحدة التصفية إلى الجدول أعلى أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في العاشر 2,000 حقق ز حتى الدرجة المطلوبة من التركيز (عادة ما تكون 45-60 دقيقة).
      2. تحديد كمية البروتين في طافية تتركز¹¹ وتحميل كميات متساوية من العينات في الآبار الفردية من الجل.
      3. تشغيل المواد الهلامية، ونقل البروتينات إلى النيتروسليلوز، ثم التحقيق البقع مع A11 اميلويد المضادة الأجسام المضادة، T22 تاو oligomeric المضادة الأجسام المضادة، أو جسم Aβ مكافحة MOAB2 تليها الأجسام المضادة الثانوية المناسبة. وضع البقع استخدام الإجراءات القياسية تشيميلومينيسسينسي.
   5. القيام به ثيوفلافين "ر المقايسة"، استخدام الفلورية ثيوفلافين تي (تي إتش تي) لقياس أميلويدس في سوبيرناتانتس. لهذه القياسات، استخدام تصفية تعقيم سوبيرناتانتس.
      1. إعداد حل أسهم (50 س) ثيوفلافين ر تعليق 8 ملغ ثيوفلافين تي (تي إتش تي) إلى 10 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). بعد خلط، تصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات.
      2. للقياسات، إضافة 20 ميليلتر من مخزون تي إتش تي إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني في ومبومو جهاز المطياف الضوئي 1 مل. ضع العينة المخففة في سبيكتروفلوريميتير.
      3. قياس انبعاثات خط الأساس fluorescence استخدام 425 نانومتر الإثارة ومسح انبعاث الأسفار من شمال البحر الأبيض المتوسط 450-575 2 نانومتر زيادات.
      4. إجراء فحص الوقت الفاصل بين استخدام 425 نانومتر الإثارة واكتسب 482 نانومتر الانبعاثات، مع بيانات كل 0.2 s ل 60 ثانية.
      5. 20 الأولى s للمسح الضوئي الوقت الفاصل بين التدابير fluorescence في ومبومو فارغة. في 20 s، إيقاف المسح الضوئي، وإضافة 10 ميليلتر من المادة طافية تعقيم عامل التصفية إلى ومبومو. مزيج ومبومو واسطة انعكاس ومن ثم ضع مرة أخرى إلى سبيكتروفلوريميتير.
      6. استئناف المسح الضوئي المستندة إلى الوقت، الحصول على 40 نهائي دا بيانات.
      7. عند الانتهاء من المسح الضوئي الوقت الفاصل، إجراء فحص طيف انبعاث fluorescence نهائي باستخدام إعدادات متطابقة، كما هو مفصل في 2.1.5.3.

وقد وضعت مقايسة بسيطة في المختبر الاعتداء على وجود سيتوتوكسينس في supernatants الخلايا المصابة ببكتيريا P. الزّنجاريّة. أساسا، تجمع الثقافة المتوسطة من الخلايا المصابة ح 4 بعد إضافة البكتيرية، تتم إزالة البكتيريا بالتعقيم تصفية الثقافة طافية، وثم يتم إضافة المادة طافية العقيمة لعدد جديد من الخلايا. ثم يلاحظ الخلايا ح 21-24 بعد إضافة المادة طافية وقتل الخلية هو كمياً.

من P. الزّنجاريّة ، بالإضافة إلى طبقات متموجة من بمفيكس الحث على تكوين الفجوات بين الخلايا. و في فيفو، تشكيل فجوة يؤدي إلى وذمة الرئة وانخفاض وظائف الرئة. في وصف المقايسة، يستخدم تكوين الفجوة كما هو مشار إليه الوقت النقطة للفحص لإطلاق سيتوتوكسين في supernatants ثقافة الخلية ومدة تكفي للحضانة مع PA103 بوجود الثغرات التي تبدأ بشكل أحادي الطبقة خلية كما هو موضح في الشكل 1. حمل البكتيريا ΔPcrV لا فجوات الخلية في ظل هذه الظروف الحضانة. وبمجرد اكتشاف الثغرات، المادة طافية من جمعها وتعقيمها والتصفية وثم تضاف إلى السذاجة بمفيكس لتقييم نشاط السامة للخلايا. بمفيكس في سوبيرناتانتس كل منها على ثم يتم وضعها في حاضنة ح 21-24، ثم لاحظ وتصويرها. كما هو مبين في الشكل 2، الواردة المادة طافية المجمعة من بمفيكس التي قد أصيبوا بالعدوى بسلالة P. الزّنجاريّة PA103 سيتوتوكسينس التي تحدثها موت الخلايا المستزرعة ح 21 بعد إضافة المادة طافية. على النقيض من ذلك، لم يلاحظ أي موت الخلية في مراقبة الخلايا تعامل مع أما المتوسطة حبس أو مع المادة طافية جمعت من سلالة ΔPcrV من Pseudomonas. تحليل Immunoblot أثبت أن جزيئات اميلويد، بما في ذلك أوليجوميريك تاو و Aβ، يتم إنشاؤها أثناء الإصابة بسلالة PA103، بينما لا أميلويدس يتم إنشاؤها بواسطة سلالة ΔPcrV عقب تطعيم بمفيكس (الشكل 2). أكدت إيمونوديبليشن أميلويدس من المادة طافية قبل إضافة إلى الخلايا المستزرعة12دور أميلويدس بوصفها سيتوتوكسينس في هذا التحليل. على الرغم من أن لا يظهر هنا، إيمونوديبليشن من المادة السامة للخلايا طافية استخدام A11 اميلويد المضادة الأجسام المضادة وجسم أوليجومير تاو المضادة T22 تماما يستنزف نشاط السامة للخلايا من سوبيرناتانتس المنتجة في أعقاب الإصابة PA103 (بالكزون et al. عام 2017 12 وبالكزون et al.، في إعداد).

وقد وضعت طريقة مبتكرة وغير مكلفة وبسيطة للتحديد الكمي لقتل الخلية. لهذا التحليل، تم تكييف للسماح للقياس المباشر للمناطق في حقل مجهرية التي تفتقر إلى الخلايا (يدل على قتل الخلية) البرمجيات إيماجيج. تم التحقق من موثوقية هذا الأسلوب من المقارنة المباشرة بطريقة راسخة لقياس الخلية قتل، والإفراج عن رابطة حقوق الإنسان من الخلايا. كما هو موضح في الشكل 3، يمكن استخدام البرمجيات إيماجيج لتحويل مناطق حقل المجهرية التي تحتوي على خلايا للأبيض والمناطق التي تفتقر إلى الخلايا إلى الأسود. بعد ذلك، يمكن استخدام نسبة بسيطة من المساحات البيضاء إلى اللون الأسود لقياس قتل الخلية. عندما بدءاً أحادي الطبقة المتلاقية للخلايا، جميع المناطق في الحقل المجهري هم من البيض. ومع ذلك، قبل 18 ساعة بعد إضافة سوبيرناتانتس التي تحتوي على سيتوتوكسينس، يمكن اكتشاف الثغرات في أحادي الطبقة. مقدار المساحة للطبق ثقافة خالية من الخلايا ثم زادت بطريقة خطية حتى بعد إضافة المادة السامة للخلايا طافية ح 36. عند قياس الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان، وقد تحققت نتائج متطابقة، مع رابطة حقوق الإنسان الإفراج يتم اكتشافه لأول مرة في ح 18 بعد إضافة المادة السامة للخلايا طافية. ثم زادت الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان بطريقة خطية حتى تم قياس قتل الخلية القصوى في 36 ساعة بعد إضافة المادة طافية. وتم قياس القليل من موت الخلية في الخلايا تعامل مع المادة طافية جمعت من ΔPcrV تلقيح الخلايا (الشكل 3)، أو في الثقافات التي تعامل مع حبس ح 36.

يمكن قياس مقدار اميلويد أطلق سراحهم من الخلايا تعامل مع البكتيريا بقياس الأسفار تي إتش تي. الأسباب ملزمة أميلويدس تي إتش تي تحولاً كونفورماشونال في الجزيء وزيادة كثافة الأسفار. لهذا التحليل، يضاف إلى ومبومو ثيوفلافين ر والأسفار الأساس يقاس. ثم تم إيقاف تسجيل الأسفار بينما يتم إضافة قاسمة صغيرة من العينة. ومبومو ثم يتم إرجاعها إلى فلوريميتير والتغيير يتم تسجيل الانبعاثات الأسفار. كما هو موضح في الشكل 4، جمعت المادة طافية من الخلايا التي تم المحتضنة مع سلالة PA103 من اميلويد P. الزّنجاريّة الواردة كما يتضح من الزيادة في الانبعاثات الأسفار. على النقيض من ذلك، تفتقر المادة طافية من تلقيح مع سلالة ΔPcrV بمفيكس أميلويدس، كما يتبين من عدم وجود زيادة الأسفار.

الشكل 1. آثار إينولكوليشن P. الزّنجاريّة على مورفولوجيا بمفيك. أحادي الطبقة المتلاقية من بمفيكس قبل (أ) وبعد الإضافة (ب) من سلالة PA103 من P. الزّنجاريّةأربع ساعات. ثغرات يمكن أن يمكن رؤيتها بوضوح في المونولاير الخلية في الخلايا المصابة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2. تحليل سوبيرناتانتس السامة للخلايا- الجزء [I]. صور الممثل للتحكم والخلايا المعالجة. تم علاج بمفيكس ح 21 مع المادة طافية التي تم الحصول عليها من خلايا تلقيح مع أما PA103 البكتيريا (ب) أو سلالة ΔPcrV (ج). كما كانت المحتضنة خلايا المراقبة ح 21 مع حبس المخزن المؤقت (A). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. جزء [II]. إيمونوبلوتس الممثل من supernatants جمعها من ΔPcrV (A) أو PA103 (ب) إصابة بمفيكس. وقد سبر البقع مع الأجسام المضادة ضد اميلويد (A11) أو تاو oligomeric (T22). Mr في كاتشين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. كوانتيتيشن لقتل الخلية. (أ) حقول مجهر الممثل من نقاط زمنية مختلفة (في ح بعد إضافة طافية) في المناطق التي للحقل الذي يحتوي على تفتقر خلايا تم تحويل وأما أبيض أو أسود، على التوالي، استخدام البرمجيات إيماجيج. نفس المرحلة تباين الصورة قبل التحويل يرد أيضا. بار = 100 ميكرومتر- (ب) مقارنة كوانتيتيشن خلية القتل باستخدام القياسية رابطة حقوق الإنسان الإفراج عن الفحص والتحليل إيماجيج. N = 4، * *ف < 0.05، * * *ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4. البيانات المقايسة fluorescence الممثل تي إتش تي- كانت متحمس الترعة الفارغة التي تحتوي على تي إتش تي في 425 نانومتر والانبعاثات ثم تم قياس fluorescence في 482 شمال البحر الأبيض المتوسط. جمعت fluorescence الخلفية عن 20 ثانية، ومن ثم المادة طافية من أما PA103-أو ΔPcrV-تلقيح بمفيكس أضيفت إلى الترعة. ثم سجلت الانبعاثات الأسفار لمدة 40 ثانية.

لا شيء للتقرير.