هذا البروتوكول وصف أسلوب المنشأة حديثا لإيصال الفيروس إلى البروستاتا مورين. استخدام التكنولوجيا كريسبر/Cas9، overexpression الجينات، أو تسليم recombinase لجنة المساواة العرقية، التقنية تسمح التعديلات أورثوتوبيك التعبير الجيني ويطبق نموذج رواية ماوس لسرطان البروستاتا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فيروس تقديم أدلة كريسبر للبروستاتا موريني لتحوير الجينات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مع تزايد الإصابة بسرطان البروستاتا، تحديد برامج تشغيل جديدة لاستئصال ورم أو المغيرون أمر حاسم. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيم) لسرطان البروستاتا تتعرقل بسبب التغايرية الورم ودينامياتها microevolution المعقدة. نماذج الماوس سرطان البروستاتا التقليدية تشمل، بين أمور أخرى، germline والشرطي بالضربة القاضية، والتعبير المعدلة وراثيا والمسرطنة ونماذج إكسينوجرافت. جيل طفرات حيثياته في هذه النماذج معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا. وباﻹضافة إلى ذلك، تستهدف معظم النماذج التقليدية غالبية ظهارة البروستاتا، بينما من المعروف سرطان البروستاتا البشرية تتطور كحدث معزول في مجموعة فرعية صغيرة فقط من الخلايا. نماذج قيمة تحتاج إلى محاكاة ليس فقط بدء سرطان البروستاتا، ولكن أيضا التقدم إلى مرض متقدمة.
هنا يصف لنا أسلوباً لاستهداف خلايا قليلة في ظهارة البروستاتا بخلايا ترانسدوسينج بالجسيمات الفيروسية. تسليم الفيروسات المحورة للبروستاتا مورين يسمح تحوير الجينات في ابيثيليا البروستاتا. بموجب هذا سيحدد نوع الفيروس وكمية عدد الخلايا المستهدفة لتحوير الجينات التي ترانسدوسينج الخلايا قليلة لبدء السرطان والعديد من الخلايا للعلاج الجيني. عن طريق حقن المستندة إلى عملية جراحية في الفص الأمامي، البعيدة عن مسار البول، يمكن توسيع الورم في هذا النموذج دون الإخلال بوظيفة الجهاز البولي للحيوان. وعلاوة على ذلك، باستهداف مجموعة فرعية فقط من الخلايا الظهارية البروستاتا الأسلوب يتيح التوسع في الاستنساخ للورم، ويحاكي ذلك الشروع في الأورام البشرية، والتقدم، فضلا عن غزو من خلال الغشاء القاعدي.
هذا الأسلوب الرواية نموذجا سرطان البروستاتا قوية مع تحسين مدى صلة الفسيولوجية. الحيوانات تعاني محدودة، وحيث لا توجد تربية إضافية غير مطلوب، يتم تقليل عدد الحيوانات عموما. في الوقت نفسه، هو الإسراع في تحليل الجينات المرشحة الجديدة والممرات، التي هي بدورها أكثر فعالية من حيث التكلفة.
المقدمة
الكشف والعلاج من سرطان البروستاتا تحسنت إلى حد كبير خلال العقد الماضي. لا يزال، هو تزايد حالات الإصابة بسرطان البروستاتا، عقب متوسط العمر المتوقع. ما يقدر 1.1 مليون حالة جديدة في جميع أنحاء العالم، ومن بين الأسباب الأكثر شيوعاً للوفيات المتصلة بالسرطان في الرجال 1. سرطان البروستاتا بطيئة في تنميتها، ولكن عندما تقدمت السرطان المنتشر دولة متقدمة، التكهن الفقراء بسبب خيارات العلاج محدودة. حتى الآن، تم التعرف على الجينات قليلة فقط كبرامج مشتركة في هذا النوع من السرطان، وعن عدم التجانس ومولتيفوكاليتي يعوق الكشف عن المؤشرات الحيوية واستهدافها المرض السائقين2،3.
غالباً ما هي ضعف التقنيات الكلاسيكية لتوليد جيمس بالتعقيد والنفقات في الوقت المناسب، والتكاليف. نماذج مشروطة بالضربة القاضية قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة الجينات المرشحة سرطان البروستاتا، أن تسفر عن الفتك الجنينية عند إلغاء تنشيطه ب الفعل4. النماذج الأكثر شيوعاً تشمل recombinase لجنة المساواة العرقية خاصة بالبروستاتا تحركها أما بروباسين معدلة5 أو مروج6 بسا المتكاملة في جيم واسطة التهجين إضافية. في هذه النماذج، سيتم استهداف الجين للفائدة في معظم الخلايا الظهارية البروستاتا، توليد تضخم في الجهاز كامل، التي قد تنال من الحيوان المسالك البولية الدالة7.
تسليم الفيروسية من البروتين لجنة المساواة العرقية عن طريق الحقن في الفص الأمامي من البروستات مورين يمكن حل هذه المشكلة باستهداف بعض الخلايا8فقط. مراعاة لمختبرات المتطلبات التقنية والخبرة، والأهداف، فوائد الأسلوب من طائفة واسعة من الاختلافات المحتملة. وقد تبين النهج الناجحة استخدام إتش استهداف جانب و فتن9 أو استهداف فتن و Trp5310 لينتيفيروس بين أمور أخرى. إضافة المتسلسلات، مثل لوسيفراس، في بناء الفيروسية أو جيم سيمكن علاوة على ذلك رصد تطور المرض عن طريق الإضاءة الحيوية التصوير11غير الغازية.
تحرير المجين على أساس تكنولوجيا كريسبر/Cas9 يكشف عن فرصة جديدة وسريعة لدراسة السرطان عن طريق توليد السريع للضربة القاضية جسدية12. تسليم الفيروسية دليل واحد الكشف (سجرناس) موجهة إلى الفص الأمامي من البروستات مورين ينشئ نموذجا أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لسرطان البروستاتا. بهذه الوسائل، يمكن أن تشكل الخلايا المفردة التي تحمل طفرات المختار الحيوانات المستنسخة التي قادرة على التوسع والغزو. وعلاوة على ذلك، سوف تولد استخدام دليل الكشف عن الجينات المستهدفة متعددة استنساخ الخلية مع التعديلات في جينات مختلفة. هذا سوف يسمح التغايرية الورم وضغط انتقاء الطبيعي في تطور السرطان، التي يمكن أن تكشف عن أهمية كل تحوير الجينات أو آليات ابيستاتيك.
هنا نقدم طريقة لتوصيل الجزيئات الفيروسية إلى البروستاتا مورين لتحوير الجينات. بشق البطن صغيرة، يتعرض الفص البروستاتا الأمامي مورين ويتم حقن الجسيمات الفيروسية الفص. خمسة أيام ويمكن إزالة مقاطع ما بعد الجراحة، والجراحة من الجلد وسرطان البروستاتا يمكن أن تحلل من 8 أسابيع بعد. وعموما، هذا هو إجراء سريع وفعال من حيث التكلفة، مما له أثر ضئيل على الماوس ويسمح الورم أكبر لتطوير دون المساس بالماوس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ويشمل هذا البروتوكول إجراء العمليات جراحية في الفئران المختبرية. يجب استعراض جميع التجارب على الحيوانات فردياً ووافق "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك). كما النهج يستند إلى انتعاش الحيوانات والبقاء على قيد الحياة، ضمان التخدير المناسبة وإدارة الألم وبيئة العمليات جراحية معقمة في كل وقت. استخدم وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء الجراحة وحتى التعافي من التخدير.
1-ابتداء من الاعتبارات
- اعتماداً على هذا الفيروس المستخدمة، قد تنطبق متطلبات عيار مختلف؛ يضعف هذا الفيروس تبعاً لذلك.
ملاحظة: في هذا المثال، يتم حقن فيروسات المرتبطة بالغدة المخفف في برنامج تلفزيوني في عيار 1 × 1012 وحدة دولية/مل. الفيروس النمط المصلي المسيطر 9 ويحتوي على دليل الحمض النووي الريبي فتن والتعبير عن البروتين لجنة المساواة العرقية تحت مروج أوبيكويتين (الشكل 1). وزيادة فقدان فتن باكت وتكاثر ظهارة البروستاتا13. - استخدام الفئران الذكور في سن 8 أسابيع في وقت الجراحة لضمان التنمية البروستاتا كافية.
ملاحظة: الفئران أظهرت في هذه التجربة هي الفئران knockin Rosa26-LSL-Cas9-اجفب على C57BL/6J الخلفية12 (الشكل 1). - إعداد طازجة مزيج تخدير عام وإذا أمكن الحفاظ على العقيمة.
ملاحظة: لاسترداد الحيوان أفضل بعد عملية جراحية، ترياق تخدير ينصح بشدة.- إعداد إجمالي حجم 5 مل مخدر، مزيج 0.15 مل ميديتوميديني هيدروكلوريد (1 ملغ/مل) و 0.4 مل الميدازولام (5 ملغ/مل) 0.25 مل بوتورفانول (10 مغ/مل) مع 4.2 مل المياه المالحة العقيمة.
ملاحظة: يمكن استخدام أساليب التخدير البديلة، مثل isoflurane هنالك، وفقا للمبادئ التوجيهية مؤسسات الرعاية الحيوانية. - لعكس تأثير هيدروكلوريد ميديتوميديني ما بعد الجراحة، مزيج 0.1 مل أتيباميزولي (5 ملغ/مل) مع مل 4.9 تعقيم المياه المالحة.
- إعداد إجمالي حجم 5 مل مخدر، مزيج 0.15 مل ميديتوميديني هيدروكلوريد (1 ملغ/مل) و 0.4 مل الميدازولام (5 ملغ/مل) 0.25 مل بوتورفانول (10 مغ/مل) مع 4.2 مل المياه المالحة العقيمة.
- إعداد بيئة معقمة جراحي السليم التطهير والتعقيم. اﻷوتوكﻻف الأدوات الجراحية قبل الاستخدام.
2-الفيروس--التسليم للبروستاتا مورين
- تخدير الحيوان عن طريق الحقن داخل مع المحاقن معقمة 1 مل وابرة 27 x ½ ". استخدام جرعة تخدير 0.01 مل/غرام من وزن الجسم. إذا كان الإجراء تستغرق وقتاً أطول من 30 دقيقة، المحافظة على التخدير عن طريق حقن جرعة 1/3 لبدء كل 30 دقيقة.
- فحص عمق مخدر بتقييم استرخاء العضلات، وسحب دواسة، وردود الفعل بالبيبرال. عندما يلاحظ فقدان ردود الفعل، يحلق أسفل البطن للحيوان.
- عناية تغطي عيون الحيوان مع مرهم العيون البيطرية باستخدام مسحه القطن معقمة للوقاية من العمى نظراً انعدام منعكس القرنية.
- مسح البطن حلق مع 70% إيثانول و 10% البوفيدون اليود لتطهير منطقة العمليات الجراحية. فرك المنطقة الجراحية من وسط منطقة الجراحية نحو المحيط.
- تنفيذ شق جلد رأسي في خط الوسط المنخفض البطن تقريبا 1 سم باستخدام مقص جراحي عقيمة.
- رفع استخدام ملقط نقطة غرامة لمنع إتلاف الأجهزة التي يتم زرع تحت الصفاق. بعناية تجعل شق < 8 مم باستخدام مقص جراحي عن طريق الصفاق.
ملاحظة: خلافا للإنسان، غدة البروستاتا القوارض يشمل أربعة فصوص منفصلة. ومرفق حويصلة الفص الأمامي. - تحرك بلطف في الأنسجة الدهنية جانبا لكشف حويصلة. استخدام ملقط خاتم، ترفع بعناية تحديد حويصلة حتى يمكن أن تكون البروستاتا الأمامي (الشكل 1).
- إدخال إجمالي حجم 30 ميليلتر الفيروسات (3 × 1010 الجسيمات الفيروسية) الحل في ظهارة البروستاتا الأمامي باستخدام حقنه الأنسولين 0.5 مل بإبرة 30 × 8 مم. تقليل التسرب وضمان يمتص السوائل داخل الأنسجة، تشكيل فقاعة صغيرة. ضع حويصلة مرة أخرى في تجويف البطن.
- خياطة الصفاق مع 2-3 غرز توقف بسيطة باستخدام خيوط قابلة للامتصاص 6-0 مع 13 مم، ودائرة 3/8، وابرة نقطة تفتق.
- ترصيص الجلد مع 3 مقاطع العقيمة 4.8 x 6.5 مم رفع الجلد مع الملقط لتجنب إتلاف الصفاق.
- لاسترداد أفضل، تطبيق الترياق التخدير بجرعة 0.01 مل/غرام من وزن الجسم بالحقن داخل استخدام المحاقن معقمة 1 مل وابرة 27 x ½ ". بعناية بوضع ظهر الحيوان في قفصة.
3-الجراحة بعد انتهاء الإجراءات
- إبقاء القفص مع الفئران التي أجريت له عملية جراحية على وسادة تدفئة ح 1 بعد هذا الإجراء، لمنع انخفاض حرارة الجسم حتى شُفي تماما. إذا تم تطبيق الترياق، الحيوان ينبغي أن تكون مستيقظا بضع دقائق بعد الحقن.
- مراقبة الحيوانات يوميا للمؤشرات المناسبة الجرح تضميد الجراح والألم. إذا لزم الأمر، إدارة مسكنات الآلام الإضافية وفقا للمبادئ التوجيهية لمؤسسات الرعاية الحيوانية.
- إزالة مقاطع الجلد بعد 4-5 أيام، وبمجرد إغلاق الجرح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقييم إيصال الفيروس إلى البروستاتا مورين، حللت العينات ثلاثة أشهر بعد الجراحة. الفئران Rosa26-LSL-Cas9-اجفب12 الإعراب عن التجارة والنقل في الخلايا التي تعرضت للبروتين Cre أعرب بالفيروس. تم فحص عينات البروستاتا مع مجهرية الأسفار تحديد المجالات مع بروتينات فلورية خضراء إشارة (الشكل 2A). بروتينات فلورية خضراء إشارة يشير إلى نشاط لجنة المساواة العرقية في ظهارة البروستاتا ولكن ليس ما إذا كان تحرير الجينات قد تم الناجمة عن الدليل كريسبر. وأظ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لتغيير التعبير الجيني في الفص الأمامي من البروستات موريني بحقن الفيروس، إنشاء نموذج ماوس جديدة قوية لسرطان البروستاتا (الشكل 2). ووصف الإدارة الناجحة إتش أولاً ليوو et al. ، في عام 20058. وقد أظهرنا سابقا كيف الترميز إتش لبروتين recombinase Cre يمكن استبدال التهجين تستغرق وقتاً طويلاً من اليل لجنة المساواة العرقية للحذف الخاصة بالانسجة 9 (الشكل 2D). منذ الفيروس يصيب بعض الخ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ومولت السيد على زمالة من جمعية السرطان الدانماركية (R146-A9394-16-S2). ومولت مفب والشرائية من نوفا أف (AUFF-E-2015-FLS-9-8). شارك السيد ومفب مولت من مدرسة الدراسات العليا، والصحة، والاتحاد الأفريقي. المختبر E.F.W. معتمد من المنح المقدمة من وزارة الاقتصاد (SAF2015 70857، يشترك في تمويله سيطلب-الاتحاد الأوروبي) ومنسق المتقدم منحة (741888-منظمة التضامن المسيحي الدولية--المرح) الإسبانية.
نريد أن نشكر "ليليانا" فاجاردو ميلر (الجينات والتنمية والمرض؛ مركز أبحاث السرطان الوطني) لقراءة نقدية من المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي> المعدات< / قوي> | |||
| B6J.129 (B6N) -GT (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *، -EGFP)Fezh< / sup> / J الفئران | مختبر جاكسون | 26175 | |
| 0,5 مل حقنة الأنسولين U-100 | BD | 324825 | لحقن الفيروسات |
| 1 مل حقنة | BD | 300013 | لحقن التخدير |
| 30 جم 1/2 ' إبرة | BD | 304000 | لحقن التخدير |
| 6-0 خياطة Polysorb | Medtronic | GL889 | لإغلاق الصفاق |
| ستارة الجراحة المعقمة التي يمكن التخلص منها | موردين | ||
| متعددين وسادة التدفئة | موردين متعددين | ||
| Povidone-Iodine Prep | Pad Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| التشذيب آلة | Aesculap | GT415 | لحلاقة البطن |
| ملقط دومون | FST | 11252-00 | |
| حامل إبرة هالسي | مايكرو FST | 12500-12 | |
| مقص قزحية | FST | 14094-11 | |
| ملقط نمط ضيق | FST | 11002-12 | |
| ملقط دائري | FST | 111006-09 | |
| مقبض نظام مشبك الجرح بما في ذلك مقاطع | FST | 12030-01 | لإغلاق الجلد |
| مزيل نظام مشبك الجرح | FST | 12030-04 | |
| استخدام نماذج مختلفة | |||
| <قوية > كواشف < / قوية > | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | تم الحصول عليها من المنشأة الحيوانية | ||
| بوتورفانول | التي تم الحصول عليها من المنشأة الحيوانية | ||
| Medetomidinhydrochlorid | التي تم الحصول عليها من المنشأة الحيوانية | ||
| Midazolam | التي تم الحصول عليها من المنشأة الحيوانية | ||
| 100٪ الإيثانول | فيشر Scientific | 22-032-103 | |
| مرهم العين | Takeda | 7242 | |
| الفيروس (AAV ، AV) | الموردين | المستخدم في هذا البروتوكول هو | |
| جسم مضاد داخلي pAKT | CST | 4060 | يستخدم 1: 200 تخفيف |
| GFP anitbody | CST | 2956 | يستخدم 1: 100 |
المراجع
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454(2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
