يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57499

⸱

مايو 15, 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للطفرات العشوائية الجينات الهدف في الأنشطار الخميرة. على سبيل مثال، نحن نستهدف rpt4 +، الذي يشفر وحدة فرعية بروتوزوم 19S، وشاشة للطفرات التي تزعزع استقرار هيتيروتشروماتين.

الملخص

عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة يستخدم عادة لتحديد الطفرات التي تسفر عن النمط الظاهري المطلوب. من الأساليب التي يمكن استخدامها لتحقيق الطفرات العشوائية، بكر عرضه للخطأ وضع استراتيجية ملائمة وفعالة لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات (أي.، مكتبة متحولة). بكر عرضه للخطأ هو الأسلوب المفضل عندما يسعى باحث إلى التحور منطقة محددة مسبقاً، مثل منطقة ترميز الجينات بينما يترك مناطق الجينوم أخرى لم تتأثر. بعد أن يتم تضخيمه المكتبة متحولة ببكر عرضه للخطأ، يجب المستنسخة إلى بلازميد مناسبة. حجم المكتبة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR عرضه للخطأ مقيد بكفاءة الخطوة الاستنساخ. ومع ذلك، في انشطار الخميرة، شيزوساكتشاروميسيس بومبي، يمكن استبدال الخطوة الاستنساخ باستخدام الانصهار خطوة واحدة ذات كفاءة عالية PCR لإنشاء بنيات للتحول. ثم يمكن تحديد طفرات تعمل المطلوب استخدام الصحفيين المناسبة. هنا، نحن وصف هذه الاستراتيجية بالتفصيل، آخذا على سبيل مثال، مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين سينتروميريك.

المقدمة

علم الوراثة إلى الأمام هو أسلوب كلاسيكية التي تسعى طفرات تحدث بشكل طبيعي النمط الظاهري خاصة عرض الباحثين، وإجراء التحليلات الجينية. في علم الوراثة، وعكس تدخل الطفرات في جينات للفائدة وبحثها في النمط الظاهري. في هذه الحالة الأخيرة، غالباً ما يستخدم عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة لتوليد مجموعة المسوخ التي تم تحديدها فيما بعد لتعمل المطلوب، مثل حساسية درجة الحرارة أو تغيير النشاط الأنزيمي. يمكن استخدام أساليب مختلفة لتحقيق الطفرات العشوائية، بما في ذلك عرضه للخطأ PCR1؛ إشعاع الأشعة فوق البنفسجية2؛ والمطفرات الكيميائية، مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو حمض النيتروز3؛ استخدام سلالات mutator مؤقتة، مثل تلك الإفراط معربا عن mutD5 4؛ والدنا5.

وهنا يصف لنا استراتيجية عكس-علم الوراثة التي نستخدم PCR عرضه للخطأ لإنشاء تجمعات متحولة لجينات مستهدفة في انشطار الخميرة. كما قد تخمين واحد من اسمها، ينشئ هذا الأسلوب الطفرات عن طريق إدخال أخطاء عمدا خلال PCR. خلافا لسائر الأساليب الطفرات، بكر عرضه للخطأ يسمح للمستخدم بتحديد المنطقة لتكون موتاجينيزيد. هذا يجعلها مفيدة بشكل خاص في الجهود الرامية إلى دراسة وظيفة البروتين/مجال الاهتمام.

وللتدليل على هذا الإجراء الطفرات العشوائية، هنا نستخدم rpt4 +، والذي يقوم بترميز فرعية بروتوزوم 19S، على سبيل مثال. Rpt4 قد ثبت أن لها وظائف مستقلة بروتيوليسيس في الكائنات الحية خلاف انشطار الخميرة6،7،،من89، ويمكن أن يسبب وجود عيب في بروتيوليسيس الآثار غير المباشرة بتغيير البروتينات المستويات. أننا، لذلك، فحص لطفرات التي أدت إلى التغييرات proteolysis المستقلة، بهدف التحقيق في وظيفة بروتوزوم في هيتيروتشروماتين.

يمكن تطبيقها على أي منطقة الجين PCR عرضه للخطأ بضبط المكان الذي ربط الإشعال. ويمكن تحديد طفرات تحدث التغيير المنشود المظهرية مع الصحفيين المناسبة. هنا، يمكننا الاستفادة من مراسل ade6 + إدراج كرر 1 الخارجي في السنترومير منطقة (otr)10. ويتكون heterochromatin التأسيسي في هذه المنطقة11، حتى يتم إسكات المراسل ade6 + في حالة البرية من نوع؛ يتم الإشارة إلى هذه المستعمرات الأحمر10. طفرة يزعزع heterochromatin التأسيسي في السنترومير سيؤدي إلى التعبير عن ade6 + المراسل، الذي هو تصور كمستعمرات بيضاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. يعد "استخراج الخميرة" مع ملاحق (نعم)، نعم دون الأدنين (نعم منخفضة Ade)، غلوتامات بومبي المتوسطة (فريق رصد السلام12)، وفريق رصد السلام دون الأدنين (فريق رصد السلام-أدى) بخلط المكونات كما هو موضح في الجدول 1. نعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات Ade فريق رصد السلام جميعا من نفس المكونات ولكن محذوفاً الأدنين من هذا الأخير.
    1. استخدم الأسهم الملح (50 س) التالية: 2 غرام/لتر Na2حتى4 في الماء المقطر، 50 غرام/لتر بوكل 52.5 غرام/لتر مجكل2·6H2س، 2 غرام/لتر كاكل2·2H2س. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. استخدام فيتامين التالية (1، 000 x) الأوراق المالية: بانتوثينات 1 غرام/لتر، 10 غرام/لتر حمض النيكوتينيك، اينوزيتول 10 غرام/لتر، البيوتين 10 مغ/لتر في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    3. استخدام المعادن التالية (10، 000 x) الأوراق المالية: 5 غرام/لتر الماء المقطر، 4 غرام/لتر منسو4, 4 غرام/لتر زنسو4·7H2س، 2 غرام/لتر فيكل2·4H2س، 0.4 غرام/لتر مو3، 1 غرام/لتر كي، 0.4 غرام/لتر CuSO4·5H2س ، حامض الستريك 10 غرام/لتر في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إجراء المتوسطة نعم السائل بإهمال في أجار.
  2. اﻷوتوكﻻف المتوسطة وباردة إلى أدناه 60 درجة مئوية بينما التحريك مع شريط ضجة، بمعدل 200 لفة في الدقيقة.
  3. لوحات نعم + G418 (جينيتيسين)، إضافة 1 مل/لتر G418 حل الأسهم المتوسطة نعم.
    1. استخدام G418 التالية (1، 000 x) الأوراق المالية: 100 مغ/مل G418 في الماء المقطر. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر، الكوة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي، ومخزن في-20 درجة مئوية.
  4. يقلب لآخر دقيقة 5-10 وقاسمه وسائط الإعلام في أطباق بتري 90 ملم (1 لتر مختبرين المتوسط إلى ما يقرب من 40 بيتري الأطباق. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية.

2-استنساخ rpt4 + ولها 5/3 ' تحيلها

  1. إجراء PCR مع الإشعال p1 و p2 (الشكل 1A) استخدام الأنشطار خميرة الحمض النووي (جدنا) كالقالب في إجمالي حجم 50 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، وتطبيق دورات الرد المبين في الجدول 2 إلى تضخيم قاعدة 3,315 تتألف من rpt4 + ولها 5/3 ' تحيلها يفتت زوج (bp). تنقية المنتج PCR باستخدام أدوات تنقية13 حسب توجيهات الشركة المصنعة (الشكل 1A).
  2. هضم متجه KS(-) ببلويسكريبت14 والجزء تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على rpt4 + مع به 5/3 ' تحيلها مع BamH1 و Xho1 في إجمالي حجم 20 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x الهضم العازلة) عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ل 16-18 (ح) (الشكل 1B).
  3. هلام تطهير ناقلات هضمها (1.2% [اغروس] هلام) وإدراج الحمض النووي بأداء على أساس تاي [اغروس] هلام التفريد (100 V، ح 1) ونسق عصابات الحمض النووي بالأحجام المطلوبة، وعزل الحمض النووي مع مجموعة أدوات استخراج جل15.
  4. اضطر إدراج الحمض النووي باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى بأداء فعل ربط 20 ميليلتر يحتوي على 50-100 نانوغرام من ناقلات الحمض النووي، والمتجهة ~ فائض المولى 3-fold في الحمض النووي إدراج و 400 "ش T4 الحمض النووي" ليجاسى 1 × ربط المخزن المؤقت. احتضان هذا الخليط عند 18 درجة مئوية ح 16-18.
  5. تحويل الحمض النووي الواصلة إلى 100 ميليلتر من DH5α كولاي عن طريق تطبيق الصدمة الحرارة 70 s في 42 درجة مئوية. أضف 1 مل رطل واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية للانتعاش. إجراء الطرد المركزي (13,800 س ز)، وتجاهل لوحة طافية، كل من تحول كولاي الخلايا على ألواح الأمبيسلّين رطل (لوس أنجليس)، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16.
  6. اختيار المستعمرات 4-8 مع المسواك وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط 3 مل لوس أنجليس.
  7. عزل البلازميدات مع مجموعة أدوات تنقية بلازميد16 المستخدمة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، وأداء ديجيسشنز إنزيم التقييد التحليلية مع 5 ميليلتر من بلازميد معزولة، 5 ش كل إنزيم التقييد (BamH1 و Xho1) و 1 × تقييد المخزن المؤقت. احتضان الخليط رد فعل على 37 درجة مئوية في حمام مائي حاء 3 تأكيد استنساخ حسب تسلسلها والبلازميدات المرشح.

3-الأخذ بالطفرة الصامتة (موقع تقييدXho1 )

  1. تصميم زوج من الإشعال 33-بي بي (p3 و p4) التي تحتوي على الطفرة المنشودة في تسلسل وإلا مكملة.
  2. إجراء PCR مع عالية الدقة بوليميريز17 (الشكل 1) في إجمالي حجم 25 ميليلتر (10 نانوغرام بلازميد المستنسخة، 2 ميليلتر 10 pmol التمهيدي مزيج، إنزيم يو 2، 1 x رد فعل المخزن المؤقت) استخدام الدراجات المعلمات المسرودة في الجدول 3.
  3. هضم بلازميد القالب مع Dpnفي إجمالي حجم 20 ميليلتر (20 إنزيم يو، س 1 الهضم العازلة) عند 37 درجة مئوية في مياه حمام لح 1.
  4. تحويل ونشر، وعزل، وتسلسل بلازميد يحتوي على الطفرة الصامتة، كما هو موضح في الخطوات 2.5 2.7.
    ملاحظة: يمكن أيضا إدخال الطفرة الصامت باستخدام أسلوب استنساخ الذي يسمح بضم عدة شظايا من الحمض النووي في رد واحد18.

4-عشوائية الطفرات rpt4 + ببكر عرضه للخطأ

  1. إجراء PCR عرضه للخطأ، باستخدام بلازميد مع الطفرة الصامتة (موقعXho1 ) كالقالب، p5 الإشعال و p6، إجمالي حجم 50 ميليلتر (مقدار القالب المحدد في الخطوة 4.1.1، 2 ميليلتر ميكس التمهيدي pmol 10، 2.5 يو الإنزيم، 1 x رد فعل المخزن) ، وبوليميريز خاصة التي تم تصميمها لإنشاء خطأ عالية معدل19 (الشكل 1). تنفيذ بكر كما هو موضح في الجدول 2.
    1. استخدام 4-5 ميكروغرام من بلازميد القالب للتحكم في وتيرة الطفرة إلى بي بي 1/كيلوبايت (كيلوبس).
      ملاحظة: تركيزات عالية (> 500 نانوغرام/ميليلتر) من بلازميد، التي يمكن الحصول عليها باستخدام طقم الإعدادية المصغر20، مطلوب.
  2. استخدم جل التفريد لتأكيد منتج PCR من 2670 bp (1.2% [اغروس] هلام). هلام تنقية هذا المنتج بكر كما هو موضح في الخطوة 2، 5.

5-إعداد الانصهار PCR شظايا (أساسه، 3 ' UTR)

  1. إجراء PCR باستخدام pFA6a-KANMX621 كقالب، p7 الإشعال و p8، والشروط المدرجة في الجدول 4 للحصول على الجزء ماركر (كان). هلام تطهير الجزء 1,480-بي بي الناتجة كما هو موضح في الخطوة 2، 5 (الشكل 1E).
    1. تحقق إذا كان كودون التوقف من الجينات المستهدفة لمنطقة ترميز الجينات المتاخمة لها والطفرات مفصولة بأكثر من 500 شركة بريتيش بتروليوم. لا يجوز استخدام فاصل الذاتية عند هذه المنطقة هو أقل من 500 bp؛ بدلاً من ذلك، يجب استخدام فاصل ADH بدلاً من فاصل الذاتية. وترد في الجدول 5البروتوكول التغييرات المطلوبة لاستخدام فاصل ADH .
      ملاحظة: هذه التغييرات تنطبق فقط عندما يتم استخدام فاصل ADH ، ومتاح في بلازميد pFA6a-3HA-KANMX6، بدلاً من فاصل الذاتية.
  2. أداء بكر مع استنساخ rpt4 +--التي تحتوي على ناقل p9 القالب والإشعال و p10 في إجمالي حجم 50 ميليلتر (20 نغ بلازميد المستنسخة، 2 ميليلتر 10 pmol التمهيدي مزيج، إنزيم يو 2، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، استخدام الشروط الواردة في الجدول 6. هلام تنقية UTR الجزء المتحصل عليها 506-بي بي 3 ' (الشكل 1E).

6-جيل بناء التحول من الانصهار بكر (الشكل 1E)

  1. إعداد الأجزاء 3 (موتاجينيزيد rpt4 +واساسه و 3 ' UTR) في 50 نانوغرام/ميليلتر.
  2. أداء الانصهار PCR الثلاث شظايا استخدام كبسولة تفجير p11 p12، كما هو موضح في الجدول 7. (بروتوكول للانصهار PCR إدخال تعديل على البروتوكول الأصلي22). تنقية المنتج بكر 4,398-بي بي الرئيسية.
    1. استخدام rpt4 +: KAN:3 ' UTR شظايا بنسبة 1:3:1 لتحقيق أفضل النتائج.
      ملاحظة: ينبغي إلا يتجاوز المبلغ الإجمالي من الحمض النووي إدراج 500 نانوغرام. الكمية الموصى بها من rpt4 +: KAN:3 ' UTR 50 نانوغرام ng:50 ng:150. منطقة موتاجينيزيد حوالي 1.6 كيلوبايت، ذلك هو الحد الأدنى لعدد من المستعمرات الخميرة التي ستمثل كافة التركيبات الممكنة لكل قاعدة يجري تحور إلى الثلاثة الآخرين 1,600 x 3 = 4,800 المستعمرات. لأن عادة غلة رد فعل التحول واحد 400-500 المستعمرات، مطلوب على الأقل 10 ردود الفعل يستحق الانصهار بكر بناء. ويمكن تلبية هذه الحاجة ببساطة زيادة مقدار رد الفعل (أي عدد أنابيب PCR) بمعامل قدرة عشرة.

7-تحول خميرة الأنشطار قبل انهانسر (الشكل 1F)

  1. تطعيم الخميرة إلى 10 مل متوسطة نعم للتشبع بحضانة أنه لأكثر من 16 ح.
  2. تمييع الخلايا كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) 0.2 في 200 مل من نعم المتوسطة واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز ح 5-6، إلى OD600 = 0.6-0.8.
  3. تركز الخلايا إلى OD600 = 30، الاستغناء عن إلى أربعة أنابيب مخروطية 50 مل والبرد على الجليد لمدة 10 دقائق.
  4. حصاد الخلايا عن طريق إجراء الطرد المركزي في 1,050 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. وضع الأنابيب والكهربائية 10-الترعة على الجليد. نفذ الخطوات 7.3 7.8 على الجليد.
  5. تجاهل المادة طافية وإضافة 15 مل السوربيتول 1.2 متر. بلطف يهز الأنابيب ريسوسبيند الخلايا.
  6. الطرد المركزي الخلايا في ز x 1050 لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. كرر الخطوات من 7، 4 و 7-5. تجاهل المادة طافية. إضافة 500 ميليلتر من السوربيتول 1.2 متر لكل أنبوبة، ريسوسبيند الخلايا، وجمع كافة الخلايا في أحد أنابيب مخروطية الشكل 15 مل.
  8. إضافة السوربيتول 1.2 متر يصل إلى 2.4 مل (OD600 = 10 كل 0.2 مل). الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.
  9. إضافة 200 ميليلتر الخلايا علقت السوربيتول (تأكد من أنها علقت تماما) لأنبوب الجيش الشعبي التي تحتوي على الانصهار PCR بناء ومزيج جيد ونقل العينة إلى الكهربائية-ومبومو.
  10. اليكتروبوراتي الخلايا مع الخيارات التالية: الفطريات، وشبكات الطاقة الشمسية المنزلية (2.00kV، نبض 1).
  11. إضافة 600 ميليلتر من السوربيتول 1.2 متر لكل الكهربائية ومبومو لإجمالي حجم 800 ميليلتر ومن ثم انتشار الخلايا على أربع لوحات نعم (200 ميليلتر في اللوحة). سوف تستغني عشرة الكهربائية-الترعة إلى 40 نعم لوحات.
  12. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية ح 24.
  13. قم بالطلاء النسخ المتماثلة إلى نعم + G418 واحتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.

8-اختيار طفرات Heterochromatin-المزعزعة للاستقرار، والتحقق من وجود إيجابيات كاذبة

  1. لكل لوحة نعم + G418، نفذ الطلاء النسخ المتماثلة إلى نعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات فريق رصد السلام-Ade (لا أدى). احتضان لوحات متماثلة لعدة أيام 1-2 في 30 درجة مئوية، حتى تظهر بعض المستعمرات على لوحات Ade نعم تلوين أحمر (الشكل 1).
  2. مقارنة لوحات Ade نعم وفريق رصد السلام-أدى وحدد الخلايا التي تظهر الوردي أو الأبيض على لوحة Ade نعم وتنمو أيضا في لوحة فريق رصد السلام Ade. لا تقم بتحديد المستعمرات دون نمو في فريق رصد السلام-أدى، كما أنها نتائج إيجابية خاطئة (مثلاً، مما يعكس أن الكاسيت كان قد أدمج في موقع غير المستهدفة في أماكن أخرى في الجينوم).
  3. اختيار حوالي 1 × 105 خلايا من كل مستعمرة واحتضان في 10 ميليلتر من محلول سبز يحتوي على 2.5 ملغ/مل زيمولياسي 100 طن في 37 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة ميليلتر 1 استخدام هذا الحل لأداء كقالب البداية مستعمرة [بكر] (الشكل 1 ح).
    1. جعل سبز (50 مل) بالاختلاط 30 مل السوربيتول م 2، مل 4.05 م 1 غ2هبو4، 0.95 مل نة2بو4 و 15 مل من الماء المقطر (pH النهائي، 7.5). يمكن استكمالها مع زيمولياسي وتخزينها في مختبرين 500 ميليلتر في-20 درجة مئوية حتى استخدام عينات (5 مل).
  4. إجراء التفريد هلام (1.2% [اغروس] هلام، 180V، 20 دقيقة) لتصور النتائج + المستعمرة [بكر]. تحديد ردود الفعل التي يحمل عصابات PCR بالحجم المناسب وهضم 5 ميليلتر لكل منتج رد فعل مع زهوالأول (4 إنزيم يو، س 1 الهضم المخزن المؤقت، وحمام الماء 37 درجة مئوية، ح 1) لحجب إيجابيات كاذبة (ح الشكل 1).
  5. إجراء التفريد جل لتصور النبذ إكسهوي (1.2% [اغروس] هلام، 180 الخامس، 20 دقيقة). وضع علامة على المستعمرات منتجات PCR الذي يتم قطع زهوي، والتصحيح لهم إلى لوحات نعم + G418 (الرقم 1I).
  6. عزل جدنا من خلايا الخميرة الأنشطار وإجراء تسلسل ل منتجات PCR23. قارن تسلسل الحصول عليها مع تسلسل البرية من نوع تحديد الطفرات (1I الشكل).
  7. مباشرة إعادة إدخال mutation(s) إلى البرية من نوع الخلايا بتحويلها مع ثوابت الانصهار تضخيمه ببكر من خلايا متحولة23. استخدام اكتشاف للتأكد من النمط الظاهري في خلايا متحولة قدم حديثا (1J الشكل).
    1. يمكن تضخيمه بناء الانصهار التحول بسهولة من بكر مع p1 الإشعال و p10 استخدام الحمض النووي الجينومي لطفرات كالقالب في إجمالي حجم 50 ميليلتر (~ 1 ميكروغرام الحمض النووي، إنزيم يو 20، 1 x رد فعل المخزن المؤقت)، وتطبيق دورات الرد المبين في الجدول 2 . يمكن أن يتم تحول بنية باتباع الخطوات 7.1 7.13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن تحليل طفرات Rpt4 المكتسبة عن طريق اتباع الإجراءات المبينة في الشكل 1 بتقييم ألوان المستعمرات. تم اكتشاف ألوان المستعمرات على لوحات ذات الصلة في تناقص عدد الخلايا في الشكل 2. هو إسكات في البرية من نوع المراسل ade6 + إدراجها في منطقة هيتيروتشروماتين وتظهر المستعمرات الحمراء في لوحة نعم Ade. مرة واحدة هو زعزعة الاستقرار في هيتيروتشروماتين، وهو أعرب عن مراسل ade6 + ، يمكن ملاحظة مستعمرات بيضاء في لوحة Ade نعم ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الطفرات العشوائية عن طريق PCR عرضه للخطأ أداة قوية لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات في منطقة بعينها. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تسعى إلى تقييم الدالة بروتين تحت ظرف معين. على سبيل المثال، استخدمنا هنا بكر عرضه للخطأ لتقييم وظيفة فرعية بروتوزوم 19S، Rpt4، في الحفاظ على هيتيروتشروماتين. باختلاف المنطقة المستهدفة ببكر عرضه للخطأ وتعديل شروط الفحص، استطعنا أن تتحول الخلايا في منطقة الجينوم للفائدة وشاشة للنمط الظاهري المطلوب. في الآونة الأخيرة، استخدمت طريقة مماثلة لعزل خلايا الخميرة الأنشطار إيواء الطفرات في محور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وقدمت الدعم التمويلي لهذا المشروع من "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (2016R1A2B2006354).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>1. وسائل الإعلام< / قوي>
الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270-10KG
مستخلص الخميرةBD Biosciences212720
L-LeucineJUNSEI87070-0310
كبريتات الأدينينACR16363-0250
Uracil   ؛سيجما ألدريتشU0750
L-هيستيدينسيجما ألدريتشH8125
KH2PO4سيجما ألدريتش1.05108.0050
كلوريد الصوديومJUNSEI19015-0350
MgSO4& bull; 7H2< / sub>Oسيجما ألدريتش63140
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich12095
فثالات البوتاسيومسيجما ألدريتشP6758-500g
إينوزيتولسيجما ألدريتشI7508-50G
البيوتينسيجما ألدريتشB4501-100MG
حمض البوريكسيجما ألدريتشB6768-1KG
MnSO4سيجما - ألدريتشM7634-500G
ZnSO4< / sub>& bull; 7H2O JUNSEI83060-031
FeCl2& bull; 4H2< / sub>OKANTOCB8943686
ثنائي هيدرات موليبدات الصوديومياكوري31621
كيJUNSEI80090-0301
CuSO4& bull; 5H2Oياكوري09605
D-myo-inositolMP الطب الحيوي102052
PantothenateYAKURI26003
حمض النيكوتينيكسيجما ألدريتشN4126-500G
(NH4)2SO4 سيجما ألدريتشA4418-100G
AgaroseBiobasicD0012
G418 ، الوراثةLPSG41805
< قوي>2. تفاعلات الإنزيم< / قوي>
PfuUltra II Fusion HS DNA PolymeraseAglient600380للطفرات الموجهة في الموقع
GeneMorphII طفرات عشوائيةAglient200500ل PCR
المعرضة للخطأ Phusion عالية الدقة DNA PolymeraseThermo FisherF-530Lللانصهار PCR
Ex Taq & nbsp ؛ بوليميراز الحمض النوويتاكاراRR001bل PCR العام
BamH1New England BioLabsR0136S
Xho1New England BioLabsR0146S
Dpn1New England BioLabsR0176S
3. المعدات< / قوي>
مربع المخمطي ، أسودVWR89033-116لأداة الطلاء المقلدة
VWR25395-380لنسخة طبق الأصل
MicroPulser ElectroporatorBiorad1652100 & nbsp ؛لتحويل الخميرة الانشطارية
كوفيت التثقيب الكهربائي ، فجوة 0.2 سمBiorad1652086 لتحويل الخميرة الانشطارية
Thermal CyclerBioerBYQ6078لتفاعل منحدر PCR الانصهار  

المراجع

  1. Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
  2. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  3. Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
  4. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  5. Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237(2001).
  6. Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078(2016).
  7. Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
  10. Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
  11. Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
  12. Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
  13. QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
  14. pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
  15. QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
  16. QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
  17. PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
  18. Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
  19. GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
  20. Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
  21. Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  22. Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
  23. Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
  24. Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
  25. Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371(2017).
  26. Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
  27. Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأالطفرات الموجهة للجيناتزعزعة استقرار الهتيروكروماتفاعل البوليميراز المتسلسل الدمجيتفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمراتالرحلان الكهربائي للهلامتسلسل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجينمقايسة الجين المراسلمقايسة التنقيط
استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.