مقالة منهجية

جيل من الخلايا الظهارية الآنف البشرية الماغنيسيوم فردية التليف الكيسي Transmembrane الموصلية منظم الدراسة

DOI:

10.3791/57492

⸱

أبريل 11, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا وسيلة لتوليد الثقافات كروي ثلاثي الأبعاد للخلايا الظهارية الآنف البشرية. ثم يتم تحفيز الماغنيسيوم محرك منظم الموصلية التليف الكيسي Transmembrane (CFTR)-تعتمد أيون وإفراز السوائل، قياس التغير في حجم كروي لومينال كوكيل للدالة CFTR.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين إدخال العقاقير المغير منظم الموصلية التليف الكيسي Transmembrane (CFTR) قد أحدث ثورة في الرعاية في "التليف الكيسي" (CF)، نموذج العلاج الموجه بالنمط الوراثي حاليا في استخدام نقائص عديدة. مجموعات الطفرة الأولى أو نادرة أو المداريين مستبعدة من التجارب السريرية نهائي. وعلاوة على ذلك، كما أدخل المخدرات المغير إضافية في السوق، ستصبح صعبة لتحسين الخيارات المغير لموضوع فردية. كل من هذه القضايا تعالج باستخدام نظم نموذجية الإكلينيكية المستمدة من المريض، وفردية للدالة CFTR والتحوير. الخلايا الظهارية الآنف البشرية (الاهناسى) مصدر يمكن الوصول بسهولة لانسجة الجهاز التنفسي لنموذج من هذا القبيل. وهنا، يصف لنا توليد نموذج كروي ثلاثي الأبعاد لدالة CFTR وتعديل الاهناسى الأولية باستخدام. الاهناسى معزولة من المواضيع بطريقة كسبها، توسعت في ظروف إعادة برمجة الشرطي، والمصنفة في ثقافة كروي. خلال أسبوعين من البذر، تولد ثقافات كروي الماغنيسيوم هني أنه يمكن حفز مع 3 ', 5' دوري الادينوسين الأدينوزين (مخيم)-توليد يضع لتنشيط وظيفة CFTR. ثم هو كمياً تورم كروي كوكيل لنشاط CFTR. الماغنيسيوم هني الاستفادة من أصل كسبها، ومع ذلك الجهاز التنفسي الآنف خلايا لتوليد نموذج موجوداً، وشخصية تتصل ظهارة يعكس المرض معدلات الاعتلال والوفيات. بالمقارنة مع ثقافات هني واجهة الهواء السائل، الماغنيسيوم سريعة نسبيا إلى أن تنضج، مما يقلل من معدل التلوث العام. في شكله الحالي، يقتصر النموذج الإنتاجية منخفضة، على الرغم من أن هذا يقابل السهولة النسبية للحصول على أنسجة. الماغنيسيوم هني يمكن استخدامها لقياس موثوق بها وتميز نشاط CFTR على المستوى الفردي. سيتم تحديد دراسة جارية لربط هذا التحديد الكمي للاستجابة في فيفو المخدرات إذا الماغنيسيوم هني مؤشرا صحيحاً الإكلينيكية لاستجابة المريض للتحوير CFTR.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التليف الكيسي (CF) مرض المتنحية القاتلة، وجسمية تؤثر على أكثر من 70 ألف شخص في جميع أنحاء العالم1. بسبب هذا المرض الوراثي تقصير الحياة الطفرات في الموصلية التليف الكيسي Transmembrane منظم للبروتين (CFTR)2. CFTR عضو في الأسرة كاسيت ملزم الادينوسين ثلاثي الفوسفات، ومهام كقناة أيون السماح بتحرك من الكلوريد والبيكربونات عبر أغشية قمي epithelia الاستقطاب متعددة بما في ذلك الجهاز الهضمي، الغدد العرقية، والجهاز التنفسي شجرة3،4، بين أمور أخرى. على هذا النحو، CFTR المختلة وظيفيا يؤدي إلى خلل إطار الظهارية، مع معظم الوفيات الناجمة عن أمراض الجهاز التنفسي1. في الرئة CF، فقدان مجرى الهواء يحركها CFTR سطح السائل (ASL) التنظيم ومخاط الإفراج يؤدي إلى مخاط سميكة وعرقلة مجرى الهواء والعدوى المزمنة، وإعادة عرض مجرى الهواء تدريجيا وفقدان وظيفة الرئة1،5.

وعلى الرغم من تحديد خلل CFTR كسبب للمرض، العلاج في قوات التحالف تركز تقليديا على التخفيف من الأعراض (مثل، العلاج باستبدال إنزيم البنكرياس، العلاجات تطهير مجرى الهواء)1. وكان ثورة هذا النهج مؤخرا بظهور رواية المداواة، يطلق عليه "المغيرون CFTR،" التي تستهدف مباشرة CFTR المختلة وظيفيا. هذا النهج قد تحول المشهد السريرية من إدارة أعراض للمرض--تعديل الرعاية ولكن يحمل عدة قيود6،،من78،9،10. النشاط المغير محددة إلى عيب البروتين المصاحبة لكل طفرة CFTR ومحدودة لتحديد السكان الوراثية11. هذا القيد هو مدفوعة بالطبيعة غير متجانسة من البروتين العيوب، ولكن أيضا بعمليات التجارب السريرية في مجموعات طفرة نادرة. وباﻹضافة إلى ذلك، فيما بين المواضيع مع الأنماط الوراثية المدروسة جيدا (مثلاً، F508del/F508del CFTR، أن الطفرة CFTR الأكثر شيوعاً)، هناك تباين واسع في المرض عبئا والمغير استجابة6،7،8 ،،من911.

للتغلب على هاتين المسألتين، اقترحنا المحققين استخدام نماذج مخصصة ل التجارب الإكلينيكية12. ويستخدم هذا المفهوم الأنسجة الخاصة بالمريض لتوليد نظام فردي السابقين فيفو نموذجي لاختبار المركب، التنبؤ في فيفو هذا الموضوع استجابة للعلاج بطريقة شخصية. بمجرد التحقق من صحتها، يمكن أن يستخدمها نموذج من هذا القبيل إلى الأطباء للعلاج الدقة محرك الأقراص بغض النظر عن الأساسية CFTR النمط الوراثي المريض.

الشعب الهوائية الظهارية (HBE) الخلايا البشرية التي تم الحصول عليها من أنسجة explant في وقت زرع الرئة المنشأة إمكانية مثل هذا النموذج لقوات التحالف13،14. حبيس نمت في واجهة الهواء السائل (على) تسمح للتقدير الكمي CFTR الفنية مباشرة من خلال اختبار الكهربية أو غير مباشر من خلال تدابير ASL التوازن13،15. هذا النموذج كان حاسما في فهم بيولوجيا CFTR ومحركاً أساسيا في تنمية CFTR المغيرون16. ولسوء الحظ، نماذج HBE لا يمكن تحصيلهما كنموذج شخصية بسبب طبيعة الغازية اقتناء (زرع الرئة أو الشعب الهوائية بالفرشاة) وعدم وجود نماذج لأولئك مع الطفرات النادرة أو مرض خفيف. على العكس من ذلك، يمكن استخدام الأنسجة المعوية، التي تم الحصول عليها من عينات خزعة المستقيم أو الإثني عشر، للقياس الحالي المعوية (ICM) أو الإنزيم أورجانويد المستندة إلى تورم دراسة فردية CFTR الدالة17،18، 19-فحوصات أورجانويد، على وجه الخصوص، نماذج حساسة جداً CFTR النشاط20،،من21إلى22. كلا النموذجين محدودة من المصدر الأنسجة (الأنسجة المعوية، بينما معظم الأمراض أمراض الجهاز التنفسي) والأسلوب شبه الغازية لاقتناء. وبدلاً من ذلك، درسنا العديد من المحققين البشرية الآنف الخلايا الظهارية (هني) إلى نموذج CFTR استعادة23،،من2425. الاهناسى يمكن أن تحصد بأمان بالفرشاة أو الكشط في موضوعات في أي سن، والخص عندما مثقف في على العديد من خصائص حبيس25،26،،من2728. تقليديا كانت محدودة ثقافات أحادي الطبقة هني التحول صدفية ونضج29منذ وقت طويل. وعلاوة على ذلك، أفادت الدائرة القصيرة القياسات الحالية في الاهناسى أصغر من تلك التي في حبيس، مما يوحي بنافذة صغيرة للكشف عن الفعالية العلاجية25.

نظراً للحاجة لنموذج شخصي، وغير الغازية، والالتهاب الرئوي زراعة الأنسجة للدالة CFTR، سعينا إلى دمج حساسية مقايسة أورجانويد المستندة إلى تورم، مع الطابع غير الغازية والجهاز التنفسي الاهناسى. وهنا يصف لنا لدينا طريقة لتوليد الثقافات ثلاثي الأبعاد "كروي" الاهناسى للدراسة CFTR فردية في تحليل القائم على تورم30. الماغنيسيوم هني استقطاب وموثوق بها مع ذروة الظهارية نحو مركز المجال، أو التجويف. هذا النموذج يلخص خصائص عديدة ظهارة الجهاز التنفسي السفلي وينضج بسرعة أكبر على الثقافات. كتحليل وظيفية، كمياً الماغنيسيوم هني موثوق وظيفة مجموعة CFTR، فضلا عن التحوير في الطفرة مدروسة المجموعات (مثلاً، F508del CFTR). هذا التحليل يستند إلى تورم تستفيد من خصائص النقل أيون/الملح CFTR، غير مباشر قياس تدفق السوائل إلى كروي كما يلي قمي efflux الملح من المياه. في هذا الشكل، الماغنيسيوم حفزت مع CFTR تعمل بكامل طاقتها تضخم قوة، بينما تلك مع CFTR مختلة تضخم أقل أو تقليصها. هذا هو التحديد الكمي من خلال تحليل الصورة من قبل والماغنيسيوم التحفيز بعد ح 1، قياس المجال لومينال، وتحديد النسبة المئوية للتغيير. ويمكن مقارنة هذا التدبير ثم عبر المجموعات التجريبية للشاشة بيواكتيفيتي المخدرات بطريقة خاصة بالمريض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتم شراء هني عينات من مواضيع المعينين عن طريق "مركز مستشفى الطبية CF بحوث مركز سينسيناتي" للأطفال. تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بالمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) في المركز الطبي في مستشفى سينسيناتي "الأطفال". تم الحصول على موافقة خطية من جميع المواضيع قبل الاختبار.

1. إعداد وسائل الإعلام التوسع والمضادات الحيوية

  1. جمع عناصر الوسائط المذكورة في الجدول 1. ذوبان المواد المجمدة في درجة حرارة الغرفة وتقديم الحلول اللازمة الأسهم كما هو مبين في الجدول 1 تحت "التوسع في وسائل الإعلام".
    ملاحظة: استخدم العناية عند معالجة الكوليرا السمية، وهي سامة إذا تناولها، وهو الجلد، والعين، وإزعاج الجهاز التنفسي. والجمع بين جميع الحلول ووسائل الإعلام في ظروف نظيفة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  2. استخدام ماصة مقايسات 50 مل، إزالة وتجاهل 50 مل من قاعدة المتوسطة (دولبيكو تعديل النسر المتوسطة/F12) من حاوية واحدة للتعويض عن إضافة مواد أخرى. صب جميع وسائل الإعلام الأساسية باليد في زجاجة 1 لتر يعقم.
  3. استخدام ماصة مقايسات 50 مل أو ماصة 1 مل حسب الاقتضاء، نقل جميع العناصر المتبقية من المقطع "التوسع في وسائل الإعلام" من الجدول 1 إلى يعقم زجاجة تحتوي على وسائط الإعلام. دوامة الزجاجة باليد المزيج بلطف.
  4. تصفية وسائل الإعلام إلى عقيمة، طازجة 1 لتر، 0.22 ميكرومتر قارورة تصفية بولييثيرسولفوني (PES) باستخدام إرشادات الشركة المصنعة والحواشي مع "التوسع في وسائل الإعلام" والتاريخ.
  5. تحضير الوسائط المضادات الحيوية. جعل الحلول مخزون المضادات الحيوية اللازمة كما هو مبين في الجدول 1 تحت "وسائل الإعلام المضادات الحيوية".
    1. استخدام ماصة مصلية 50 مل، نقل 150 مل من "التوسع في وسائل الإعلام" باستخدام زجاجة جديدة 250 مل زجاج يعقم.
    2. استخدام ماصة 1 مل، إضافة كافة المكونات من قسم "الإعلام المضادات الحيوية" من الجدول رقم 1 إلى يعقم زجاجة تحتوي على وسائط الإعلام. دوامة من جهة المزيج حتى وسائل الإعلام موحدة في المظهر.
    3. تصفية وسائل الإعلام إلى عقيمة، طازجة 250 مل، 0.22 ميكرومتر قارورة مرشح الدائرة العامة باستخدام إرشادات الشركة المصنعة والحواشي مع المضادات الحيوية وسائط الإعلام "والتاريخ.
  6. قم بتخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد، تجاهل إذا غائم، مما يوحي بالتلوث.

2-إعداد وسائل الإعلام التمايز

  1. جمع عناصر الوسائط المسرودة في الجدول 2. ذوبان المواد المجمدة في درجة حرارة الغرفة وتقديم الحلول اللازمة الأسهم كما هو مبين في الجدول 2.
    ملاحظة: استخدام الحذر عند التعامل مع حمض الريتينويك، وهو السمية الإنجابية، يمكن أن تكون سامة إذا ابتلعت، ويسبب تهيج الجلد. جعل، الكوة، والجمع بين جميع الحلول ووسائل الإعلام في ظروف نظيفة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  2. إزالة وتجاهل 52 مل المتوسط قاعدة من حاوية واحدة للتعويض عن إضافة مواد أخرى. تصب جميع وسائل الإعلام قاعدة زجاجة 1 لتر يعقم.
  3. استخدام ماصة 25 مل المصلية أو ماصة 1 مل حسب الاقتضاء، نقل جميع العناصر المتبقية من الجدول 2 أن يعقم زجاجة تحتوي على وسائط الإعلام ودوامه بلطف باليد المزيج.
  4. تصفية وسائل الإعلام إلى عقيمة، طازجة 1 لتر، 0.22 ميكرومتر قارورة تصفية بولييثيرسولفوني (PES) باستخدام إرشادات الشركة المصنعة والحواشي مع "التمايز" وسائط الإعلام والتاريخ.
  5. قم بتخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد، تجاهل إذا غائم، مما يوحي بالتلوث.

3-معطف ثقافة الأطباق ولوحة الليفية المغذية

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في ظروف نظيفة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.

  1. مزيج من 0.5 مل من مخزون الكولاجين و 37.5 مل من الماء المعقم في أنبوب 50 مل مخروطية.
  2. "الماصة؛" 4-5 مل من محلول الكولاجين في كل طبق الثقافة P100 نظيفة، كفالة تغطي كامل السطح.
  3. تغطية الأطباق مع أغطية واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  4. في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إزالة جميع الطبق الأغطية. دوامة الحل لتغطية الطبق، ثم نضح.
  5. تعقيم بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الخفيفة حاء 1 مكان الأغطية مرة أخرى على الأطباق, الأطباق المكدس، وتغطي برقائق الألومنيوم.
  6. أطباق مخزن المغلفة عند 4 درجة مئوية لمدة 3-6 أشهر، إعادة التعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية ضوء 15-30 دقيقة قبل استخدام ثقافة الخلية.
  7. 24 ساعة قبل الحصول على عينة هني، تعقيم صحن مغلفة مسبقاً والتسمية تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEF) والتاريخ.
  8. إضافة إلى "التوسع في وسائل الإعلام" لتغطية اللوحة (حوالي 5 مل) مع ماصة مقايسات.
  9. ذوبان الجليد قنينة من 2 × 106 المشع MEFs في حمام مائي 37 درجة مئوية. حالما يتم مذاب ميفس، نصف القنينة (حوالي 106 خلايا) إضافة إلى الطبق مع ماصة 1 مل، يحوم باليد لتفريق.
  10. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها استعدادا للثقافة هني.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون خطوات 3.7-3.10 يؤديها في وقت متأخر 60 دقيقة قبل طلاء الخلايا، على الرغم من بين عشية وضحاها مثالي.

4-الحصول على ومعالجة عينة هني

  1. ضمان الحصول على موافقة/الموافقة التي وافق عليها مجلس الهجرة واللاجئين لجميع المواضيع.
  2. وقد آنف المريض ضربة مسح المخاط فضفاضة.
  3. تصور أدنى توربيناتي باستخدام رهينوسكوبي. ضمان لا آفات أو الأورام الحميدة في الوقت الحاضر الذي قد يحول دون جمع العينات.
  4. جمع الخلايا الآنف من الآنف الأولى بالكشط أو بالفرشاة.
    1. الكشط: كورت بيند في منتصفه إنشاء طفيف، وزاوية ~ 135° مع ذروة بعيداً عن كأس كورت. إدراج في كورت الآنف والمضي قدما في كأس كورت تحت أدنى توربيناتي. اضغط كأس كوريتي ضد أدنى توربيناتي برفق وكشط في توربيناتي عن طريق سحب كوريتي إلى الأمام، وتكرار عدد 3-4 مرات.
    2. الفرشاة: تمرير عنق فرشاة أدناه أدنى توربيناتي، ثم تدوير وتحريك الفرشاة الداخل قليلاً 4-5 مرات، دون الخروج الآنف.
  5. مكان كورت/الفرشاة في 15 مل مخروطية مليئة "المضادات الحيوية في وسائل الإعلام". كرر الخطوات 4، 4، 3-4 الآنف الأخرى، وضع كورت/الفرشاة في أنبوب مخروطي نفس.
  6. تخزين المخروطية على الجليد حتى جاهزة للمعالجة. ضمان أن التجهيز يحدث داخل ح 4 للحصول على عينة ولكن يمكن أن يحدث في وقت متأخر ح 24 بعد اكتساب إذا لزم الأمر.

5-عملية وتوسيع نطاق الخلايا هني في الأطباق

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في ظروف نظيفة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.

  1. باستخدام ماصة 1 مل ووسائط الإعلام من العينة المخروطية، غسل جميع خلايا الخروج من فرش كرتس/عنق في أنبوب مخروطي الشكل نفسه. مرة واحدة نظيفة، تجاهل كرتس/فرش.
  2. الطرد المركزي المخروطية في 360 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. نضح المادة طافية، رعاية لا الإزعاج بيليه الخلية.
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من محلول مفرزة الخلية، بيبيتينج مع تلميح 1 مل مجانسة الخليط.
  5. الطرد المركزي المخروطية في 360 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. كرر الخطوات من 5، 3-5، 5 مرة واحدة.
  7. نضح المادة طافية المتبقية، مع الحرص على عدم تعكير بيليه الخلية.
  8. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من "المضادات الحيوية في وسائط الإعلام"، وحساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
  9. استخدام ماصة 1 مل، لوحة خلايا دروبويسي على الطبق المغلفة، وتبذر تنتجها الخلايا الليفية إعدادها في الخطوة 3، 10. إضافة "وسائط المضادات الحيوية" لتغطية الطبق كاملا وتفريق الخلايا عبر السطح. تسمية طبق مع المحتويات والتاريخ واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  10. بعد 48 ساعة، التأكد من أن الخلايا هي تعلق على الطبق الثقافة. نضح وسائط الإعلام، واستبدل بما يكفي "وسائط" جديدة المضادات الحيوية لتغطية اللوحة.
  11. تغيير الوسائط 3 × أسبوعيا، يسفط وسائل الإعلام القديمة مع خط فراغ وماصة باستور، والاستعاضة بما يكفي وسائط جديدة لتغطية اللوحة. بعد 5 أيام على "وسائط المضادات الحيوية"، تغيير وسائط الإعلام إلى "التوسع في وسائط الإعلام"، والاستمرار في استبدال ثلاث مرات أسبوعيا.
    ملاحظة: خطر تلوث مرتفع في الأسبوع الأول من الثقافة. الاحتفاظ بعينات جديدة في حاضنة منفصلة التقليل من مخاطر التلوث عبر.
  12. تحقق نمو الخلية عدة مرات أسبوعيا. مرة واحدة خلايا حوالي 70-80% روافد، والمضي قدما إلى خلايا المرور.

6-مرور هني الخلايا

  1. إعداد حل التربسين 0.1% في حمض الإيثيلين (يدتا).
    ملاحظة: الحذر في التعامل مع التربسين، الذي هو الجلد، والجهاز التنفسي، وإزعاج العين.
    1. تزن 15 ملغ التربسين من بنكرياس الخنزير في أنبوب مخروطي.
    2. وزن 56 ملغ يدتا في أنبوب مخروطي منفصل.
    3. في مجلس الوزراء، والسلامة البيولوجية نقل التربسين وادتا إلى زجاجة يعقم 250 مل. استخدام قاسمة صغيرة من المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS) شطف أنابيب التربسين/يدتا لضمان نقل كاملة.
    4. إضافة PBS العقيمة تحقيق حل إجمالي 150 مل. إغلاق غطاء محكم.
    5. احتضان الحل التربسين في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب تماما. تحقق من كل 15 دقيقة وإزالتها على الفور مرة حل.
      ملاحظة: لا تترك دون رادع لفترات طويلة من الزمن (مثلاً، بين عشية وضحاها)، كما سيتم تجريدها التربسين في الحل إذا كانت ساخنة لفترة طويلة جداً.
    6. تنظيف زجاجة ببخاخ 2-3 من الإيثانول 70% والعودة للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    7. تصفية الحل يدتا التربسين 0.1% إلى جديدة, عقيمة 250 مل، 0.22 ميكرومتر قارورة مرشح الدائرة العامة باستخدام إرشادات الشركة المصنعة وتعليم مع المحتويات والتاريخ.
    8. تخزين يدتا التربسين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد، تجاهل إذا الملبدة بالغيوم.
  2. تجمع الوسائط التمايز والحل يدتا التربسين 0.1% و PBS العقيمة إلى درجة حرارة الغرفة ما يزيد على 30 دقيقة نظيفة مع الإيثانول 70% ونقل للسلامة الأحيائية نظيفة مجلس الوزراء.
  3. في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، استخدام خط فراغ وماصة باستور لنضح وتجاهل وسائل الإعلام من طبق استنبات الأنسجة. أغسل الطبق إضافة ويحوم يسفط 5 مل من برنامج تلفزيوني استخدام ماصة نظيفة مصلية.
  4. استخدام ماصة مصلية 5 مل، إضافة 5 مل من محلول يدتا التربسين 0.1% إلى الطبق زراعة الأنسجة والعودة إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 5 دقائق.
  5. تصور الخلايا في مجهر مقلوب في X 4-10. تحقق من أن الخلايا فصل من الطبق وتصبح جولة، وتعويم. اضغط بلطف إلى جانب الطبق الثقافة إزاحة الخلايا، و/أو إعادة احتضانها لمدة 5 دقائق إضافية حتى يتم فصل خلايا معظم.
    ملاحظة: أخذ الحيطة والحذر بسرعة إزالة الخلايا مرة واحدة منفصلة عن الطبق الثقافة؛ التعرض المطول إلى 0.1% يدتا التربسين سوف يضعف الخلية البقاء.
  6. استخدام ماصة 10 مل مصلية، إضافة 5 مل من "التوسع في وسائل الإعلام" للطبق وجمع كافة المحتويات السائلة (المجموع 10 مل) في أنبوب مخروطي المسمى، وتعقيم 50 مل.
  7. إذا كانت الخلايا تظل ملتصقة بالطبق الثقافة، كرر الخطوات 6.6 من خلال 6.4 إلى مرتين، جمع محتويات في أنبوب مخروطي الشكل نفسه.
    1. إذا كانت الخلايا تظل ملتصقة بالطبق الثقافة بعد ثلاث جولات من التعرض لحل التربسين، باستخدام مكشطة خلية عقيمة لطف إزالة ما تبقى. بعد إلغاء الطبق، يغسل كاشطة وطبق مع 5 مل من "التوسع في وسائل الإعلام" وجمع في أنبوب مخروطي المسمى نفسه.
      ملاحظة: إذا كان باساجينج الماغنيسيوم، تعديل هذا الإجراء القيام تريبسينيزيشن تفاضلية. بعد إضافة التربسين الحل (الخطوة 6.4.)، تحقق الطبق كثيرا حتى فصل الخلايا الليفية (عادة 1-2 دقيقة)، ترك الخلايا الظهارية مضلع فقط تعلق على الطبق. جمع وجانبا هذا طافية، التي يمكن أن باساجيد إلى الأمام للتوسع. كرر الخطوات 6، 4-6، 6 استخدام نفس الحل التربسين، وجمع الخلايا الظهارية المتبقية فقط لثقافة كروي.
  8. الطرد المركزي المخروطية في 360 x ز لمدة 5 دقائق و 4 درجة مئوية. نضح وسائل الإعلام من مخروطية الشكل.
  9. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من "التوسع في وسائل الإعلام" وعدد الخلايا باستخدام هيماسيتوميتير.
  10. بمجرد تحديده كمياً، ويمكن تقسيم الخلايا إذا لزم الأمر، وأما باساجيد الأمام على طبق ثقافة جديدة (بما في ذلك إعداد الثقافة المشارك تنتجها الخلايا الليفية، والخطوة 3، وطلاء الخلايا للتوسع، خطوات 5.9-5.12) أو مثقف الماغنيسيوم (الخطوة 7).
    ملاحظة: إذا باساجينج إلى طبق ثقافة جديدة للتوسع، بكثافة بذر من 0.5-1 × 10 من المستحسن6 خلايا في صحن P100.

7-زرع الخلايا للثقافات كروي هني

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات في هذه الخطوة، عدا الطرد المركزي، في مجال السلامة الأحيائية نظيفة مجلس الوزراء.

  1. ذوبان الغشاء المصفوفة على الجليد لإرشادات الشركة المصنعة (100 ميليلتر الواحدة كروي جيدا).
    ملاحظة: النظر في جعل مختبرين 500 ميليلتر العقيمة مصفوفة الغشاء على الاستلام؛ هذا المبلغ سوف البذور صفيحة 4-بئر واحدة.
  2. فصل عدد مناسب من الخلايا خلطات تريبسينيزيد، باساجيد (من الخطوة 6.9) لتركيز نهائي من الخلايا 500,000 الواحد مل المصفوفة. لوحة 4-حسنا، استخدام الخلايا 200,000. جمع في أنبوب 1.5 مل.
  3. الطرد المركزي خليط الخلية ووسائط الإعلام في 360 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تماما، ولكن بعناية نضح وتجاهل الوسائط باستخدام ماصة 1 مل، مع الحرص على عدم تعكير بيليه الخلية.
  4. استخدام تلميح ماصة 1 مل، إضافة 100 ميليلتر الواحدة والمخطط لها جيدا من المصفوفة غشاء الطابق السفلي للأنبوبة 1.5 مل تحتوي على الخلايا. الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.
  5. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بعناية ودقة ريسوسبيند الخلايا في المصفوفة غشاء الطابق السفلي. التحرك بسرعة لتفادي تصلب المصفوفة. تجنب تماما إفراغ نصيحة ماصة لضمان عدم إدخال فقاعات الهواء في المزيج ماتريكس/خلية.
  6. البذور 100 ميليلتر مصفوفة مختبرين في كل من لوحة الثقافة التلقيح الصناعي 4-جيدا جيدا.
    1. استخدام زوج نظيفة من مقص، تقليم قبالة القاصي 3-4 مم من طرف ماصة 200 ميليلتر.
    2. استخدام تلميح المشذبة، بعناية "الماصة؛" 100 ميليلتر من الخليط خلية/مصفوفة داخل المركز من كل بئر. "الماصة؛" ببطء، مع الهدف المتمثل في جعل مصفوفة واحدة "إسقاط" في المركز من كل بئر. الانخفاض ينبغي أن تظل كروي، ويجب أن لا تلمس جوانب البئر. عندما تتحرك اللوحة، القيام بعناية بحيث تجنب الإخلال بهذه القطرات.
    3. احتضان قطرات مصفوفة الغشاء في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 30 دقيقة، حتى الصلبة.
    4. بدقة "الماصة؛" 500 ميليلتر من "التمييز بين وسائل الإعلام" في كل بئر، مع الحرص على عدم الإخلال بإسقاط مصفوفة. تأكد من أن تغطية وسائل الإعلام فقط المصفوفة الإسقاط وإضافة المزيد إذا لزم الأمر.

8-يميز وتنضج الماغنيسيوم هني

  1. استخدام تلميح ماصة 1 مل، بلطف نضح جميع وسائل الإعلام من الآبار؛ تجنب يسفط المصفوفة التي سوف تدمر الماغنيسيوم في ذلك الجزء من المصفوفة، على الرغم من أن أي الماغنيسيوم تركت وراءها قد تظل قابلة للتطبيق.
  2. استخدام تلميح ماصة طازجة 1 مل، بلطف إضافة 500 ميليلتر من التمييز بين وسائل الإعلام إلى البئر حولها المصفوفة. لا تلمس المصفوفة مع ماصة وتجنب الإخلال بإسقاط المصفوفة.
  3. العودة الماغنيسيوم للحاضنة في 37 سج و 5% CO2 للنمو المستمر. كرر الخطوات من 8.1 إلى 8.3 ثلاث مرات أسبوعيا.
  4. تقييم مورفولوجيا كروي يوميا تحت مجهر مقلوب في 20 س. الماغنيسيوم ينبغي أن تكون في حدود 3-5 أيام طلاء، وتصل إلى مرحلة النضج في غضون 10 أيام تقريبا.

9-بريتريت، وتنشيط، وصورة الماغنيسيوم هني للتحليل

  1. بريتريت الماغنيسيوم كما هو مطلوب قبل التصوير كما هو موضح سابقا30.
    ملاحظة: للمعالجة VX809، إضافة 3 ميكرومتر من VX809 لوسائل الإعلام عن ح 48-72 قبل التصوير. مزيج 1 ميليلتر من 10 مم VX809 الأوراق المالية (انظر الجدول المواد) في 3.3 مل من وسائل الإعلام لهذا التركيز.
  2. تغيير كل من الماغنيسيوم إلى 1 مل الطازجة التمايز وسائط، بما في ذلك المعالجة (خطوات 8.1-8.3) قبل التصوير الماغنيسيوم.
  3. يعد تحفيز جديدة حلول المخدرات (فورسكولين، 3-إيسوبوتيل-1-زانتين [إيبمكس]، VX770، و 172 المانع CFTR [Inh172]) من الأرصدة السمكية (انظر الجدول المواد). فورسكولين/إيبمكس، إضافة 1 ميليلتر من كل الأسهم إلى 98 ميليلتر من الماء المعقم في واحد يسمى أنبوب 1.5 مل. VX770 و Inh172، إضافة 1 ميليلتر من كل الأسهم إلى 99 ميليلتر من الماء المعقم في أنابيب مل 1.5 المسمى منفصلة. جعل إجمالي حجم يتيح 50 ميليلتر من الحل لكل منها اختبارها. إعداد الحلول تحت ظروف معقمة في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  4. نقل لوحة كروي لدائرة المحتضنة لتعيين إلى 37 درجة مئوية و 5% CO2، التي شنت على مجهر مقلوب مزودة ببرامج التقاط الصور الإلكترونية ومرحلة ميكانيكية للتكيف س وص. قم بتشغيل المجهر والكاميرا، فضلا عن الكمبيوتر التصوير.
  5. التقاط الصور خط الأساس من الماغنيسيوم في بئر واحدة.
    1. فتح برنامج التقاط الصور (5.5 سليديبوك للإرشادات أدناه). بمجرد تهيئة، فتح ملف جديد بواسطة النقر فوق "ملف"، ثم "جديد". اسم الملف التالي، وانقر فوق "حفظ".
    2. بعناية إزالة غطاء لوحة الثقافة ومركز قطره مصفوفة واحدة على الهدف.
    3. بدءاً من أعلى انخفاض مصفوفة، نقل في شبكة للبحث عن الماغنيسيوم في 20 x التكبير بالمجهر العدسة. تركيز أعلى وأسفل لالتقاط في المجال عند نقطة أوسع. إضافة تعليق توضيحي موقع كل كروي على خريطة لإسقاط المصفوفة إعادة تعريف وبعد التصوير.
    4. في البرنامج، انقر فوق "التقاط الصور". للتعرض، حدد "الدليل" وقم بإدخال 50 السيدة التأكد من إعدادات أخرى مناسبة (عامل بن: 1 x 1، 512 w: h: 512 والعاشر والإزاحة Y: 0). أدخل اسماً مناسباً لكل صورة في مربع "الاسم" (مثلاً، كروي 1 خط الأساس). انقر فوق "ابدأ" لعرض صورة حية، و "حفظ" لالتقاط صورة خط أساس.
    5. كرر الخطوات 9.5.1-9.5.4 حتى يتم التوصل إلى الهدف رقم، أو إسقاط مصفوفة كاملة يتم تصويرها.
      ملاحظة: يمكن الكشف عن الاختلافات المجموعة مع عدد قليل من الماغنيسيوم 3-5 في حالة، ومع ذلك، فقد أصبح ممارستنا صورة الماغنيسيوم 10 أو أكثر كل شرط لزيادة الطاقة. تقلب المقايسة يتجلى في الشكل 2 من المقطع "الممثل النتائج"، مع عينات من 8-10 الماغنيسيوم كل هذا الموضوع كمثال.
  6. حفز الماغنيسيوم.
    1. استخدام ماصة 200 ميليلتر، إضافة 50 ميليلتر من المخدرات التحفيز المناسب في وسائل الإعلام داخل البئر، مع الحرص على عدم الإخلال بالمصفوفة.
      ملاحظة: بعد هذا الوقت تمييع (ميليلتر 50 إلى 500 ميليلتر لوسائل الإعلام)، تركيز المخدرات النهائي سيكون: فورسكولين 10 ميكرومتر، إيبمكس 100 ميكرومتر، VX770 1 ميكرومتر، Inh172 10 ميكرون.
    2. مخيم فقط، لإضافة فقط فورسكولين/إيبمكس.
    3. مخيم + VX770، أضف فورسكولين/إيبمكس أولاً، ثم VX770 بعد 2 دقيقة.
    4. لتحول دون شروط، إضافة Inh172 أولاً، ثم فورسكولين/إيبمكس بعد 2 دقيقة.
  7. فورا بعد التحفيز، ورصد كروي تورم بتصوير timelapse ح 1. في البرنامج، انقر فوق "التقاط الصور". انقر فوق "Timelapse"، وتعيين الفاصل الزمني إلى 30 ثانية، لمدة 60 دقيقة أدخل اسم مناسب وانقر فوق "حفظ" لبدء timelapse.
    ملاحظة: معيار timelapse لالتقاط الصور من كروي واحد كل 30 ثانية لضمان فيديو عالية الجودة. بدلاً من ذلك، تنفيذ التقاط التكبير أقل من البئر كامل (مثلاً 4 X)، وعدد أقل من الصور التي تم التقاطها إذا رغبت في ذلك. إذا كان يتم استخدام مرحلة الآلي، أداء timelapse الماغنيسيوم كل استخدام الإحداثيات المحددة مسبقاً؛ خلاف ذلك، استخدم timelapse من مجموعة فرعية الماغنيسيوم لتقديم استعراض نوعي تورم وضمان أي قضايا منهجية تنشأ أثناء التصوير (مثلاً، مفرزة مصفوفة من البئر).
  8. فورا عند انتهاء الصورة timelapse ح 1، التقاط الصور بعد التحفيز من الماغنيسيوم جميع (كل خطوة 9.5) باستخدام الخريطة التي تم إنشاؤها في الخطوة 9.5.3.
    1. راجع الصور التحفيز المسبق لضمان استخدام نفس الطائرة من التركيز لمتابعة الصور (نوعية التنسيق المحيطة بالخلايا أو الماغنيسيوم الحطام إلى حد كبير تيسير هذه العملية).
    2. حفظ الملفات بتعليق توضيحي المزدوجة من الخطوة 9.5.4 (مثلاً، "كروي 1 التحفيز" فيما بعد).
      ملاحظة: إكمال هذه الخطوة فورا بعد timelapse، كما قد يستمر الماغنيسيوم إلى تضخم.
  9. استبدال وسائط الإعلام في المصورة جيدا مع الطازجة "التمايز الوسائط".
  10. كرر الخطوات من 9.5 من خلال 9.9 لكل بئر/شرط، ضبط المخدرات التحفيز كما هو مبين للظروف التجريبية.
  11. وبمجرد الانتهاء من تصوير كافة، عودة الماغنيسيوم للحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    ملاحظة: اعتماداً على العقم الدائرة مجهر المحتضنة، يمكن أن تلوث بعد التحفيز الماغنيسيوم شائع جداً. أما إبقاء الماغنيسيوم المصورة في حاضنة منفصلة، للتقليل من مخاطر التلوث عبر، أو تجاهل الماغنيسيوم فورا بعد التصوير.

10-تحليل الصور هني كروي

  1. تصدير الصور التي تم التقاطها جميعا إلى تنسيق متوافق مع برنامج تحليل الصور. في البرنامج، انقر فوق "عرض"، قم بالمرور فوق "التصدير"، وحدد "الافتراضي وجهات النظر من جميع الصور كالمشاجرة... حفظ إلى القرص الثابت أو محرك أقراص فلاش للتحليل.
    ملاحظة: A برمجيات التحليل التجاري (جدول المواد) وملفات.tiff أداء جيدا، ويرد هنا، على الرغم من أن التحليل يمكن أن يؤديها أيضا استخدام الأنظمة الأساسية الأخرى. عند تسمية الملفات، ينبغي أن يكون الموظفين تحليل الصور أعمى للظروف التجريبية، ولكن إدراكا للصور التي يتم إقران (ما قبل وما بعد التحفيز) لضمان تحليل معادلة.
  2. باستخدام برمجيات التحليل، تحدد منطقة لومينال كل صورة كروي وتصديرها إلى برنامج تحليل بيانات.
    1. برمجيات تحليل مفتوحة. انقر فوق "ملف"، ثم "فتح" وانتقل إلى المجلد ملف يحتوي على صور كروي. حدد جميع الصور للتحليل، وانقر فوق "فتح".
    2. انقر فوق "قياس" وحدد "القياسات المنطقة". ضمن مربع الحوار "القياسات المنطقة"، حدد دروبتاب "التكوين" وتأكد من اختيار مربعات "اسم الصورة" و "المنطقة".
    3. انقر فوق "تسجيل الدخول" وحدد "فتح سجل بيانات". انقر فوق "موافق" في الملف اسم ومربع الحوار "سجل البيانات" تبعاً لذلك (مثلاً، الشرط العاشر، تاريخ). هذا سوف نقل جميع القياسات إلى جدول بيانات.
    4. حدد الزر "تتبع المنطقة" أداة وتتبع بدقة التجويف كروي في الصورة الأولى للتحليل. في مربع الحوار "المنطقة القياس"، انقر فوق "سجل بيانات" لتسجيل القياس إلى Excel.
    5. كرر الخطوات 10.2.2-10.2.4 حتى يتم تحليل جميع الماغنيسيوم.
  3. حساب النسبة المئوية لتغيير (100 * [بوست-stim-خط الأساس] ÷ الأساس) في منطقة لومينال من خط الأساس لكل كروي الفردية صورة الزوج، وجمع البيانات للتحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب إرفاق الطبق الثقافة الاهناسى وتشكل الجزر الصغيرة من الخلايا ضمن ح 72 من البذر؛ وترد أمثلة لتشكيل الجزيرة جيدة وسيئة في أسبوع واحد في الشكل 1A و 1B، على التوالي. وينبغي توسيع هذه الجزر لتغطية الطبق على مدى 15-30 يوما. عينات صغيرة أو دون المستوى الأمثل قد يستغرق وقتاً أطول، وغالباً لن تسفر عن الماغنيسيوم مفيدة. ويتجلى التلوث بالعوامل المعدية الإعلام الأصفر/غائم عميقة، فشل الخلايا لإرفاق إلى الطبق الثقافة، و/أو التصور المباشر للفطريات/البكتي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول توليد خلايا الآنف المستمدة من المريض كروي الثقافات قادرة على إنتاج نموذج فردي، ومحددة للدالة CFTR. وهناك العديد من الخطوات الرئيسية في العملية التي ينبغي أن يشارك عن كثب لتجنب صعوبة. الأول هو الحصول على عينة جيدة من آنف المريض. يجب أن يكون نموذج جيد > الخلايا 50,000، محدودة مخاط/الحطام، ويكون جاهزاً للمعالجة ضمن ح 4 (على الرغم من النجاح أيضا يمكن تحقيقها بسهولة مع بين عشية وضحاها الشحن على الجليد). الممارسة اكتساب عينات مع كورت أو فرشاة بدراسة الموظفين ضروري، الذي يسر بالتركيز المبكر اقتناء عينة في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل وأيده "المداواة مؤسسة التليف الكيسي"، منح رقم CLANCY14XX0، ومن خلال "مؤسسة التليف الكيسي"، منح رقم CLANCY15R0. الكتاب أود أن أشكر رأي كريستينا لمساعدتها في توظيف المريض والرقابة التنظيمية. الكتاب أيضا نود أن نشكر الفريق العامل هني، التي تدعمها "مؤسسة التليف الكيسي"، الذين ساعدوا في توليد قدرات الثقافة هني: "براتشر بريستون"، القطن كالفن، مارتينا جينتزش، إليزابيث جوسيلوف، ومايكل ميربورج، ديف نيكولز، راندل سكوت وروى ستيف وزاي-سليمان مارتي وتوجل كاثرين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنبوب إيبندورفالولايات المتحدة الأمريكية العلمية 4036-3204
150 مل قارورة مرشحMidsci TP99150لتصفية الوسائط
15 مل أنبوب مخروطيMidsci TP91015
1 لتر قارورة مرشحMidsci TP99950لتصفية الوسائط
35 مم طبق زجاجيالقاع MatTek CorporationP35G-0-20-Cاختياري
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) FisherScientific   ؛AC228420010 تحضير محلول مخزون 100 ملي من 22.0 مجم في 1 مل من DMSO
50 مل أنبوب مخروطيMidsci   TP91050
AccutaseInnovative Cell Technologies، Inc.AT-104محلول انفصال الخلية
الأدينينسيجما-ألدريتشA2786-25Gانظر الجدول 1
أمفوتريسين بسيجما ألدريتشA9528-100 ملغانظر الجدول 1
مستخلص دماغ البقر (9 مجم / مل)Lonza & nbsp ؛CC-4098انظر الجدول 2
Ceftazidime hydrateSigma-AldrichC3809-1Gانظر الجدول 1
كاشطات الخلايا 20 سم   ؛Midsci TP99010
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430قم بإعداد محلول مخزون 10 ملي من 4.0 مجم في 1 مل من سم الكوليرا DMSO
B (من ضمة الكوليرا)Sigma-AldrichC8052-.5MGانظر الجدول 1
CYB-1Packaging CorporationCYB-1فرشاة علم الخلايا
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) / F12 Hepes  لايف تكنولوجيز 11330-057قاعدة متوسطة ؛ انظر الجدولين 1 و 2
عامل نمو البشرة (بروتين بشري مؤتلف ، خال من أصل حيواني) PHG6045Thermo Fisher Scientificانظر الجدول 1
EpinephrineSigma-AldrichE4250-1Gانظر الجدول 2
EthanolFisher Scientific  2701
الإيثانولامينسيجما ألدريتشE0135-500MLمحلول 16.6 ملي متر ؛ انظر الجدول 2
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) TCIأمريكا   ؛E0084
مصل الأبقار الجنيني (FBS عالي الأداء)Invitrogen   ؛10082147انظر الجدول 1
فورسكولينسيجما - ألدريتشF6886-50إعداد 10 محلول مخزون ميم من 4.1 ملغ في 1 مل من DMSO
النمو المخفضة MatrigelCorning, Inc.356231مصفوفة الغشاء القاعدي لعامل النمو المخفف (GFR) من Corning Matrigel ، خالية من الفينول الأحمر ، خالية من LDEV ، 10 مل.
مقياس الدمHausser Scientific1483
محلول الكولاجين البشري ، النوع الأول (VitroCol ؛ 3 مجم / مل) محلولالكولاجينBioMatrix5007-A
المتقدم HyClone (المعروف أيضا باسم FetalClone II)   ؛جنرال إلكتريك للرعاية الصحية SH30066.03HIانظر الجدول 2
تقنيات الخلايا الجذعيةللهيدروكورتيزون07904انظر الجدولين 1 و 2
الأنسولين ، المؤتلف البشري ، محلول الزنكLife Technologies  12585014محلول 4 مجم / مل ؛ انظر الجدول 2
التلقيح الاصطناعي 4 آبار ، NUNC غير المعالج(عبر فيشر العلمي)12566350صفيحة 4 آبار للكرويات ؛ حجم بئر مماثل للوحة 24 بئرا
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001Gالليفية الجنينية للفئران المشععة
Metamorph 7.7الأجهزة الجزيئيةبرنامج التحليل. https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software للحصول على اقتباس
توقفتأوليمبوس IX51 المجهر المقلوبشركة أوليمبوسعن مجهر التصوير. الاستبدال: أوليمبوس IX53 ، https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  ؛ للحصول على اقتباس
StrepLife Technologies 15140122انظر الجدول 2
PhsophoryletheanolamineSigma-AldrichP0503-5Gانظر الجدول 2
حمض الريتينويكسيجما-ألدريتشR2625-50MGانظر الجدول 2
RhinoprobeArlington Scientific، Inc.96-0905مكشطة الأنف
Slidebook 5.53i ، ابتكارات التصوير الذكيةبرنامج التصوير. الاستبدال: Slidebook 6 ، https://www.intelligent-imaging.com/slidebook للحصول على اقتباس
محلول ملحي معقم من الفوسفات (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
ماء معقمSigma-AldrichW3500-6X500ML
طبق زراعة الأنسجة 100منتجات تكنو بلاستيك93100طبق زراعة الأنسجة للتوسع
TobramycinSigma-AldrichT4014-100MGانظر الجدول 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) Lonza CC-4205انظر الجدول 2
TriiodothryonineSigma-AldrichT6397-1G3،3 & ، 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم   [T3]; انظر الجدول 2
التربسين من لحم الخنزير والبنكرياسسيجما ألدريتشT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (عبر فيشر العلمية) NC039302420 مل مسحوق مجفف بالتجميد ؛ انظر الجدول 2
فانكومايسين هيدروكلوريد من Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5Gانظر الجدول 1
VX770Selleck ChemicalsS1144تحضير محلول مخزون 1 ملي مولار بمقدار 0.4 مجم في 1 مل من DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565شراء أو إعداد محلول مخزون 10 ملي مولار بسعة 4.5 مجم في 1 مل من DMSO
Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد   ؛ مثبط الصخور إنزو لايف ساينس ALX-270-333-M025 انظر الجدول 1
Medical عامل طبق الخلايا ، Pen توقف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375(2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802(2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842(2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CFTR cAMP CFTR

مقالات ذات صلة