يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Microinjection "روتوورم الذرة الغربية"، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، والأجنة لتحويل الخط، أو تحرير الجينوم كريسبر/Cas9

7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57497

⸱

أبريل 27, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم البروتوكولات للذرة الغربية بريسيلولار ميكروينجيكتينج وجمع الأجنة روتوورم غرض أداء الاختبارات الوظيفية الجينومية مثل تحويل الخط وتحرير كريسبر/Cas9-الجينوم.

الملخص

روتوورم الذرة الغربية (فكر) هو الآفات هامة من الذرة، وهو معروف لقدرته على سرعة التكيف مع استراتيجيات إدارة الآفات. على الرغم من أن تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) ثبت أن تكون أداة قوية لدراسة البيولوجيا فكر، لها حدودها. على وجه التحديد، [رني] نفسها عابرة (أي لا يؤدي إلى وراثة مندلية طويلة الأجل من النمط الظاهري المرتبطة بها)، وذلك يتطلب معرفة تسلسل الحمض النووي للجين المستهدف. الأخير يمكن أن يكون الحد إذا كان النمط الظاهري لمصلحة سيطرة الجينات المصانة سيئة، أو حتى رواية، لتحديد أهداف مفيدة سوف تكون صعبة، إذا لم يكن من المستحيل. ولذلك، ينبغي توسيع عدد الأدوات في الجينوم مربع الأدوات لوكر بوضع الأساليب التي يمكن استخدامها لخلق سلالات متحولة مستقرة وتمكين دراسات استقصائية مستقلة عن تسلسل الجينوم وكر. هنا، نحن بالتفصيل الأساليب المستخدمة في جمع وميكروينجيكت بريسيلولار فكر الأجنة مع الأحماض النووية. بينما البروتوكولات المبينة في هذا التقرير تهدف إلى خلق فكر محوره وراثيا، تحرير كريسبر/Cas9-الجينوم يمكن أيضا إجراء باستخدام نفس البروتوكولات، مع الفرق الوحيد هو تكوين الحل حقن الأجنة.

المقدمة

الذرة الغربية روتوورم (فكر)، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، هو الآفات هامة من الذرة1. من المثير للاهتمام، يبدو فكر التغلب على مراقبة تدابير أكثر سرعة من الآفات الزراعية الأكثر نظراً لأنها ليس فقط التكيف مع الناحية الفسيولوجية ولكن أيضا سلوكيا2،3،،من45، 6-على مدى العقد الماضي، تم التحقيق كأسلوب تحكم محتملة لفكر7،8تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني])، أداة الجينوم وظيفية قوية، وتستخدم أيضا كوسيلة لدراسة الجينات الدالة9. ومع ذلك، بينما [رني] كثيرا ما يؤديها microinjection من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) في الأنواع الأخرى، أمر نادر في وكر [رني] على أساس حقن. وفي الواقع، هناك فقط بضعة تقارير من [رني] عبر microinjection من دسرنا في فكر9. والسبب أن فكر يمكن تحقيق مستويات عالية من الجينات ضربة قاضية عن طريق ابتلاع دسرنا7،10، حتى تسمح بدراسة تأثيرات جنينية بتغذية دسرنا إلى الأم11. بينما يجعل هذا الأسلوب فكر مادة ممتازة لتحليل الجينوم الوظيفي عن طريق [رني]، قد تباطأ التقدم المحرز في وضع منهجيات ل microinjection الجنينية في هذه الأنواع.

وعلى الرغم من القوة [رني]، وهناك عدد قليل من العيوب. على سبيل المثال، ليست كل الجينات الرد على قدم المساواة على [رني]. ويمكن جعل هذا التغير تفسير النتائج تحليل الجينوم الوظيفي أكثر صعوبة. أيضا, [رني] عابرة ولا تولد الطفرات الموروثة. من ناحية أخرى، تحول الفعل، أداة الجينوم وظيفية أخرى، يمكن أن تولد الطفرات الموروثة عن طريق إدخال عنصر قابلة ملحوظ في12،الجينوم13. وهذا يجعل التحول germline أداة ممتازة لخلق سلالات متحولة لاستخدامها في الدراسات الوراثية على المدى البعيد. يمكن أيضا استخدام التحول إنقاذ طفرة بتقديم نسخة وظيفية من الجينات إلى جينوم متحولة14. وعلاوة على ذلك، تحول الخط هو حجر الزاوية لمجموعة متنوعة من التقنيات الوراثية الجزيئية. بالإضافة إلى انقطاع و/أو إنقاذ وظيفة الجينات، يمكن استخدام تحويل germline محسن محاصرة15والجينات الملائمة16، على أساس Gal4 التعبير حمل خارج الرحم17والطفرات على نطاق الجينوم18.

في الآونة الأخيرة، تم تطوير أدوات تمكن من تحرير الجينوم المتطورة. وتشمل هذه الأدوات Nucleases المستجيب أكتيفاتورليكي النسخ (TALEN) و19،نظام كريسبر/Cas9-نوكلاس20. وميزة هذه الأدوات الجديدة أنها توفر الباحثين القدرة على حمل فاصل الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ما يقرب من أي موقع داخل تقريبا أي الجينوم. بمجرد فعل، يمكن إصلاح هذه الفواصل أما نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل، الذي يمكن أن يعرض عمليات الحذف أو الإدراج في الجينات المستهدفة، أو من خلال إصلاح الموجه من التماثل، الذي يمكن حفز حضور بناء هندسيا، استبدال الجينات كاملة أو المناطق الوراثية21،22. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق microinjection الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي و/أو البروتين في أجنة صغار جداً.

الأهم من ذلك، خلافا دسرناس المستخدمة ل [رني] والأحماض النووية والبروتينات المستخدمة للخط التحول والجينوم التحرير لا يمكن بسهولة عبر أغشية الخلية. ولذلك، يجب أن microinjection بلازميد السلطات الوطنية المعينة، مرناس، و/أو البروتينات تجري خلال مرحلة بلاستوديرم المخلوي (أي قبل الجنين الحشرات سيلولاريزيس). وهذا يجعل توقيت حقن عامل حاسم. على سبيل المثال، في melanogaster المورفولوجية، تحتاج الأجنة بالحقن خلال ساعتين بعد وضع البيض12. ولذلك، يجب أن تراعي وضع بروتوكول microinjection الجنينية ناجحة لفكر أفضل الظروف لوضع البيض الإناث، فضلا عن الأسلوب الأمثل لجمع كميات كافية من الأجنة بريسيلولار.

جهد لتحقيق مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية الجزيئية للتأثير على فكر الأحياء يتطلب تطوير أساليب جمع وميكروينجيكتينج بريسيلولار فكر الأجنة. هنا نقدم الإرشادات التفصيلية، جنبا إلى جنب مع نصائح والخدع، لمساعدة الآخرين على استخدام التقنيات المستندة إلى التحول في فكر للبحث. بالإضافة إلى توسيع نطاق التكنولوجيات المحورة وراثيا لفكر لاستخدامها في الدراسات الجينومية الوظيفية، تمكن هذه التقنيات أيضا استراتيجيات مكافحة الآفات الجديدة القوية مثل الجينات محرك23،24 لفحصها في هذه المهمة اقتصاديا مكافحة الآفات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-مستوى مستعمرة تربية البالغين فكر

  1. الحصول على كمية كافية من فكر الكبار (500-1,000) من مختبر الشركة أو بحوث موثوق بها (انظر الجدول للمواد على سبيل مثال) ووضع في قفص3 30 سم.
    ملاحظة: استخدام سلالة غير ديابوسينج ينصح بشدة.
  2. إعداد فكر مصطنع يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة النظام الغذائي وصب طبقة سمكها سم 1 في حاوية أوز 38 (انظر الجدول للمواد). بعد خلط، تخزين النظام الغذائي غير المستخدمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
  3. وضع طبق بتري (100 × 15 ملم) مع نظام غذائي الكبار (10-15 جم) في قفص3 30 سم. إضافة نظام غذائي أكثر عندما تكون المواد الغذائية منخفضة أو الجافة.
  4. وضع قارورة (300 مل) بالماء، مغطاة كرة القطن، والذي يستخدم للاحتفاظ في مكان لفة القطن (6 "× 3/8")، تخدم كمصدر لمياه. تغيير الماء عند تشغيله منخفضة.
  5. 14:10 خفيفة دورة في حشرة تربية الحاضنة والحفاظ على فكر في 26 درجة مئوية مع رطوبة 60%.

2-الجنين جمع والمحاذاة

  1. جعل دائرة جمع بيض لاستخدام أجار 1% في المياه في تعقيم 100 × 15 ملم2 طبق بيتري. تخزين في 4 درجات مئوية بعد أجار يتصلب.
  2. لجمع البيض وضعت حديثا، قم بوضع طبقة واحدة من ورق الترشيح، تليها 4 طبقات من القماش القطني (كل قطع بحجم) على سطح أجار (الشكل 1A).
    ملاحظة: القماش القطني يمكن إعادة استخدامها، بعد غسلها في التبييض ويعقم، ولكن ليس من الضروري القيام بذلك لأول استخدام. لا يمكن إعادة استخدام ورق الترشيح ولا تحتاج إلى تعقيم.
  3. ضع لوحة جمع البيض في قفص فكر في وقت متأخر في اليوم قدر الإمكان (في نهاية يوم العمل) وتغطي بورق ألمونيوم خيمة. الإجازة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: وجود الأضواء على من 10:00 ص إلى 12: 00 صباحا (ح 14) التأخير بيضة زرع، مما يسهل جمع البيض الأصغر سنا ل microinjection دون الحاجة إلى موظفي المختبر على مكان الدائرة جمع في قفص في ساعة متأخرة من الليل.
  4. إزالة الدائرة جمع البيض حوالي 8 أو 09:00 ص
  5. استخدام الملقط لالتقاط 1 طبقة من القماش القطني في وقت ومكان في كوب (500 مل) من الماء. أغسل البيض الخروج من القماش القطني بالتحريك بلطف (الشكل 1 باء وجيم 1).
  6. استخدام ماصة لمبة نقل البيض إلى آخر كوب (500 مل) من الماء. كرر x 2-3 لتنظيف البيض.
  7. استخدام ماصة لمبة لنقل البيض على ورق الترشيح (الشكل 1) مع التقليل من كمية المياه المرحل.
  8. يضع الورقة مسطحة (الشكل 2A) قطع السوداء تصفية الورق إلى شرائح واسعة كما الشريحة الزجاجية والشريط بثبات إلى الشريحة للتأكد.
    ملاحظة: ورقة تصفية سوداء يساعد على تحسين الرؤية تحت المجهر بتقليل كمية الضوء المنعكس.
  9. تطبيق الغراء غير سامة (انظر الجدول للمواد على سبيل مثال) إلى ورقة تصفية في الخطوط الدقيقة (الشكل 2). الإبقاء على أسطر الغراء أرق من القطر من البيض لتجنب الحصول على البيض المغلفة بالغراء.
  10. استخدام فرشاة غرامة لتحرك بلطف فكر البيض واحداً تلو الآخر من على ورق الترشيح إلى السطر الغراء. في محاولة لوضع البيض على الغراء قبل أن يجف والحفاظ على المسافة بيضة واحدة على الأقل لبين كل بيضة.
  11. تعظيم كفاءة الحقن بوضع عدة أسطر من البيض على شريحة واحدة من ورق الترشيح (الشكل 3).
  12. بعد أن وضعت كل البيض على ورق الترشيح، انتظر حتى كافة الغراء يجف قبل microinjection.
    ملاحظة: لتحويل الخط والجينوم كريسبر/Cas9-بوساطة التحرير، حقن أجنة جميع ظهرا (12:00 م) حيث يكون الجنين أقدم القديم أي أكثر من 19 ساعة. ومع ذلك، ل [رني], هناك لا حدود زمنية لأنه، بوكر، دسرنا يمكن التنقل بين الخلايا. في الواقع، ل [رني]، الأجنة الشيخوخة قد يؤدي إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة.

3-إعداد بلازميد السلطات الوطنية المعينة والحقن بالإبر

  1. إعداد الحمض النووي بلازميد سوبيركويليد عالية الجودة باستخدام تجارية خالية من الذيفان كيت (انظر الجدول للمواد على سبيل مثال).
  2. إعداد الحل الحقن، التحقق من تركيز كل بلازميد وثم الجمع بين مساعد بلازميد (250 نانوغرام/ميليلتر التركيز النهائي)، المانحة بلازميد (750 تركيز نانوغرام/ميليلتر النهائية) والفينول الأحمر المخزن المؤقت (20% تركيز النهائي). دوامة الحل بإيجاز والطرد المركزي لمدة 3 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة يعجل الجسيمات التي يمكن أن تسد الإبرة.
  3. سحب زجاج البورسليكات الإبر (نقلت 1 مم، معرف 0.58 ملم، طول 10 سم) استخدام ساحبة ميكروبيبيتي نوع المشتعلة/براون. للتخزين، وتأمين الإبر سحبت على الوجهين شريط مثبت في طبق بتري أو حاوية أخرى واضحة.
    ملاحظة: للنظام ساحبة ميكروبيبيتي، كانت الإعدادات المستخدمة: الحرارة = 335، سن الفيل = 4، حطي = 40، DEL = 200، بول = 100.
  4. الردم إبرة حقن باستخدام مايكرو-لودر تلميح (انظر الجدول للمواد) بيبيت 0.5-1.0 ميليلتر إلى أسفل داخل الإبرة، قرب نهاية مدبب. إزالة فقاعات من طرف الإبرة في حالة حدوث أي.
  5. أدخل إبرة حقن في حامل الإبرة.
  6. فتح غيض الإبرة بكسر بلطف مع زوج خير من الملقط، أو بلطف لمس/سحب الحافة على الشريحة ساترة أو الزجاج.
    ملاحظة: الهدف هو أن يكون افتتاح أصغر التي ما زال يسمح مزيج حقن ليخرج (فتحات أصغر عموما تتطلب أعلى ضغط الحقن). لا تتطلب الإبر مشطوف هذه الخطوة نظراً لأنها مفتوحة مسبقاً.

4-microinjection والرعاية ما بعد الحقن

  1. استخدام الرسام ما يرام، بعناية الرطب سطح البيض 1-3 مع المياه المعقمة، وإدراج الإبرة وحقن الحل. حقن كل بيضة قبل أن يجف السطح. ابحث عن ظهور كمية صغيرة من اللون الأحمر داخل البيض أثناء الحقن للإشارة إلى microinjection ناجحة. سحق، أو إزالة أي البيض التي تبدو تالفة، فارغة، أو خلاف ذلك لا يمكن أن يكون حقن.
    ملاحظة: على الرغم من ضغط الحقن يختلف باختلاف حجم الإبرة أثقب، 10-13 هذه المبادرة نقطة انطلاق جيدة.
  2. بعد أن يتم حقن كل البيض، إزالة ورق الترشيح من الشريحة الزجاجية.
  3. ضع ورق الترشيح على سطح طبق أجار 1% (المذكورة أعلاه).
  4. استخدام البارافين البلاستيك فيلم لختم الطبق، ووضعت في الحشرات 26 درجة مئوية تربية الحاضنة لمدة 12 يوما.
    ملاحظة: الفيلم البارافين سيساعد على منع التلوث عبر العفن بين الأطباق. ومع ذلك، يمكن تقليل أي معاملة أخرى لمنع نمو البكتيريا والعفن بقاء الأجنة حقن.

5-استزراع وتفقيس الأجنة

  1. بدء التحقق من الأجنة 12 يوما بعد الحقن لليرقات فقست حديثا وتستمر يوميا خلال الأسابيع المقبلة 2.
  2. نقل اليرقات، باستخدام فرشاة الجميلة، إلى مربع تربية مع الذرة المنبتة والتربة.
    ملاحظة: قد ينمو العفن في طبق أجار، ولكن لا يزال سوف تفقس اليرقات في معظم الحالات. ابحث عن اليرقات بعناية داخل القالب للقبض على كل منهم. وقد نقل إلى غطاء الطبق بعض اليرقات وقد تتعثر في التكثيف.
  3. تربية اليرقات في 26 درجة مئوية بعد فكر القياسية تربية أساليب25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكان أحد الاعتبارات هامة عند وضع هذا البروتوكول المرحلة التنمية الجنينية في وقت microinjection. على وجه التحديد، يتطلب تحويل germline microinjection من السلطات الوطنية المعينة من قبل سيلولاريزاتيون الجنينية. وهذا لأن السلطات الوطنية المعينة لا يمكن بسهولة عبر أغشية الخلية. محاولات لتصور مراحل تطور فكر الجنينية استخدام وصمة عار نووية باءت بالفشل لأن يذوب ديتشوريونيشن الأجنة فكر أساسا جميع الأغشية الواقية مسؤولة عن سلامة الجنين. ومع ذلك، كان محل هذا الخط من التحقيق قبل صعوبة أخرى – الحصول ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن microinjection لوكر مع دسرناس غرض [رني] تم الإبلاغ عن9، هذا هو البروتوكول الأول إرساء أفضل الممارسات فيما يتعلق ميكروينجيكتينج بريسيلولار وكر الأجنة، عملية حاسمة لإجراء تحول الخط و/أو جينوم كريسبر/Cas9 التحرير في هذه الأنواع. Microinjection الناجح للأجنة فكر يعتمد على عوامل كثيرة، كما كفاءة التحويل. أدناه مناقشة بعض القضايا الرئيسية التي تؤثر على نتائج استخدام هذا البروتوكول للتحول germline في هذا الخنفساء.

الحصول على الأجنة بريسيلولار

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

كان يؤيد هذا العمل بمنحه من "برنامج بحوث شركة مونسانتو الذرة روتوورم المعرفة"، ومنحة رقم AG/1005 (إلى MDL والبطاقة الصفراء) وأموال بدء التشغيل إلى MDL من نكسو. المنح المقدمة من الذرة روتوورم برنامج لشركة مونسانتو البحوث المعرفة (AG/1005) والمؤسسة الوطنية للعلوم، ونادي أيده منح 1244772 المجلس رقم (MDL). الكتاب يعلن لا تضارب المصالح. نادي MDL تصور وتصميم التجارب؛ FC, PW و SP إجراء التجارب؛ نادي و MDL تحليل النتائج؛ ونادي والحرس الوطني و MDL كتب المخطوطة. ونحن نشكر تيريزا اوليري ووليام Klobasa غورسكي ستيفاني قدموه من مساعدة الخبراء في فحص فكر. كما نشكر الدكتور واد الفرنسية (وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية، والمختبر المركزي للبحوث الزراعية الشمالية، مؤسسة بروكينغز، والتنمية المستدامة) لشحنات بيض إنشاء مختبر المستعمرات وتوفير بروتوكولات تربية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ورق ترشيح نوعي (أسود)Ahlstrom8613-0900للحقن المجهري للبيض
1 أونصة حاويات   ؛أدوات المائدة البلاستيكية آنيASET101حاوية البيض
ذبابة الفاكهة أجار النوع الثانيApex66-103الركيزة لطبق وضع البيض WCR
ملقط وزن الريشة   ؛Bioquip4748التعامل مع اليرقات والشرانق  
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770اغسل الذرة والأطباق
Silver's YellowCoor Farm Supply502ذرة لتغذية نظام الحقن الدقيق WCR
(محلي الصنع)تتوفر أجزاء وتعليمات NA عند الطلبيتحكم في ضغط الحقن (0-20 رطل لكل بوصة مربعة)
Elmer's Non-SamGlue Elmer's Products، Inc.E304بيض الغراء على ورق الترشيح
epTIPS نصائح MicroloaderEppendorfC2554691الردم نصائح تحميل إبرة الردم
أطباق صقر الأنسجةFalcon Falcon25383-103تنبت الذرة / 150 × 25 مم
Fisherbrand  دوائر ورق الترشيح من الدرجة الكميةفيشر S47576C العلميةصنع طبق أجار لوضع البيض / 9 سم
سباركلينفيشر العلمي04-320-4غسل الأطباق
شرائح المجهر العاديفيشر العلمية12-549-3عقد ورق الترشيح والبيض للحقن الدقيق
دودة جذر الذرة الغربية مع بديل حبوباللقاح العلوم الزراعية الحدودية   ؛F9766BWCR الكبار النظام الغذائي الاصطناعي
كرات القطن ، كبيرGenesee Scientific51-101إغلاق القارورة
Globe Scientific 3.0 مل لمبة صغيرة نقل الماصاتGlobe Scientific137035جمع ونقل البيض
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicscope   ؛LeicaM165 FC فحص WCR
مجموعة مرشح DsRed للمجهر المجسم الفلوريمرشح الإثارة LeicaDSR: 510-560 نانومتر ، مرشح الانبعاث: 590-650 نانومتر
مرشح EGFPمرشح LeicaGFP2مرشح الإثارة: 440 & ndash ؛ 520 نانومتر ، مرشح الانبعاث: 510 نانومتر
BugDormMegaView ScienceDP1000_5Pقفص لفرشاة الطلاء المصغرة للمستعمرة البالغة
MyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 & nbsp ؛
عصا التحكم MicromanipulatorNarishigeMN-151Micromanipulator وحامل إبرة
مجهر XY المرحلةأوليمبوس265515مرحلة المجهر (تتكيف مع المجسم)
أقمشة قطني من الدرجة90CHEE90لفيلم
البارافين البلاستيكي وضع البيض   ؛Pechiney Plastic PackagingPM-996ختم طبق أجار بعد الحقن المجهري / حجم لفة 4 بوصات. × 125 قدم
Percival IncubatorPercival & nbsp ؛I41VLH3C8غرفة زراعة WCR (حاضنة تربية الحشرات)
قوارير Erlenmeyer ذات الفم الضيقVWR4980-300-PKحاوية مياه للمستعمرة البالغة   ؛
أكواب جريفين منخفضة الشكلVWR1000-600-PKلغسل البيض
لفات القطن المضفرشركة ريتشموند للقطن الأسنان.605-3599الاستخدام في إمدادات المياه للمستعمرة البالغة   ؛
أطباق بتري (35 × 10 مم)SIGMACLS430588-500EAلألواح النظام الغذائي
Phenol RedSigma143-78-8Microinjection Buffer
Micropiette PullerSutter InstrumentP-2000 / Gمجتذب إبرة / حرارة = 335 ، FIL = 4 ، VEL = 40 ، DEL = 200 ، PUL = 100
تربة سطحية ممتازةشركة سكوتس71130758التربة لزراعة
cronReloc Zippit 2 Mil Zipper Bags UnitedStates Plastic Corporation48342Bag agar Dish بعد الحقن المجهري / أطباق بتري 5x7
(100x15m) VWR89038-968صنع طبق أجار لوضع البيض / 100 × 15 مم
6 أوقية حاوياتWebstaurantstore128E506WCR غرفة التزاوج ذات الزوج الواحد   ؛
38 أوقية حاوياتWebstaurantstore128NC888صندوق تربية اليرقات / 38 أوقية
ChoiceHD 16 أونصة. حاوية بلاستيكية شفافة قابلة للتسخين في الميكروويفWebstaurantstore128HRD16صندوق تربية اليرقات / 16 أوقية
منظار الحقن المجهري   ؛منظار الحقن المجهريWild HeerbruggWILD-M8
الشعيرات الدموية الزجاجية القياسيةWorld Precision Instruments1B100F-4إبر الحقن المجهري
ديدان جذر الذرة الغربية البالغة مختبرالشمالي Aqricultural مختبرسلالة غير دياباسيةطلب من مختبر الدكتور بريان وايد فرينش
مجموعة البلازميد DNA MidiQiagen12143تنقية الحمض النووي البلازميد الجاهز للحقن
متجر مجهز بمرحلة XY البحث المركزي

المراجع

  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629(2011).
  3. Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
  4. Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
  5. Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
  6. Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
  7. Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  8. Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
  9. Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162(2010).
  10. Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
  11. Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
  12. Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
  13. Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
  14. Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
  15. O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
  16. Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
  17. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  18. Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
  19. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  20. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  21. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  22. Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
  23. Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
  24. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  25. Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
  26. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
  27. Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
  28. Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
  29. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  30. Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
  31. Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
  32. Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
  33. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
  34. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
  35. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11(2007).
  36. Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Microinjection "روتوورم الذرة الغربية"، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، والأجنة لتحويل الخط، أو تحرير الجينوم كريسبر/Cas9
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.