يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

12.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57460

⸱

أكتوبر 9, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Crown Bioscience Inc., 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ويهدف الإجراء التجريبي في إيمونوفينوتيبينج هوموجرافتس بدك أورثوتوبيك مورين التنميط وورم المكروية-المناعية. الأورام أورثوتوبيكالي مزروع عن طريق الجراحة. أورام من 200 – 600 مم3 في حجم حصاد وفصلها بإعداد تعليق خلية واحدة، متبوعاً بعلامة متعددة محصنة ضد نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل باستخدام الأجسام المضادة المختلفة المسمى فلوريسسينتلي.

الملخص

الأورام هوموجرافت (سينجينيك) هي العمود الفقري للبحوث السريرية المناعية-الأورام (الإدخال/الإخراج) اليوم. وورم المكروية (TME)، وبخاصة جهاز المناعة-مكوناته، أمر حيوي للتكهن والتنبؤ بنتائج العلاج، لا سيما تلك التي المناعي. TME المناعة-مكونات تتألف من مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية التسلل إلى الورم قابلاً بنظام مراقبة الأصول الميدانية متعدد الألوان. البنكرياس الأقنية غدية (بدك) من بين ماليجنانسيس الأكثر دموية التي تفتقر إلى خيارات العلاج الجيد، وبالتالي حاجة طبية ملحة والتي لم تلب بعد. وكان أحد الأسباب الهامة لعدم استجابته للعلاجات المختلفة (الكيماوي-، استهدفت، الإدخال/الإخراج) به TME وفيرة، تتكون من الخلايا الليفية والكريات البيضاء التي تحمي الخلايا السرطانية من هذه العلاجات. أورثوتوبيكالي بداك مزروع ويعتقد أن أكثر دقة استعادة TME سرطان البنكرياس البشرية من النماذج التقليدية (SC) تحت الجلد.

الأورام هوموجرافت (KPC) يتم زرع بالماوس عفوية بداك تنشأ من مؤسسة البترول الكويتية-الفئران المهندسة وراثيا (rasكG12D/+//Pdx1-53-/-فجإعادة) (الفيلق-جيمم). الأنسجة الورم الرئيسي هو مقطعة إلى أجزاء صغيرة (~ 2 مم3) وزرعها تحت الجلد (SC) إلى المستلمين سينجينيك (C57BL/6، 7 – 9 أسابيع من العمر). هوموجرافتس كانت في ذلك الحين جراحيا أورثوتوبيكالي زرعها على بنكرياس الفئران C57BL/6 الجديدة، جنبا إلى جنب مع اتفاقية استكهولم-غرس، الذي بلغ حجم الورم 300 – 1,000 ملم3 قبل 17 يوما. تحصد كل إجراء تشريح الجثة المعتمدة فقط من الأورام من 400 – 600 ملم3 وتنظيف لإزالة أنسجة الورم غير متجاورة. أنها تم فصلها كل بروتوكول استخدام ديسوسياتور أنسجة في تعليق خلية واحدة، تليها تلطيخ مع فريقي المعين المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة لعلامات مختلفة للخلايا المناعية المختلفة (اللمفاوية، النقوي ومن ناغورني كاراباخ، وحدات تحكم المجال Dc). تم تحليل عينات ملطخة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية متعدد الألوان لتحديد عدد الخلايا المناعية الأنساب المختلفة، فضلا عن النسبة المئوية النسبية داخل الأورام. ثم قورنت لمحات محصنة من الأورام أورثوتوبيك لتلك الأورام اتفاقية استكهولم. أظهرت البيانات الأولية تيلس/تامس المتسللة مرتفعة إلى حد كبير في أورام البنكرياس، وأعلى ب-خلية تسلل إلى أورثوتوبيك بدلاً من الأورام اتفاقية استكهولم.

المقدمة

أسباب غدية البنكرياس الأقنية (بدك) ما يقرب من نصف مليون حالة وفاة على نطاق عالم سنوياً، واحد من القتلة السرطان أعلى 5. وهناك عدد قليل من الخيارات العلاج الفعال ولا إيمونوثيرابيس المعتمدة؛ ولذلك، تمس الحاجة إليها العلاجات الجديدة. تحظى باعتراف سرطانات متزايد كالأمراض المناعية، بما في ذلك بدك، بالإضافة إلى الأمراض الوراثية المعروفة اليوم. سوف المحتمل أن تحدد العوامل المناعية والوراثية تشخيص المرض، فضلا عن معالجة النتائج. أورام التهرب من مراقبة المضيف المناعية والمضي قدما في نهاية المطاف للتسبب في الموت. تحدث العديد من هذه العمليات المناعية داخل ورم المكروية (TME)1،2،،من34 حيث أنواع مختلفة من الخلايا المناعية تتفاعل مع الخلايا السرطانية، مع بعضها البعض ومع غيرها الورم مكونات stromal، مباشرة أو غير مباشرة عن طريق السيتوكينات التي تحدد في نهاية المطاف نتيجة المرض. ولذلك توصيف مكونات الورم المناعي TME، أو الورم إيمونوفينوتيبينج، بما في ذلك subtyping، والعد، وتعريب الأنساب مختلفة من الخلايا المناعية، أمر بالغ الأهمية لفهم الحصانة المضادة للورم. وفي حالة بدك، فقد اقترح أن مرتفعة الضامة القمعية التسلل إلى الورم (TAM) والخلايا البائية أدت إلى منع تسلل خلايا T و/أو التنشيط، ومستويات عالية من التليف5،6.

نهج مشترك للتحقيق تميس المناعي تجريبيا باستخدام مركب الأورام السريري نماذج حيوانية، والورم الماوس ذات الصلة أساسا نماذج7، لا سيما الماوس سينجينيك (هوموجرافت) أو نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمم) من أمراض السرطان، في تشابه المفترضة للماوس والإنسان للأورام وحصانة8،9. ومن المفهوم في الواقع أن هناك اختلافات المتأصلة بين نوعين من أنواع10،11.

أورام الماوس زرع لها مزايا تشغيلية كبيرة أكثر أورام عفوية7، إلا وهي التنمية الورم متزامنة، على النقيض من وضع الورم عفوية جيم الأبوية. تعتبر هوموجرافتس أورام مورين عفوية الأورام الأولية وجود قط التلاعب في المختبر، والنسخ المتطابق الأصلي الماوس الورم histo-/الجزيئية الباثولوجيا7، فضلا عن ملامح محصنة ممكن. وكثيراً ما تعتبر هذه هوموجرافتس مورين "إصدار ماوس من تكثيفها المستمدة من المريض (بدكسس)". ولذلك لديهم احتمالاً طواعية أفضل من الخلية سينجينيك التقليدية المستمدة من خط الماوس الأورام12. على وجه الخصوص، هوموجرافتس كثيرة مستمدة من جيم محددة حيث تم تصميم آليات محددة من الأمراض البشرية، مثل الطفرات النمطان السائق، ولذلك ينبغي أن هوموجرافتس هذه المزايا لأهميتها السريرية. على وجه الخصوص، جيم فيلق حماية كوسوفو وضع الماوس بدك ضمن 15 – 20 أسبوعا عمر، الذي يلخص شكلياً الأمراض البشرية مع بنية غدي جيدا-باعتدال-متباينة يغلب عليها الطابع والتخصيب سدى. ويجمل هذا النموذج أيضا السمات الوراثية الأكثر شيوعاً للبشرية بداك، هما كراس تفعيل P53 الخسارة من وظيفة، والطفرات التي تحدث في 90% و 75% من البشرية بداك، على التوالي5،6.

مواقع لزرع الأعضاء اقترح أيضا أن تلعب دوراً في نموذج طواعية. البيئة الأنسجة المحيطة محددة، مثل بيئة أورثوتوبيك مقابلة، يمكن أن تكون مكاناً للأورام المحددة إلى البيئات التقدم، بدلاً من موحدة تحت الجلد (SC) للأورام شيوعاً زرع. وسيكون من مصلحة خاصة إذا، و/أو، ما هو الفرق القائم بين موقعين الزرع، من حيث المناعة-المكروية، وأهمية بالنسبة للسرطان البشري، على سبيل المثال. وفي حالة بدك.

أحد الجوانب الأكثر أهمية للتنميط المناعي، أو إيمونوفينوتيبينج، تحديد التسلل إلى ورم الخلايا المناعية الأنساب المختلفة، الأرقام، النسبة المئوية النسبية داخل الأورام، فضلا عن تفعيل الدول والمواقع. وهذا يشمل ليمفوكتييس ورم-إينفيلتراتراتينج (تيلس، سواء من تي-وب-)، التسلل إلى الورم الضامة (تامس) والتسلل إلى ورم الخلايا القاتلة الطبيعية (NKs) والورم المقيم الجذعية الخلايا3،،من1314 , 15 , 16 , 17، والتعريب سوبسيلولار بعض الخلايا18،،من1920، إلخ. الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو التدفق الخلوي هو تقنية الكشف عن خلية واحدة يستخدم عادة لقياس بارامترات خلية محددة. متعدد الألوان التدفق الخلوي تدابير عدة علامات على4،3،خلية مفردة21 وهو الأسلوب الأكثر شيوعاً لتحديد النسبة المئوية النسبية لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية، والأرقام بما في ذلك داخل الأورام.

ويصف هذا التقرير إجراءات للتنميط التسلل إلى ورم الخلايا المناعية: 1) غرس أورثوتوبيك بدك الماوس الورم هوموجرافتس، جنبا إلى جنب مع غرس اتفاقية استكهولم؛ 2) ورم الأنسجة الحصاد وإعداد خلية مفردة عبر الورم الانفصال؛ 3) التدفق الخلوي تحليل كافة الخلايا المستمدة من الأورام كخط أساس؛ 4) مقارنة بين الملامح الأساس لكلا النهجين الزرع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

سوف استعرض جميع البروتوكولات وتعديل أو إجراءات تنطوي على الرعاية واستخدام الحيوانات ووافق "التاج العلوم البيولوجية المؤسسية رعاية الحيوانات" واستخدام اللجنة (إياكوك) قبل إجراء الدراسات. رعاية واستخدام الحيوانات عادة ستجري وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية آآلاك (رابطة لتقييم واعتماد رعاية الحيوانات المختبرية) كما ورد في الدليل لرعاية واستخدام مختبر الحيوانات، والبحوث الوطنية مجلس (2011). جميع الإجراءات التجريبية الحيوانية ستكون تحت ظروف معقمة في مرافق منتدى جنوب المحيط الهادئ (محددة خالية من مسببات الأمراض) وأجرى صارمة وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المؤسسات الحكومية المختلفة (مثل المعاهد الوطنية للصحة). البروتوكول سوف تحتاج إلى موافقة اللجنة المعنية "أخلاقيات التجارب الحيوانية" في مؤسسة مرفق (مثل اللجنة IACUC المؤسسية).

1-التحضير لزرع الورم

  1. مساكن الحيوانات
    1. الحصول على فئران C57BL/6 عام من بائع تربية تجارية.
    2. بيت الفئران (5) في أقفاص التهوية الفردية في الظروف التالية: درجة الحرارة: 20 – 26 درجة مئوية؛ الرطوبة 30 – 70%؛ إضاءة دورة: 12 ح الضوء والظلام 12 ح.
    3. استخدام الذرة الكوز الفراش هو تغيير أسبوعيا.
    4. للنظام الغذائي، توفير الأغذية الجافة الحبيبية تشعيع تعقيم خلال فترة الدراسة بأكملها.
    5. للمياه، وتوفر الحيوانات حرية الوصول إلى مياه الشرب المعقمة.
  2. إعداد يفتت الورم المانحين
    1. ابدأ بمراقبة وزن الجسم (وزن الجسم)، عن طريق وزنها باستخدام الرصيد، وحجم الورم (التلفزيون)، بقياس قدمه ذات الورنيّة، الفئران الحاملة لاستئصال ورم من الجهات المانحة.
    2. عندما يصل التلفزيون إلى 500-1,200 مم3، euthanize الحيوان في غطاء واقية وفقا للبروتوكول.
    3. تعقيم الجلد حول الورم باستخدام مسحات إيودوفور.
    4. إزالة الورم جراحيا (التفاصيل الموضحة في القسم 3: حصاد نيكروبسي وورم) ومكان الورم في طبق بتري يحتوي على 20 مل من برنامج تلفزيوني (قبل chill وسائط الإعلام أو المخزن المؤقت إلى 4 درجة مئوية قبل يوثانيزينج الحيوانات).
    5. إذا لم يكن هناك تلويث الدم، نقل الورم إلى آخر طبق بيتري وتغسل الورم مع برنامج تلفزيوني.
    6. قطع الورم في النصف، إزالة أي جلد إضافي أو السفن أو تكلس أو نخر.
    7. اختر فقط سليمة قطعة من الورم ووضعها في أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل وإضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني ثم نقل الأنبوب إلى غرفة حيوان منفصلة لدراسات علم الصيدلة.

2-أورثوتوبيك وانجرافتمينت تحت الجلد (SC)

  1. التلقيح SC
    1. قطع الأورام إلى 2 مم أجزاء القطر باستخدام مشرط، وضع قطعة 1 في كل تروكار، لغرس اتفاقية استكهولم أو لزرع أورثوتوبيك لاحقاً (انظر أدناه).
    2. تخدير الحيوان المتلقي مع 5% إيسوفلوراني، التي هي التي تحتفظ بها مخروط الآنف عند 1%. ستبدأ للاسترخاء، تفقد تلك العاكسة رايتينج الحيوان وتصبح في نهاية المطاف غير متحرك. في هذا العمق من التخدير أنها يمكن بسهولة أن موقظ من المحفزات مؤلمة؛ السماح للتخدير لتعميق حتى هذه الاستجابات للألم غائبة.
    3. بمجرد تخديره، إصلاح الفئران على لوحة تجربة في الموضع الأفقي الحق. تعقيم الماوس باستخدام مسحات إيودوفور، لا سيما في المناطق المحيطة الأورام.
    4. مع مشرط، جعل شق جلد سم 0.5 إلى 1.0 في الجناح الأيسر، الجمجمة فقط الورك.
    5. نفق تحت الجلد نحو فوريليمب، اثنين إلى ثلاثة سنتيمترات، مع الملقط حادة.
    6. أسيبتيكالي نقل مكعب واحد من ورم من المتوسطة والعميقة داخل نفق تحت الجلد.
    7. بصريا تؤكد أن الورم في عمق النفق (وليس في شق الجلد).
    8. إغلاق الجرح بالجرح مقاطع.
    9. رصد تلقيح الحيوانات منصب حتى أنهم يستعيد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. العودة الحيوانات إلى القفص بهم إلا بعد شفائهم التام من التخدير. إكمال "تسجيل التخدير"، والشروع في "التخطيط الصحة الحيوانية". وزن الحيوانات المتلقي يوميا لمدة ثلاثة أيام
    10. لإجراء موحد، تطعيم الفئران 5-10 كل مجموعة لرصد نمو الورم.
  2. زرع البنكرياس أورثوتوبيك
    1. التخدير والتسكين
      1. استخدام 2 مل الكيتامين حقن و 0.42 مل xylazine الحقن (20 ملغ/مل) مختلطة في 5.91 حقن معقمة الماء أو المحلول الملحي على كمية جرعة من 0.06-0.1 مل/20-25 غرام من وزن الجسم.
        ملاحظة: طبقاً للرفق بالحيوان، التسكين ضروري على حد سواء قبل وبعد العملية. 0.05 – 0.1 مغ البوبرينورفين كغ، والمحكمة العليا. الجرعة الأولى قبل العملية وثم مداوي 3 مرات كل 4 ساعات بعد العملية باستمرار.
    2. عملية جراحية لزرع أورثوتوبيك
      1. تخدير الفئران عن طريق الحقن العضلي (IM) كل خطوة 2.2.1.
      2. بعد أن يتم تخديره تماما من الحيوانات، إصلاح الفئران على لوحة تجربة في الموضع الأفقي الحق.
      3. الحفاظ على الفئران في الموضع الأفقي الحق. تطهير الجلد حول الطحال مع اليود ثم دي إيوديناتي مع 75% إيثيل الكحول.
      4. العثور على نقطة متوسطة من الطحال وجعل شق عمودي 1 سم في البطن لفضح الطحال.
      5. استخلاص جزء من أنسجة البنكرياس تحت الطحال بلطف مع ملاقط نصيحة مسطحة، وخياطة قطعة ورم هوموجرافت ماوس من الماوس البذور في البنكرياس من الماوس المستلم بخياطة جراحية قابلة للامتصاص 9-0.
      6. إغلاق البطن مع خياطة حرير 6-0 بالتماس مزدوجة. تحقيق التوازن عن طريق ضغط.
      7. بعد الانتهاء من زرع الورم، في حال حدوث نزيف لا ورم الأنسجة التسرب، إبقاء الحيوانات في قفص حارة.
      8. مراقبة الحيوان حتى أنه يستعيد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية؛ إرجاع الحيوان إلى غرفة الحيوانات بعد الشفاء التام من التخدير. رصد الورم واضعة الفئران التي بالباتينج في البطن قرب الطحال وحدد بها الفئران تحمل الأورام أورثوتوبيك.
  3. ورم الحاملة للصحة الفئران الرصد
    1. تحقق من أن استهلاك الماء والطعام يوميا.
    2. دراسة مظهر الماوس لمعطف شعر أونجروميد، كتل وركاكة والتنفس غير طبيعي أو الاستسقاء.
    3. جس البطن لمعرفة ما إذا كان هناك أورام عفوية في الكبد أو الطحال.
    4. وزن الفئران أسبوعيا باستخدام توازن.
    5. إذا لوحظت أي من علامات سريرية التالية، يتم التضحية بالفئران لجمع العينات ونيكروبسي: فقدان وزن الجسم > 20%؛ ضعف في الحركة (عدم القدرة على تناول الطعام أو الشراب)؛ غير قادر على نقل عادة بسبب استسقاء كبير والبطن الموسع؛ بذل جهد في التنفس.

3-نيكروبسي وورم الحصاد

  1. افحص بصريا، وملامسة للوجود أورام محسوسة قبل الإنهاء.
  2. للإنهاء، أولاً euthanize الفئران وفقا للبروتوكول المعتمد، وفتح البطن وبصريا فحص البنكرياس للأورام.
  3. قطع الورم عن طريق الجراحة بعد بشري، وإضافته إلى برنامج تلفزيوني الباردة. ضع جميع الحيوانات في دائرة القتل رحيم نظيفة، دون توجيه تهمة إليه، وشفافة مع غطاء خاص مع منفذ لإيصال ثاني أكسيد الكربون لاستخدامها.
  4. تصريف غاز في الدائرة بمعدل تدفق الذي ينتج فقدان الوعي السريع مع الحد الأدنى من الشدة للحيوان. ينبغي أن يكون معدل التدفق الأمثل لأول أكسيد الكربون2 حوالي 2 – 2.5 لتر في الدقيقة.
  5. مراقبة كل الحيوانات بصريا أثناء عملية القتل الرحيم أن أؤكد لجميع الحيوانات تلقي تركيزات غاز كافية ولا يستعيد وعيه أثناء إجراء يوثانيزي.
  6. الحفاظ على تدفق الغاز لمدة 1 دقيقة على الأقل بعد وفاة سريرية الظاهر للتقليل من إمكانية أن حيوان يجوز استرداد (إذا كان قد لكن لم يمت).
  7. إزالة أنسجة الورم غير متجاورة. ويمكن تصوير الورم تنظيفها بسرعة.
    وضع أنسجة الورم ربمي-1640 والحفاظ على الجليد قبل الانفصال.
    ملاحظة: أكياس جثث الحيوانات وتخزينها في الثلاجة مناسب انتظارا لإزالة.

4-ورم الأنسجة الانفصال وإعداد خلية مفردة

  1. إعداد كاشف
    ملاحظة: يحتوي على "عدة تفارق الورم" قنينات 2 إنزيم د (مسحوق المجففة بالتبريد)، 1 قنينة من إنزيم R (مسحوق المجففة بالتبريد)، 1 قنينة من إنزيم A (مسحوق المجففة بالتبريد) و 1 مل من المخزن المؤقت ألف
    1. إعداد "د الإنزيم" بإعادة تشكيل المساحيق المجففة بالتبريد في كل قنينة مع 3 مل من ربمي-1640. تحضير مختبرين لوحدة تخزين ملائمة لتجنب تكرار التجميد-ذوبان الجليد-دورات.
    2. تحضير الإنزيم R بإعادة تشكيل المساحيق المجففة بالتبريد في القنينة مع 2.7 مل من RPMI 1640. تحضير مختبرين لوحدة تخزين ملائمة لتجنب تكرار التجميد-ذوبان الجليد-دورات.
    3. تحضير الإنزيم A بإعادة تشكيل المساحيق المجففة بالتبريد في القنينة مع 1 مل من المخزن المؤقت بتزويد عدة. عدم دوامة. تحضير مختبرين لوحدة تخزين ملائمة لتجنب تكرار مجاناً-ذوبان الجليد-دورات.
    4. إعداد مزيج الإنزيم بإضافة 2.35 مل ربمي-1640، 100 ميليلتر من "إنزيم د"، 50 ميليلتر من إنزيم R وميليلتر 12.5 ألف إنزيم في كل جينتليماكس ج-الأنبوبة.
  2. الانفصال من ورم
    1. لكل ورم إعداد ج-أنبوب واحد مع مزيج الهضم الورم، يرجى الرجوع إلى الفرع 4-1 لتمييع المخزن المؤقت الهضم والتحضير.
    2. استخدام 3 مل الهضم المخزن المؤقت لأجزاء الورم < ز 0.8، وضمان الورم يهضم تماما.
    3. قم بتسمية مع دراسة التعليمات البرمجية والورم، ومعرف الماوس، وفريق العلاج، ووزن الورم.
    4. جمع الورم من الماوس وتغسل الورم في برنامج تلفزيوني الباردة وتنظيف الأنسجة يعلق على الورم (مثل الأوعية الدموية، الدهون، فآسيا، إلخ.).
    5. وضع الورم في وسائل الإعلام في الهضم في بئر واحدة من صفيحة جيدا 6 العقيمة.
    6. عقد الورم في مكان مع ملاقط معقمة/الملقط وشريحة مع مشرط. شريحة الورم جيدا بما يكفي للخروج إلى أجزاء أصغر (~ 1 مم3).
    7. مكان القطع الورم مرة أخرى في ج-الأنبوب واستخدام المخزن المؤقت الهضم المتبقية ليغسل اللوحة ومن ثم نقل السوائل في ج-أنبوب يوضع على الجليد حتى الهضم.
    8. التبديل ديسوسياتور مع سخانات.
    9. مكان الورم تفارق ج-أنابيب رأسا إلى الأكمام من الوظائف الشاغرة وضبط حالة المواقف أنبوب من الحرة إلى مختارة. اختر برنامج الانفصال (37_c_m_TDK_1)، متبوعاً باختيار المجلد المطلوب، حيث يتم عرض قائمة البرامج.
    10. بعد انتهاء البرنامج، تقلع ج-أنابيب ديسوسياتور وتدور بإيجاز (300 x ز، 4 درجة مئوية) بيليه العينة.
    11. تعليق إعادة العينات ووضعها في مصفاة خلية أعلاه أنبوب 50 مل. تغسل الخلايا من خلال مصفاة الخلية مع 10 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لتقديم تعليق خلية واحدة.
    12. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 300 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية وإعادة تعليق الخلايا مع 5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام تريبان الأزرق و/أو بواسطة العداد الخلية وضبط كونسينتراتون الخلية إلى 1 × 106 خلايا كل أنبوب أو لكل عينة. وتشمل الأجسام المضادة التي تحكم ايستب الصحيح لضمان تلوين المحددة

5. تصميم لوحة محصنة والحصول على تدفق البيانات

  1. تصميم لوحة
    1. يرجى الاطلاع على الجدول 1.
  2. إيمونوستاينينج
    1. نادي كتلة عينة الخلايا: تعليق إعادة الخلايا في 200 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت مع 1 ميكروغرام/مل Fc-كتلة، تليها الحضانة في التبريد الجليد أو 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    2. الخلايا وصمة عار باستخدام لوحات جسم/الأسفار المطلوب (على سبيل المثال. لوحة تسيل، لوحة بلعم، إلخ.): إضافة خليط جسم مخفف في المخزن المؤقت حظر Fc لكل عينة، وصمة عار لمالا يقل عن 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
    3. أضف 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لكل أنبوبة وإعادة تعليق الخلايا بلطف، متبوعاً بالطرد المركزي في 300 x ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية الناتجة عن ذلك.
      1. تكرار غسل الخلايا مرتين.
    4. وصمة عار لعلامات داخل الخلايا إذا لزم الأمر، الخطوات التالية 6-10، وإلا القفز إلى الخطوة 10.
    5. تعليق إعادة بيليه الخلية بدوامة النبض وإضافة 200 ميليلتر للتثبيت/Permeabilization استعداد العامل الحل لكل عينة. نبض دوامة مرة أخرى ومن ثم احتضان عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (يفضل) أو 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    6. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وإزالة المادة طافية.
    7. تغسل مرتين بإضافة 1 مل 1 × Permeabilization المخزن المؤقت (مصنوعة من 10 × Permeabilization المخزن المؤقت، وتضعف مع المقطر ح2س) متبوعاً بالطرد المركزي والصب من المادة طافية.
    8. إضافة جسم العلامة داخل الخلايا في 1 × Permeabilization المخزن المؤقت واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    9. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل 1 × Permeabilization المخزن المؤقت. الطرد المركزي وصب المادة طافية.
    10. ريسوسبيند الخلايا في 150 ميليلتر من "المخزن المؤقت لتلطيخ" وتحليل في سيتوميتير. بسبب إجراءات التثبيت و permeabilization، منتدى التعاون الأمني (الأمام-الضوء المبعثر)/SSC (الجانبي مبعثر) توزيع السكان الخلية سوف تكون مختلفة للعيش الخلايا. ولذلك، سوف تحتاج إلى تعديل البوابة والفولتية.
  3. ضوابط FMO (Fluorescence ناقص عنصر تحكم واحد)
    ملاحظة: تحليل تدفق متعدد الألوان أهمية خاصة بالنسبة للتحليل للتسلل إلى ورم الخلايا المناعية. ولذلك، هناك حاجة إلى إيجاد طريقة لتحديد وبوابة الخلايا في سياق البيانات التي انتشرت بسبب فلوروتشروميس متعددة في لوحة معينة. التحكم FMO (Fluorescence ناقص واحد) نهج هام لهذا الغرض.
    1. وتحقيقا لهذه الغاية، تشمل إضافية الفئران في كل مجموعة لضوابط FMO (على الأقل 2 الواحدة Rx) وعملية منفردة لكل الأنسجة. وبعد الانفصال، تجمع الأنسجة. على سبيل المثال، في دراسة مع 4 Rx المجموعات، أورام إضافية 8 ينبغي معالجتها بشكل فردي وثم تجمع في عينة واحدة فموس.
  4. تدفق إعداد الصك
    1. جعل التعويض الخرز بينما الجهاز هو الاحماء (20 دقيقة على الأقل).
    2. استخدم الخرز CS أية تي آند تي للتحقق من الأداء.
    3. إعدادات الجهد والتعويض: استخدام الخرز UltraComp، دوامة الشركات الخرز جيدا قبل الاستخدام.
    4. قم بتسمية أنبوب عينة منفصلة 12 × 75 مم2 لكل جسم مترافق فلوروتشرومي.
    5. إضافة 100 ميليلتر من تلطيخ المخزن المؤقت لكل أنبوبة. إضافة 1 قطره كاملة (حوالي 60 ميليلتر) من الخرز لكل أنبوبة.
    6. إضافة الأجسام المضادة وتنفيذ الإجراء المصبوغة بالضبط كعملية العينة المذكورة في المادة 4.
    7. إضافة 0.5 مل من تلطيخ المخزن المؤقت كل، تماما إعادة تعليق الكريات حبة عبر دوامة.
    8. ضبط تدفق cytometer PMT الجهد كل الأنسجة المستهدفة لتجربة معينة.
    9. تديرها من خلال تدفق سيتوميتير للحصول على البيانات، النابضة بالسكان حبة القميص كل القراءات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب.
    10. تعيين معدل تدفق حوالي 200-300 الأحداث/s.
    11. تعيين تعويض مناسب فلوريسسين معين [فيتك]-جسم مترافق، استخدام FL1 مقابل FL2 مؤامرة نقطة.
    12. ضع بوابة رباعي، حيث تكون حبات السلبية في الربع الأيسر السفلي والخرز الإيجابية في الجزء العلوي أو السفلي حق رباعي. ضبط قيم التعويض حتى fluorescence متوسط الكثافة (MFI) لكل السكان (كما هو موضح في الإطار إحصائيات رباعي) يساوي تقريبا (أي ل FL1 FL2-%، مؤسسة مونتانيار FL2 من حبات كلا يجب أن تكون مماثلة).
    13. كرر الخطوتين 5.4.11 و 5.4.12 لجميع الأنابيب.
    14. المضي قدما للحصول الفعلية الملون العينات. قم بتشغيل معالج التعويض وحفظ الإعدادات باستخدام التنسيق "التاريخ تجربة اسمك".

6-تدفق البيانات التحليل والعرض التقديمي

  1. تحليل البيانات من قبل فلوجو و/أو كالوزا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

غرس أورثوتوبيك بدك أدى إلى نمو الورم السريع مشابهة للتي ينظر إليها لغرس اتفاقية استكهولم. بعد أن تم زرع أجزاء الورم المانحين في الفئران المستفيدة، سواء تحت الجلد وأورثوتوبيكالي وفقا للبروتوكولات هو موضح في الخطوات 2.1 و 2.2، والأورام homograft فيلق حماية كوسوفو مزروع أظهر النمو السريع مشابهة كما هو موضح في الشكل 1A . فيلق حماية كوسوفو homograft الأورام تحصد في نقاط زمنية مختلفة مبينة في الشكل 1 باء والممثل ح & الصور الإلكترون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن أكثر سهولة تجري دراسات باستخدام اتفاقية استكهولم الأورام، نماذج الأورام أورثوتوبيكالي مزروع يحتمل أن يمكن أكثر صلة بدراسات علم الصيدلة السريرية (لا سيما التحقيقات الإدخال/الإخراج) لتقديم المعزز طواعية. يهدف هذا التقرير إلى مساعدة القراء/الجمهور المهتمين ليتمكن من تصور مباشرة الإجراءات التقنية التي يمكن استخدامها في أبحاثهم الخاصة بكل منها. لدينا بروتوكولات إثبات أن أورثوتوبيك غرس بدك يمكن أن ينتج عن نمو الورم كفاءة، مماثلة لغرس اتفاقية استكهولم. ويبدو ملاحظاتنا أيضا تشير إلى وجود ملفات تعريف مختلفة محصنة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

هي جميع المؤلفين العاملين بدوام كامل الحالي تاج العلوم البيولوجية، وشركة

شكر وتقدير

الكتاب أود أن أشكر الدكتور جودي باربو-لقراءة وتحرير المخطوطة الحرجة، وأشكر مانويل رالف لتصميم الأعمال الفنية. الكتاب أيضا يود أن يشكر فريق علم الأورام في فيفو ، لجهودها التقنية كبيرة وفريق التاج العلوم البيولوجية الأورام الأورام المناعية "العلامات البيولوجية".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
آلة التخدير\SAS3119\
مبزل 20\\2 مم
طبق بتري\\ 20 مم
100 × مضاد حيوي ومضاد للفطريات\\\
مسحات اليودوفور\\الشراء اليومي للصيدلية
مسحات الكحول\\الشراء
اليومي للصيدليةالنيتروجين السائلكيماوياتالهواء \\
غطاء السلامة الحيويةAIRTECHBSC-1300IIA2\
FACS آلة LSRFortessa X-20BDLSR Fortessa\
الأجسام المضادةBD\
\ Trevigen MD أو BD Matrigel Basement Membrane Matrix عالية التركيزBD354248\
FACS المخازنBD554656مخزن مؤقت فرم
عازلة تلطيخ رائعةBD563794\
Mouse BD Fc BlockBD553142\
مرشحات الخليةBD-Falcon35235070 & micro ؛ م
أنبوب الدم الروتينيBD-Vacutainer3659742 مل
KaluzaBeckmanمقابل 1.5
6 ألواح بئرCorning3516\
Foxp3 Fix / Perm kitebioscience00-5523-00\
UltraComp eBeadsebioscience01-2222-42\
الطرد المركزيeppendorf5810R ، 5920R\
برنامجFlowJo FlowJo LLC\vs 10.0
PBSHycloneSH30256.0150 مل
RPMI 1640HycloneSH30809.01\
مشارط معقمة يمكن التخلصJin zhongJ1210011 #
مقبض سكينJin zhongJ11010\
مقص العين والملاقطJin zhongY00030مقص العين 10 سم
مقص العين والملاقطJin zhongJD1060ملاقط العين 10 سم مع الأسنان
خزان النيتروجين السائل المحمولJinfengYDS-175-216\
التوازن الإلكترونيMetter ToledoAL2040-100 g
Miltenyi C-tubesMiltenyi130-096-334\
Miltenyi Gentle MACS مع كتل سخانMiltenyi120-018-306\
طقم تفكك الورمMiltenyi130-096-730\
عداد الخليةNexcelomمقياسالسيلومتر مقياس الخلفي التلقائي T4
أنبوب الحفظ بالتبريدNunc3754181.8 مل
Cultrex تركيز البروتين العالي (HC20 +) مسار BMEClear3442-005-01\
محاقنشنغهاي MIWA الصناعة الطبية\1-5 مل
برنامج StudylogStudylog \برنامج
Studylog-Balance ودعم USBOHAUSSE601FBalance ودعم USB
Studylog-Data line من الفرجار الورنيSylvac926.6721خط بيانات الفرجار الورني
الفرجارSylvac910.1502.10Sylvac S-Cal pro
أنابيب الطرد المركزي المعقمة339653 الحرارية50 مل
أنابيب الطرد المركزي المعقمةالحرارية33965115 مل
دلو ثلجThermoKLCS-2884 درجة ؛ دلو
ثلجThermoPLF-276-20° ؛ دلو
ثلجThermoDW-862626-80° ؛ ج
RNAlaterThermoam7021\
منها C C

المراجع

  1. Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
  2. Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
  3. Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
  4. Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316(2016).
  5. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
  6. Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
  7. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
  8. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  9. Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
  10. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  11. von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
  12. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
  13. Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
  14. Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
  15. Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
  16. Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
  17. Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
  18. Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
  19. Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
  20. Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
  21. Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نماذج الفئرانالبيئة الدقيقة للأورامالخلايا المناعية المتسللة إلى الورمقياس التدفق الخلوي متعدد الألوانتفكيك الخلاياالأجسام المضادة الفلورية
إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.