"حدد أمداً" الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات"

Ahmad Besaratinia; Stella Tommasi

doi:10.3791/57510

Method Article

"حدد أمداً" الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات"

DOI:

10.3791/57510

⸱

April 26th, 2018

Ahmad Besaratinia¹ , Stella Tommasi¹

¹Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً" في الخلايا المستزرعة من القوارض المعدلة وراثيا أو الحيوانات المقابلة تعامل مع عامل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. وقد استخدمت هذا النهج على نطاق واسع لاختبار المحدثة للطفرات من المواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد وضعت عددا من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. هذه، استخدمت الفئران المعدلة وراثيا و "لامدا" (λ) حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" للتجارب المحدثة للطفرات بالعديد من المجموعات البحثية في جميع أنحاء العالم. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً"، التي يمكن تطبيقها على الخلايا المزروعة من الفئران المعدلة وراثيا/الفئران أو معاملة الحيوانات المقابلة مع وكيل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: (1) عزل الحمض النووي من الخلايا أو الأجهزة/الأنسجة من الحيوانات المحورة وراثيا تعامل في المختبر أو في الجسم الحي، على التوالي، مع مجمع اختبار؛ (2) استعادة ناقل المكوكية لامدا تحمل جين مراسل حيث (أي، التحوير الاتحاد ) من الحمض النووي الجينوم؛ (3) التعبئة والتغليف لناقلات المرض الذين تم إنقاذهم إلى bacteriophages المعدية؛ (4) إصابة بكتيريا المضيفة واستزراع تحت شروط انتقائية للسماح بنشر الطفرات المستحثة الاتحاد ؛ وسجل (5) الاتحاد-طفرات والحمض النووي تسلسل التحليل لتحديد تواتر متحولة الاتحاد والطيف الطفرة، على التوالي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وضعت مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. من هذه الفئران "الأزرق الكبير" (المشار إليها أدناه ك BB) المعدلة وراثيا و λ حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" قد استخدمت للتجارب المحدثة للطفرات بهذه المجموعة والعديد من غيرها بحوث المجموعات في جميع أنحاء العالم¹^،²^، ³^،⁴^،⁵^،^،من⁶⁷^،^،من⁸

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الحمض النووي في معزل عن الخلايا الليفية الجنينية الماوس

ملاحظة: الليفية الجنينية الماوس الأساسي يتم عزل من الأجنة المستمدة من الفئران المحورة وراثيا BB مع الخلفية الوراثية C57BL/6، وفقا للبروتوكول المنشورة⁵³. انطلاق المواد لهذا البروتوكول يتكون من 1 × 10⁶ و 1 × 10⁷ تنتجها الخلايا الليفية الجنينية الخلايا تعامل مع اختبار تحكم مركب مقابل . حصاد والعد من هذه الخلايا باستخدام الأساليب القياسية موصوفة في المراجع¹⁰^،^،من⁵⁴⁵⁵.

إعداد المخزن المؤقت (0.3 M السكروز 60 ملم بوكل، 15 ملم كلوريد الص....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتماداً على توزيع البيانات، يتم استخدام اختبارات حدودي أو غير حدودي تحديد أهمية الاختلاف في التردد متحولة الاتحاد بين المجموعات المعالجة والمراقبة (أيفعل مقابل الترددات متحولة عفوية) . يتم إجراء مقارنة الترددات متحولة المستحث الاتحاد عبر مجموعات معاملة مختلفة بشتى (العشوائية) الاختبارات الإحصائية، حسب الاقتضاء. اختبار الهندسة الفوقية آدامز وسكوبيك يستخدم عادة لمقارنة أطياف الطفرات المستحثة وعفوية العام⁵⁷، على الرغم من أن الاختبارات الأخر.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استخدام الفحص حدد الاتحاد λ للكشف عن الطفرات في التحوير الاتحاد ضبطت المجينية الحمض النووي للخلايا المشتقة من الأجهزة/أنسجة القوارض BB³. جينوم هذه الحيوانات المحورة وراثيا يحتوي على نسخ متعددة جنبا إلى جنب ناقل المكوك λLIZ تشروموسومالي المتكاملة، الذي يحمل الاتحاد (294 bp) وﻻسي (1,080 bp) المتسلسلات، ك الجينات مراسل حيث¹^، ² ^, ²⁵-مقايسة حدد الاتحاد λ يستند إ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كافة الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعترف بالمساهمات من جميع الزملاء والمتعاونين لدراساتنا الأصلي، أحيلت نتائجه في هذه المخطوطة (لأغراض توضيحية). دعم عمل المؤلفين من المنح المقدمة من المعهد الوطني لطب الأسنان والبحوث إحضارهما "المعاهد الوطنية للصحة" (1R01DE026043) على أساسها، ومن جامعة California Tobacco-Related برنامج بحوث الأمراض إلى AB ( TRDRP-26IR-0015) وشارع (تردرب-25IP-0001). وكان مقدمو الدراسة أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليل البيانات، وتفسير البيانات وكتابة التقرير، أو في قرار يقدم للنشر.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
أجار	مو الحيوية ، وشركة	12112-05	بكتريولوجية
الصف BigDye Terminator v3.1 دورة تسلسل كيت	ثيرمو فيشر العلمي	4337455	لا شيء
الكازين الببتون	ألفا إيسار	H26557	لا شيء
الجيلاتين	جي تي بيكر	2124-01	مسحوق
الجلسرين	فيشر العلمي	BP 229-1 / M-13750	لا شيء
LB أجار	فيشر العلمية	BP 9724-500	لا شيء
QIAquick PCR طقم تنقية	Qiagen	8104	50 تفاعلات تنقية PCR
أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدرات	فيشر Scientific	M-15756	لا
شيء < م > Taq5000 < / em > DNA Polymerase ؛	Qiagen	201207	none
الثيامين هيدروكلوريد	ماكرون للكيماويات الدقيقة	2722-57	لا شيء
Transpack Packaging Extract	Stratagene Corp. ، المكتسبة من قبل BioReliance \| شركة سيجما ألدريتش	200223	50 تفاعل تغليف
تريس بيس	فيشر Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	لا شيء
Trypton	Biosciences	RC-110	لا شيء

مختبرات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

"حدد أمداً" الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات"

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles