مقالة منهجية

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

DOI:

10.3791/57514

⸱

مايو 22, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, 2Tianjin Agricultural University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف العزلة حويصلات خارج الخلية (EVs) المتوسط في المختبر ومثقف من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات الغشائية التي صدر عن مجموعة متنوعة من الخلايا إلى المكروية خارج الخلية. المركبات الكهربائية تمثل أن حويصلات غير المتجانسة، التي حجم يتراوح بين 40 و 000 1 نانومتر. وأشارت الأدلة المتراكمة إلى أن المركبات الكهربائية تلعب أدواراً تنظيمية هامة في التفاعلات المضيف الممرض. وينبغي التبصير على فهم عميق للمركبات الكهربائية المنشقات الآليات الأساسية للتفاعلات المنشقات-المضيف، مما يتيح وضع استراتيجيات جديدة ضد مرض البلهارسيا. هنا، ونحن نهدف إلى مواصلة دراسة وظائف المركبات الكهربائية في المنشقات بتقديم بروتوكول لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات (بالبلەارسيات S.). وكانت المركبات الكهربائية معزولة من المتوسطة الثقافة في المختبر باستخدام الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع مجموعة مواد عزل اكسوسومي تجارية. معزولة بالبلەارسيات س. المركبات الكهربائية (سجيفس) عادة ما تمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر، وتتميز مجهر إلكتروني والنشاف الغربية. وأثبتت استخدام الصبغة المسماة سجيفس PKH67 أن سجيفس يتم استيعابه بالخلايا المتلقية. إجمالاً، لدينا بروتوكول يوفر طريقة بديلة لعزل المركبات الكهربائية من المنشقات الكبار؛ سجيفس معزولة قد تكون مناسبة للتحليل الوظيفي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حويصلات خارج الخلية (EVs) عدد سكان صغير الحويصلات الغشاء زمنياً مغلفة بمختلف البروتينات والدهون والأحماض النووية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المركبات الكهربائية تلعب دوراً حاسما في خلية خلية الاتصال، ويشاركون في تنظيم العديد من العمليات الفيزيولوجية، بما في ذلك التنمية الخلية والتنظيم المناعي والأوعية وخلية الهجرة2، 3،،من45. تتراكم الأدلة تشير إلى أن المركبات الكهربائية، تعميم اكسوسوميس، وحمولتها ميرنا تمثل المؤشرات الحيوية المحتملة لبعض الأمراض6.

البروتوزوا عدة مثل المشعرة المهبليةو مثقبيه الكروزية ليشمانيا spp.، أظهرت أن تكون قادرة على إفراز المركبات الكهربائية؛ بالإضافة إلى ذلك تم العثور على الديدان لإفراز المركبات الكهربائية في المعيشة وتستضيف7. أظهرت المركبات الكهربائية الطفيلية إلى المشاركة في الحفاظ على الإصابة والقدرة الإمراضية8التنظيم المناعي9. الدراسات الأخيرة في المنشقات كل 10، المنسونيه بلهارسيه (س. المنسونيه)11 و بالبلەارسيات س.12 قد أشارت إلى أن تفرز المنشقات الكبار حويصلات مثل اكسوسومي التي قد تكون وتشارك في اللوائح الفنية لعمليات بيولوجية معينة.

وحتى الآن، استخدمت عدة طرق لعزل حويصلات خارج الخلية، مثل تنبيذ فائق، أولترافيلتريشن13، واستخدام الكواشف المستندة إلى البوليمر، وحجم الاستبعاد اللوني والعزلة إيمونوافينيتي. هذه الأساليب المختلفة تمتلك14المزايا والقيود الخاصة بها. وبوجه عام، يعتبر تنبيذ فائق الأسلوب المعيار الذهبي لعزل حويصلة. ومع ذلك، يعاني هذا الأسلوب من الحد من التراكم EV المحتملة14.

في المنشقات، أبلغ عن اثنين من الأساليب لعزل EV: وتشمل هذه تنبيذ فائق11،،من1210 واستخدام التجاري EV العزلة طقم16 لعدة مراحل (16من البيض، شيستوسومولا11المنشقات البالغين10،،من1217). نظراً لأن ميكروفيسيكليس هم من طائفة واسعة من حجم نانومتر مئات عدة من آلاف نانومتر، قمنا بتطوير أسلوب بديل يجمع بين استخدام الطرد المركزي مقاعد البدلاء، أولترافيلتريشن، ومجموعة EV عزلة تجارية لعزل المركبات من بلهارسيه بالبلەارسياتمن الكبار. المركبات الكهربائية المعزولة عادة ما يمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر وتم استيعابه بنجاح بالخلايا المتلقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع التجارب على الحيوانات كانت وافقت لجنة الأخلاقيات المحلية التابعة لمعهد شانغهاي لبحوث الطب البيطري، الأكاديمية الصينية "العلوم الزراعية" (تصريح رقم: شفرياو-14-0101).

1-الثقافة في المختبر المنشقات

ملاحظة: المنشقات تمثل الإخطار البيولوجية. يجب ارتداء العمال قفازات مطاط في جميع الأوقات عند معالجة الديدان، والمعلقات شيستوسومال، أو أخرى ذات الصلة بالمواد البيولوجية. كانوا مصابين بأرانب نيوزيلندا سيركاريا ~ 2,000 التعرض عن طريق البطن. وجمعت المنشقات في مرحلة الكبد من الأرانب المصابين سيركاريا بالبلەارسيات س في الإصابة بعد 28 يوما قبل التروية الكبد والاوردة المساريقي العلوي. تمت الإشارة إليها إجراءات جمع دودة في المنشورات السابقة الإبلاغ عن الدراسات في الفئران18.

  1. جمع الطفيليات في كوب 500 مل. غسلها جيدا ويسخن برفق 3 x مع 200 مل من (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
  2. فصل أزواج دودة ~ 200 لكل طبق بيتري 90 ملم. ثم غسل الطفيليات جيدا ويسخن برفق 2 x مع 50 مل من (37 درجة مئوية) RPMI 1640 الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 100 يو للبنسلين و 100 مغ/مل من والستربتوميسين.
  3. الحفاظ على الطفيليات في 40 مل من RPMI 1640 مسخن الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية تحت 5% طبق CO2 في كثافة دودة ~ 5 أزواج/mL ل 2 ح في 90 ملم بيتري.
    ملاحظات: لا ينبغي أن تتضمن المتوسط RPMI 1640 المصل، وإلا سيتم عرض خارجية حويصلة خارج الخلية.

2-ما قبل المعالجة شرط وسائل الإعلام

  1. جمع المتوسطة الثقافة وثم الطرد المركزي المتوسطة في 4 درجات مئوية في 2,000 ز × مدة 30 دقيقة إزالة البيض والدودة tegmental الحطام.
  2. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وقم بتصفية الحل باستخدام عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر.
  3. جمع الحل التي تمت تصفيتها في كيس دياليزيد (وقف الوزن الجزيئي: 3.5kD) وبعد ذلك دياليزي الحل باستخدام محلول 8% PEG8000 في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظات: تعد هذه الخطوة مهمة لإثراء سجيفس لزيادة عائد العزلة سجيفس.

3-عزل سجيفس

  1. نقل الحل دياليزيد إلى أنبوب جديد ثم قم بإضافة 0.5 حجم الكاشف العزل التام اكسوسومي.
  2. مزيج الحل جيدا من قبل فورتيكسينج أو بيبيتينج صعودا وهبوطاً لضمان التجانس للحل.
  3. احتضان هذا الخليط عند درجة مئوية 2 إلى 8 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. الطرد المركزي الخليط في 15,000 ز × ح 1 عند 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية.
  5. نضح وتجاهل المادة طافية.
    ملاحظات: وترد المركبات الكهربائية في بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب (غير مرئي في معظم الحالات).
  6. ريسوسبيند بيليه المركبات الكهربائية في 2 مل من برنامج تلفزيوني ومن ثم تخزين حل المركبات الكهربائية في-80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.

4-توصيف المركبات الكهربائية من النشاف الغربية

  1. تحديد تركيز العينة سجيفس، مثلاً، باتفاق التعاون الأساسي مقايسة البروتين.
  2. إعداد 10-20 ميكروغرام من المركبات الكهربائية في ميليلتر 22.5 ريبا المخزن المؤقت. قم بإضافة ميليلتر 7.5 من 4 × تحميل المخزن المؤقت والحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
  3. فصل البروتينات سجيفس بهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12%.
  4. نقل البروتينات إلى غشاء PVDF والتحقيق ثم مع الأجسام المضادة-CD63 (1:1، 000 تمييع)، متبوعاً بالتحقيق مع أرنب المضادة مفتش-برنامج الصحة الإنجابية (1:5، وتمييع 000).
  5. استخدام كاشف كشف مسافنة للتنمية الغشاء والكشف عن الإشارات التي تشيميلومينيسسينسي نظام التصوير.

5-توصيف المركبات الكهربائية مجهر إلكتروني

  1. إضافة 2 ميليلتر من سجيفس معزولة إلى 200 شبكة الشبكات المغلفة فورمفار وثم السماح له جاف في درجة حرارة الغرفة.
  2. وصمة عار مع 2% حمض فوسفوتونجستيك لمدة 1 دقيقة وثم السماح له جاف في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحميل الشبكات على صاحب العينة المجهر الإلكتروني انتقال ويتعرضون لشعاع إلكترون كيلوفولت 80 لالتقاط الصور.

6-سجيفس التسمية مع PKH67 ومقايسة الامتصاص الخلية

ملاحظات: وأجريت كل الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية)، ما لم يبين خلاف ذلك.

  1. نقل 5 ميكروغرام الحل سجيفس في أنبوب البولي بروبلين قاع مخروطي وضبط مستوى الصوت إلى 12 مل بإضافة المتوسط RPMI 1640.
  2. الطرد المركزي في سجيفس في 110,000 × ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه سجيفس.
  3. بعد الطرد المركزي، بعناية نضح المادة طافية.
    ملاحظة: صبغ اثانوليك PKH67 أن لا تضاف مباشرة إلى بيليه سيف، كهذا سيؤدي في تلطيخ غير متجانسة واستمرارية انخفاض الخلية.
  4. إعداد حل تعليق EV 2 x بإضافة 1 مل من "مادة ج" بيليه سيف؛ للتأكد من تشتت كاملة، ريسوسبيند مع بيبيتينج لطيف.
  5. قبل تلوين في "مادة ج"، إعداد 2 جديدة × صبغ الحل بإضافة 2 ميليلتر من الحل صبغ اثانوليك PKH67 إلى 1 مل من "مادة سي" في أنبوب الطرد مركزي البوليبروبيلين وخلط جيدا لتفريق.
  6. سرعة إضافة 1 مل x 2 تعليق EV (6.4 خطوة) إلى 1 مل 2 × "صبغ الحل" (الخطوة 6، 5) وعلى الفور خلط العينة بيبيتينج.
  7. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
  8. إيقاف تلطيخ بإضافة 4 مل FBS ومن ثم احتضانها لمدة 1 دقيقة.
  9. إضافة RPMI1640 المتوسطة ضبط حجم الصوت إلى 12 مل وثم الطرد المركزي في 110,000 ز × عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  10. إزالة المادة طافية وإضافة المتوسطة RPMI1640 ريسوسبيند PKH67 المسمى الكريات سيف.
  11. الطرد المركزي في 110,000 ز × عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة يغسل مرة واحدة ثم قم بإضافة برنامج تلفزيوني الكريات سجيفس ريسوسبيند.

7-مقايسة الامتصاص الخلية سجيفس

  1. خلايا الثدييات البذور مثل NCTC استنساخ 1469 الخلايا أو الخلايا HEK293T في البئر 6 لوحات (2 × 105 خلايا، كل بئر) والثقافة الخلايا بين عشية وضحاها.
  2. إضافة 5 ميكروغرام المسمى PKH67 سجيفس والثقافة ثم الخلايا في 37 درجة مئوية ح 2-4.
  3. بعد الحضانة، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين.
  4. إصلاح الخلايا مع 4% فورمالدهايد الحل لمدة 15 دقيقة وغسلها مرتين أكثر مع برنامج تلفزيوني.
  5. وصمة عار نواة الخلية مع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).
  6. مراقبة الخلايا باستخدام مجهر الأسفار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد مقدار عائد سجيفس معزولة باستخدام بروتوكول وصف، استخدمنا مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي للوصول إلى تركيز البروتين سجيفس المعزولة من المنشقات الكبار 28 يوما. كما هو مبين في الجدول 1، وتركيز البروتين سيف تراوحت ميكروغرام 208 إلى 250 ميكروغرام في 100 مل متوسطة (الجدول 1). حجم الجسيمات، كما يحدده تحليل نانوحبيبات مالفيرن، أشار إلى أن سجيفس المعزولة تتراوح من 100 نانو متر إلى 400 نانومتر، مع أعلى نسبة سكان حوالي 220 نانومتر في الحجم (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أثبتت الدراسات الأخيرة على المركبات الكهربائية المنشقات تلك المركبات دوراً هاما في المضيف الممرض التفاعلات3،9،،من1216. مواصلة التصدي لمهامها التنظيمية، من الضروري عزل المركبات الكهربائية من المنشقات. هنا، يمكننا وصف طريقة بديلة لعزل سيف. هذا الأسلوب ينتج حجم مجموعة واسعة من سجيفس، من 100 نانو متر إلى 400 نانومتر، في البالغين بالبلەارسيات س. مقايسة الامتصاص الخلية التالية أشارت إلى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة كانت، جزئيا أو كلياً، تدعمها الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة الصين (31472187 و 31672550) والعلوم الزراعية والتكنولوجيا برنامج الابتكار من الأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > مادة < / قوي >
كاشف عزل الكلي للإكسوسوم (من وسائط زراعة الخلايا)ThermoFisher SCIENTIFIC4478359لعزل S. japonicum حويصلات خارج الخلية
PKH67Sigma-aldrichMINI67لوضع العلامات Evs
RPMI 1640 MediumThermoFisher SCIENTIFIC11875119لزراعة الطفيليات
البنسلين الستربتومايسينثيرموفيشر 15140122
0.22 & مرشح المحقنةm MerckSLGP033RB
SnakeSkin DialysisTubing Thermo SCIENTIFIC68035
PEG8000Sangon BiotechA100159 
RIPABeyotimeP0013B
EMD Millipore & trade ؛ Immobilon&Trade; الركيزة الكيميائية الغربية HRP (ECL)فيشر WBKLS0100 العلمي 
DAPI Cell Signaling Technology4083
BCA kitBeyotimeP0010
CD63 الأجسام المضادةSangon BiotechD160973-0025
PVDFBio-Rad1704273
Formvar / Carbon 400 MeshTed Pella01754-F
Phosphotungstic AcidTed Pella19402
مكافحة الفأر IgG-HRPCWBIOCW0102
NCTC استنساخ 1469 خليةATCCATCC & reg ؛ CCL-9.1 & التجارة ؛
FBSHyCloneSV30087.02
Equipment< / strong>
GE نظام التصوير الكيميائيImageQuant LAS4000mini
الفحص المجهري الإلكترونيهيتاشيH-7600
Milli-Q الماءMilli-QMilli-Q Elix
Eppendor أجهزة الطرد المركزي Eppendorf5804R
Zetasizer NanoMalvernZetasizer Nano ZS  
جهاز طرد مركزي فائقBeckmanOptima L-100 XP حاضنة أجهزة الطرد
الفائقة ESCOCCL-107B
مجهرZeissAxin Observer Z1
العلمية GE جهاز طرد مركزي المركزي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
  2. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  3. Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).
  4. Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  6. Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
  7. Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).
  8. Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
  9. Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488(2014).
  10. Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
  11. Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).
  12. Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
  13. Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
  14. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
  15. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  16. Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).
  17. Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885(2016).
  18. Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).
  19. Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD63 PKH67

مقالات ذات صلة