تعرض هذه المقالة بروتوكول بسيط واقتصادي لعزله واضحة وتنقية الخلايا الجذعية الوسيطة من نيوزيلندا الأرنب الأبيض السائل الزليلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي مصدر الخلية الرئيسية للعلاج يستند إلى الخلية. يمكن استخدامها لهندسة الأنسجة الغضاريف MSCs من تجويف مفصلي السائل الزليلي. MSCs من السائل الزليلي (SF-MSCs) تم النظر في المرشحين الواعدين للتجدد مفصلي، وعلى الفائدة العلاجية المحتملة قد جعلها موضوعا بحثيا هاما في الآونة الأخيرة. MSCs سادس من تجويف الركبة الأرنب النيوزيلندي الأبيض يمكن أن تستخدم كنموذج متعدية أمثل لتقييم الطب التجديدي البشرية. عن طريق المستندة إلى CD90 المغناطيسي تنشيط الخلية فرز التكنولوجيات (ماك)، هذا البروتوكول بنجاح يحصل على أرنب SF-MSCs (ربسف-MSCs) من هذا الطراز أرنب وكذلك يوضح تماما النمط الظاهري ماجستير من هذه الخلايا باغرائهم للتفريق إلى خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes وتشوندروسيتيس. ولذلك، يمكن تطبيق هذا النهج في بحوث علم الأحياء الخلية وهندسة الأنسجة باستخدام معدات بسيطة وإجراءات.
المقدمة
وقد اقترح MSCs كمصدر قيم للطب التجديدي، خاصة بالنسبة للآفات الغضروف. على نطاق واسع أن MSCs، بما في ذلك تشوندروسيتيس وخلايا الاوستيوبلاستس، adipocytes، myocytes الهيكل العظمى والخلايا اللحمية الحشوي، توسيع المجالات لزرع الخلايا الجذعية بسبب بهم التوسع ارتفاع معدل ونسب متعددة التمايز المحتملة1. MSCs يمكن أن تكون معزولة من الهيكل العظمى العضلات والزليلي ونخاع العظام والأنسجة الدهنية2،،من34. أن النتائج التي توصل إليها أيضا confirmed وجود MSCs في السائل الزليلي، وقد حددت البحوث السابقة MSCs المستمدة من السائل الزليلي (SF-MSCs) كمرشحين واعدة للتجدد مفصلي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الإقليمية "لجنة الأخلاقيات"، ووافق جميع الإجراءات الحيوان مستشفى رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة من شنتشن الشعب الثانية، جامعة شنتشن.
1-عزل والثقافة ربسف-MSCs
-
الأعمال التحضيرية لهذا الإجراء الحيوان
- تعد نيوزيلندا الإناث الناضجة سكيليتالي الأرانب البيضاء لجمع ربسف-MSCs-إجراء فحص السريري للأرانب قبل إجراء التخدير وبزل المفصل بيوم واحد.
ملاحظة: يجب أن تشمل الفحوصات الوزن (2.0 2.5 كجم) والجنس (الإناث)، ودرجة حرارة الجسم ومعدل التنفس ومعدل ضربات القلب. الفواصل الزمنية للمعلمة للأرانب السليمة سريرياً هي 30-50 دقيقة لمعدل التنفس، 220-280 دقيقة لم....
- تعد نيوزيلندا الإناث الناضجة سكيليتالي الأرانب البيضاء لجمع ربسف-MSCs-إجراء فحص السريري للأرانب قبل إجراء التخدير وبزل المفصل بيوم واحد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عزل وتنقية وثقافة ربسف-MSCs:
هذا البروتوكول يستخدم أجهزة ماكينتوش لعزل ربسف-MSCs، استناداً إلى التعبير عن علامة السطحية ماجستير CD90. ويرد في الشكل 1مخطط تدفق عملية ربسف-MSCs عزل وتنقية، وتوصيف والبروتوكول الثقافة في المختبر .
مورفولوجيا خلية بعد خلية تنشيط مغنطيسية الفرز (ماك) مع CD90:
أولاً، لأجهزة ماكينتوش، إيمونولابيل MSCs مع الخرز المغناطيسية CD9.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر وجود MSCs في السائل الزليلي بديل للعلاج يستند إلى الخلية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إصابة مواقع تحتوي على كميات أعلى من الخلايا الجذعية الوسيطة في بهم السائل الزليلي، الذي قد يكون ارتباطاً إيجابيا مع فترة ما بعد إصابة5. قد يكون من المفيد للأنسجة لتعزيز شفاء عفوية بعد إصابة18،19MSCs في السائل الزليلي. ونادراً ما غطى التطبيق السريري لسادس-MSCs في الأدب، أساسا لأن تظل آليات SF-MSCs في المفاصل غير معرف20. جونز<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
هذه الدراسة كانت تدعمها ماليا المنح التالية: "مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية" (رقم 81572198؛ رقم 81772394)؛ الصندوق لبناء ارتفاع مستوى الانضباط الطبية من جامعة شنتشن (رقم 2016031638)؛ مؤسسة البحوث الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، الصين (رقم A2016314)؛ شنتشن العلوم والتكنولوجيا المشاريع (رقم JCYJ20170306092215436؛ لا. JCYJ20170412150609690؛ لا. JCYJ20170413161800287؛ لا. SGLH20161209105517753؛ لا. JCYJ20160301111338144).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | دافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | مكون من MSCs استزراع متوسط |
| DMEM الأساسي | Gibco Inc. | C11995500BT | تمايز الخلايا الجذعية المتوسطة |
| محلول ملحي متساوي التوتر | ليتاي ، الصين | 5217080305 | كاشف إجراء بزل المفاصل في التجويف |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS ، خالية من Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) شركة | Gibco Inc. | 10099-141 | مكون من MSCs ثقافة متوسطة |
| محلول اليود بوفيدون | قوانغدونغ ، الصين | 150605 | عامل تعقيم |
| 75٪ إيثانول | Lircon ، الصين | 170917 | عامل تعقيم |
| 0.25٪ Trypsin / EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | كاشف تفكك الخلايا |
| 1٪ بنسلين ستربتومايسين | جيبكو | 15140-122 | مكون من الخلايا الجذعية المتوسطة |
| MACS تشغيل العازلة | MiltenyiBiotec | 5160112089 التي تحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، و 0.5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) ، و 2 mMEDTA | |
| CD90 MicroBeads مترافق | MiltenyiBiotec | 5160801456 | لفرز الخلايا المنشطة المغناطيسية |
| بيروفات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | P2256 | مكون من الخلايا الجذعية الجذعية الغضروفي التمايز |
| ديكساميثازون | سيجما ألدريتش | D1756 | مكون التمايز العظمي للخلايا الجذعية |
| الجذعية ITS | BD | 354352 | 1٪ ، مكون الخلايا الجذعية الجذعية التمايز الغضروفي |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 ملي مولار ، مكون الخلايا الجذعية الجذعية التمايز الغضروفي |
| حمض الأسكوربيك L-2-فوسفات | سيجما ألدريتش | A8960 | 50 ملي مولار ، مكون الخلايا الجذعية الجذعية التمايز الغضروفي |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM ، مكون التمايز المادي |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM ، مكون التمايز الحمدي |
| TGF & beta ؛ 1 | Peprotech | 100-21 | 10 نانوغرام / مل ، مكون من الخلايا الجذعية الجذعية التمايز الغضروفي |
| &alpha ؛ -glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | مكون من الخلايا الجذعية الجذعية التمايز العظمي |
| CD34 الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، FITC المترافق | Bioss | bs-0646R-FITC | علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم |
| الفأر المضاد للأرانب CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | غشاء Thy-1 البروتين السكري (علامة الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية) |
| CD45 (الجسم المضاد أحادي النسيلة) | Bio-Rad | MCA808GA | علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم |
| CD105 علامة | Genetex | GTX11415 | MSCs |
| علامة كحول الأيزوبروبيل | Sigma-Aldrich | I9030 | يترسب استخراج الحمض النووي الريبي الأطوار العضوية |
| ثلاثي كلورو الميثان | ينجي ، الصين | 61553 | استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | عزل إجمالي الحمض النووي الريبي |
| SYBR مزيج رئيسي أخضر | تاكارا بيو ، اليابان | RR420A | اختبار PCR |
| مجموعة توليف الحمض النووي | تاكارا بيو ، اليابان | RR047A | عكسي إلى الحمض النووي التكميلي |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | تلطيخ مركبات الكالسيوم |
| تولويدين الأزرق | سيجما ألدريتش | 89640 | تلطيخ الأنسجة الغضروفية |
| زيت Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | تلطيخ فجوة |
| دهني <قوي > المعدات < / قوي > | |||
| فاصل MiniMACS | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | لفرز الخلايا المنشطة المغناطيسية |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | لفرز الخلايا المنشطة المغناطيسية |
| أعمدة MS | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | لفرز الخلايا المنشطة المغناطيسية |
| مصفاة الخلايا | FALCON Inc. | 352340 | 40 & م مقياس الدم من النايلون |
| ISOLAB Inc. | 075.03.001 | عد الخلايا | |
| فالكون 100 مم طبق | كورنينج | 353003 | صحن ثقافة الخلية |
| أنبوب الطرد المركزي الدقيق | Axygen | MCT-150-C | استخراج الحمض النووي الريبي وأنابيب الطرد المركزي PCR |
| سيجما-ألدريتش | 91050 | معقمة بجاما | |
| Eppendorf | 5804R | خلايا الطرد المركزي | |
| خلية ثاني أكسيد الكربون حاضنة | حراري علمي | 3111 | ثقافة الخلية |
| في الوقت الحقيقي PCR أداة | الحياة التكنولوجيا | QuantStudio | في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل |
| الكمي مقياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | 342975 | محلل الخلية |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | نقل السائل |
| اسطوانة الاستنساخ | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | عزل واختيار مستعمرات الخلايا الفردية |
| حقنة تحت الجلد معقمة | حمامة مزدوجة ، الصين | 131010 | إجراء بزل المفاصل |
| قفص الأرانب | Zhike ، الصين | ZC-TGD | كبح جماح الأرنب |
المراجع
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
