توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للطفرات العشوائية الجينات الهدف في الأنشطار الخميرة. على سبيل مثال، نحن نستهدف rpt4 +، الذي يشفر وحدة فرعية بروتوزوم 19S، وشاشة للطفرات التي تزعزع استقرار هيتيروتشروماتين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة يستخدم عادة لتحديد الطفرات التي تسفر عن النمط الظاهري المطلوب. من الأساليب التي يمكن استخدامها لتحقيق الطفرات العشوائية، بكر عرضه للخطأ وضع استراتيجية ملائمة وفعالة لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات (أي.، مكتبة متحولة). بكر عرضه للخطأ هو الأسلوب المفضل عندما يسعى باحث إلى التحور منطقة محددة مسبقاً، مثل منطقة ترميز الجينات بينما يترك مناطق الجينوم أخرى لم تتأثر. بعد أن يتم تضخيمه المكتبة متحولة ببكر عرضه للخطأ، يجب المستنسخة إلى بلازميد مناسبة. حجم المكتبة التي تم إنشاؤها بواسطة PCR عرضه للخطأ مقيد بكفاءة الخطوة الاستنساخ. ومع ذلك، في انشطار الخميرة، شيزوساكتشاروميسيس بومبي، يمكن استبدال الخطوة الاستنساخ باستخدام الانصهار خطوة واحدة ذات كفاءة عالية PCR لإنشاء بنيات للتحول. ثم يمكن تحديد طفرات تعمل المطلوب استخدام الصحفيين المناسبة. هنا، نحن وصف هذه الاستراتيجية بالتفصيل، آخذا على سبيل مثال، مراسل إدراجها في هيتيروتشروماتين سينتروميريك.
المقدمة
علم الوراثة إلى الأمام هو أسلوب كلاسيكية التي تسعى طفرات تحدث بشكل طبيعي النمط الظاهري خاصة عرض الباحثين، وإجراء التحليلات الجينية. في علم الوراثة، وعكس تدخل الطفرات في جينات للفائدة وبحثها في النمط الظاهري. في هذه الحالة الأخيرة، غالباً ما يستخدم عشوائية الطفرات الجينات المستهدفة لتوليد مجموعة المسوخ التي تم تحديدها فيما بعد لتعمل المطلوب، مثل حساسية درجة الحرارة أو تغيير النشاط الأنزيمي. يمكن استخدام أساليب مختلفة لتحقيق الطفرات العشوائية، بما في ذلك عرضه للخطأ PCR1؛ إشعاع الأشعة فوق البنفسجية2؛ والمطفرات الكيميائية، مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو حمض النيتروز3؛ استخدام سلالات mutator مؤقتة،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد وسائل الإعلام
- يعد "استخراج الخميرة" مع ملاحق (نعم)، نعم دون الأدنين (نعم منخفضة Ade)، غلوتامات بومبي المتوسطة (فريق رصد السلام12)، وفريق رصد السلام دون الأدنين (فريق رصد السلام-أدى) بخلط المكونات كما هو موضح في الجدول 1. نعم-Ade (Ade منخفضة) ولوحات Ade فريق رصد السلام جميعا من نفس المكونات ولكن محذوفاً الأدنين من هذا الأخير.
- استخدم الأسهم الملح (50 س) التالية: 2 غرام/لتر Na2حتى4 في الماء المقطر، 50 غرام/لتر بوكل 52.5 غرام/لتر مجكل2·6H2س، 2 غرام/لتر كاكل2·2H2س. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن تحليل طفرات Rpt4 المكتسبة عن طريق اتباع الإجراءات المبينة في الشكل 1 بتقييم ألوان المستعمرات. تم اكتشاف ألوان المستعمرات على لوحات ذات الصلة في تناقص عدد الخلايا في الشكل 2. هو إسكات في البرية من نوع المراسل ade6 + إدراجها في منطقة هيتيروتشروماتين وتظهر المستعمرات الحمراء في لوحة نعم Ade. مرة واحدة هو زعزعة الاستقرار في هيتيروتشروماتين، وهو أعرب عن مراسل ade6 + ، يمكن ملاحظة مستعمرات بيضاء في لوحة Ade نعم ك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطفرات العشوائية عن طريق PCR عرضه للخطأ أداة قوية لتوليد مجموعة متنوعة من طفرات في منطقة بعينها. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تسعى إلى تقييم الدالة بروتين تحت ظرف معين. على سبيل المثال، استخدمنا هنا بكر عرضه للخطأ لتقييم وظيفة فرعية بروتوزوم 19S، Rpt4، في الحفاظ على هيتيروتشروماتين. باختلاف المنطقة المستهدفة ببكر عرضه للخطأ وتعديل شروط الفحص، استطعنا أن تتحول الخلايا في منطقة الجينوم للفائدة وشاشة للنمط الظاهري المطلوب. في الآونة الأخيرة، استخدمت طريقة مماثلة لعزل خلايا الخميرة الأنشطار إيواء الطفرات في محور.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وقدمت الدعم التمويلي لهذا المشروع من "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (2016R1A2B2006354).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>1. وسائل الإعلام< / قوي> | |||
| الجلوكوز | سيجما ألدريتش | G8270-10KG | |
| مستخلص الخميرة | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| كبريتات الأدينين | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil ؛ | سيجما ألدريتش | U0750 | |
| L-هيستيدين | سيجما ألدريتش | H8125 | |
| KH2PO4 | سيجما ألدريتش | 1.05108.0050 | |
| كلوريد الصوديوم | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4& bull; 7H2< / sub>O | سيجما ألدريتش | 63140 | |
| CaCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| فثالات البوتاسيوم | سيجما ألدريتش | P6758-500g | |
| إينوزيتول | سيجما ألدريتش | I7508-50G | |
| البيوتين | سيجما ألدريتش | B4501-100MG | |
| حمض البوريك | سيجما ألدريتش | B6768-1KG | |
| MnSO4 | سيجما - ألدريتش | M7634-500G | |
| ZnSO4< / sub>& bull; 7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2& bull; 4H2< / sub>O | KANTO | CB8943686 | |
| ثنائي هيدرات موليبدات الصوديوم | ياكوري | 31621 | |
| كي | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4& bull; 5H2O | ياكوري | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP الطب الحيوي | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| حمض النيكوتينيك | سيجما ألدريتش | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | سيجما ألدريتش | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418 ، الوراثة | LPS | G41805 | |
| < قوي>2. تفاعلات الإنزيم< / قوي> | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | للطفرات الموجهة في الموقع |
| GeneMorphII طفرات عشوائية | Aglient | 200500 | ل PCR |
| المعرضة للخطأ Phusion عالية الدقة DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | للانصهار PCR |
| Ex Taq & nbsp ؛ بوليميراز الحمض النووي | تاكارا | RR001b | ل PCR العام |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. المعدات< / قوي> | |||
| مربع المخمطي ، أسود | VWR | 89033-116 | لأداة الطلاء المقلدة |
| VWR | 25395-380 | لنسخة طبق الأصل | |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 & nbsp ؛ | لتحويل الخميرة الانشطارية |
| كوفيت التثقيب الكهربائي ، فجوة 0.2 سم | Biorad | 1652086 | لتحويل الخميرة الانشطارية |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | لتفاعل منحدر PCR الانصهار |
المراجع
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
