ويوفر نهج مثالي للكشف عن تغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا على الصعيدين الفردي وسكاني التصوير التدفق الخلوي. قد تجلى تعطل وظيفة اندوسيتيك لعرض مستضد الدهن في الخلايا الجذعية البشرية المعرضة للملوثات مع ترانسكريبتوميك مجتمعة التنميط التعبير الجيني ومظاهره المورفولوجية للاتجار بالبروتين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحليل سكاني لتغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للبروتينات اندوسيتيك صعبة بسبب الطلب على التقاط الصور في إجراء تحليل صورة الإحصائية ومستوى خلية واحدة على مستوى سكاني. وللتغلب على هذه الصعوبة، استخدمنا التصوير التدفق الخلوي وترانسكريبتوميك التنميط (الحمض النووي الريبي-seq) لتحديد تغيير التعريب سوبسيلولار بالمجموعة من التمايز د 1 البروتين (CD1d) المرتبطة بالتعبير الجيني اندوسيتيك البصر في الإنسان الخلايا الجذعية (DCs)، التي تتعرض للمشترك محبتين الهواء الملوثات بنزو [أ] بيرين. وقد تم تحليل كولوكاليزيشن CD1d والبروتينات علامة اندوسيتيك Lamp1 الآلاف من خلية الصور التي تم التقاطها مع التصوير التدفق الخلوي استخدام الأفكار وفيجي إيماجيج البرامج. كانت تصور العديد من الصور الخلوية مع البروتينات CD1d و Lamp1 شارك الملون بعد النابضة في CD1d+Lamp1+ وحدات تحكم المجال Dc باستخدام الأفكار. كولوكاليزاتيون CD1d و Lamp1 المعززة عند التعرض تجلى كذلك استخدام سكاتيربلوتس ثريشولديد، اختبار مع المعاملات في ماندر لكثافة مترجمة شارك، ودبر BaP استناداً إلى النسبة المئوية للمناطق شارك المترجمة باستخدام إيماجيج وفيجي. وتوفر البيانات لدينا نهج الآلي و bioinformatic مفيدة لقياس البروتين كولوكاليزاتيون على المستويات الخلوية كل واحد وسكاني، دعم البصر نتيجة وظيفية لتغيير ترانسكريبتوميك في الإنسان المعرضة للملوثات وحدات تحكم المجال Dc.
المقدمة
مستضد العرض التقديمي عادة ما ينطوي على البروتين داخل الخلايا الاتجار بالأشخاص، التي قد تحقق غالباً استخدام توصيف الخصائص المورفولوجية والتنميط المظهرية من مستضد تقديم الخلايا1،2،3 . لدمج مزايا التصوير وأساليب فينوتيبينج، يصف لنا منصة تحليل تصوير في كل من خلية مفردة ومستويات السكان تبرهن كولوكاليزيشن تغيير بروتين في الخلايا الجذعية البشرية (DCs). في الببتيد مستضد العرض الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات الربط ببتيد قصيرة (8-10 البقايا) في هيولى لتنشيط CD8 التقليدية+ تي الخلايا، بينما MHC class ثانيا جزيئات تربط أطول نسبيا الببتيد (بقايا ~ 20) في مقصورات اندوسيتيك لتنشيط خلايا CD4 التقليدية الخلايا+ ر1،4. على النقيض من ذلك، يتم تنشيط خلايا تي الخاصة بالدهن من البروتينات CD1 مع المستضدات الدهن تحميل أساسا في المقصورات اندوسيتيك5،6. يتطلب عرض مستضد الدهن المعروض من نواتج الأيض الدهون المنتجة في دهن الأيض7،،من89،10 والتحميل من نواتج الأيض الدهني الوظيفية للبروتينات CD1 في المقصورات اندوسيتيك5،6. وفي هذا السياق، مختلف العوامل الخلوية تحوير المادة الدهنية مستضد العرض، لا سيما في التعرض البيئي للملوثات محبتين والاضطرابات المناعية، أمرا حاسما لتعريفها. في هذه الدراسة، استخدمنا التحليل ترانسكريبتوميك وتنميط الصورة وتحليل التصوير الخلوية وسكاني للبشرية DCs المشتقة من الوحيدات لتحديد البروتين اندوسيتيك الاتجار بالمساهمة في عرض مستضد الدهن في التعرض للملوثات. بالتأكيد، يمكن تطبيق هذا المنهاج المشترك لدراسة الاتجار بالبروتين سوبسيلولار وكولوكاليزاتيون في مختلف العمليات البيولوجية.
من الناحية التقنية، تجلى التعريب سوبسيلولار البروتين عادة استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] وتحليلها إحصائيا في عدد محدود من الكشف عن الخلايا1،2،،من311. وعلاوة على ذلك، التدفق الخلوي طبق على نطاق واسع إلى بوابة الخلية السكان مع إشارات شارك الملون البروتينات متعددة على مستوى خلوي12؛ ولكن هذا يفتقر إلى وضع تصور مفصل للبروتين سوبسيلولار كولوكاليزيشن. لتحقيق تحليلات شاملة وإحصائية لنسبة البروتين كولوكاليزاتيون على المستويين الخلوي والسكان، ونحن إدراج التصوير نهج التنميط والتحليل لتحديد ملامح كولوكاليزاتيون البروتين مع البيولوجية أهمية. على وجه التحديد، يمكننا استخدام التصوير التدفق الخلوي للكشف عن كولوكاليزيشن CD1d وغشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (Lamp1) البروتينات في هذه الدراسة. وكان التحليل الكمي لجزيئات كولوكاليزيد سابقا صعبة يجب القيام بها في نطاق سكاني. في هذه الدراسة، علينا تكييف البرنامج ImageJ-فيجي للنظر في النسبة المئوية للبروتين كولوكاليزاتيون مع عدد كبير من الخلايا الملون المشترك على المستويين الخلوي سكاني والفردية. على وجه التحديد، قمنا بقياس المجالات شارك المترجمة وكثافة وحجم سكاني تدعم الاستنتاج بأن البروتين CD1d أبقى إلى حد كبير في أواخر مقصورات اندوسيتيك للإنسان وحدات تحكم المجال Dc في التعرض الملوثات محبتين بنزو [أ] بيرين (BaP)13 . توفير هذا الخلوي مجتمعة والسكان التصوير تحليل النتائج استنساخه بدرجة عالية وشاملة ويعتد به إحصائيا من CD1d-Lamp1 كولوكاليزيشن ذات الصلة بالمادة الدهنية تحول دون مستضد العرض التقديمي.
الترنسكربيتوم Dc البشرية المعرضة BaP تؤيد بقوة الفرضية القائلة بأن الأيض الدهني اندوسيتيك والاتجار اندوسيتيك CD1d كانت ضعف في التعرض BaP. لاختبار هذه الفرضية، طبقنا التصوير التدفق الخلوي الشخصية صور سكان العاصمة التي كانت تشارك ملطخة بالبروتينات متعددة بما في ذلك العاصمة علامات وعلامات اندوسيتيك و CD1d. أخيرا، حللت إحصائيا الخلايا الملون المشترك لإظهار النسبة المئوية لكثافة ومناطق كولوكاليزيشن CD1d و Lamp1.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بروتوكولات البشرية في هذه الدراسة قد أقر "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة سينسيناتي، وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح. وتم الحصول على عينات دم من المانحين صحية من مركز الدم هوكسوورث في المركز الطبي في جامعة سينسيناتي.
1-ترانسكريبتوميك التنميط من المعرضة للملوثات البشرية المشتقة من الوحيدات وحدات تحكم المجال Dc
- استخراج الحمض النووي الريبي مجموع البلدان النامية المعرضة BaP
- التفريق بين وحدات تحكم المجال Dc البشرية باستخدام السيتوكينات GM-CSF، وايل-4، وفضح وحدات تحكم المجال Dc إلى BaP لمدة 4 أيام13.
- فرز DCs يتعرض BaP استخدام التدفق الخلوي استناداً إلى علامات أعرب السطحية (النسب–هلا-الدكتور+)، معظمها يتكون من وحدات تحكم المجال Dc التقليدية (CD11c+CD1c+)13. نموذجياً، فرز 10,000 وحدات تحكم المجال Dc في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS، الطرد المركزي وحدات تحكم المجال Dc في 600 × g و 4 درجة مئوية لمدة 6 دقائق، وعلى الفور إزالة المادة طافية بالشفط باستخدام تلميح ماصة 1 مل.
- حالما تتم إزالة المادة طافية بالطموح، بيليه الخلية عن طريق إضافة 0.4 مل من "المخزن المؤقت" تحلل/ملزمة من عدة عزل الحمض النووي الريبي للتخزين في-80 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي الريبي.
- استخدام طقم عزل الحمض النووي الريبي مع مجموع البروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي لاستخراج الحمض النووي الريبي إجمالي14. قياس سلامة الجيش الملكي النيبالي باستخدام بيواناليزير15.
- تحليل ترانسكريبتوميك لفرز وحدات تحكم المجال Dc (الشكل 1A)
- إعداد المكتبة للجيش الملكي النيبالي-seq باستخدام مجموعة أدوات إعداد مكتبة الجيش الملكي النيبالي. وباختصار، تفتيت الجيش الملكي النيبالي بولي-أ معزولة (~ 200 bp)، وعكس نسخ الأجزاء إلى 1 حبلا من كدنا، واتبع بتوليف حبلا كدنا الثاني المسمى بواسطة dUTP.
- اضطر كدنا حبلا مزدوجة للمحول مع هيكل حلقة جذعية بعد تنقية حبة، إصلاح نهاية وتراجع دا. المكوس بقايا اليوراسيل في ستراند 2 حلقة كدنا ومحول مع الإنزيم المستخدم (كاشف الختان اليوراسيل على حدة) للحفاظ على خصوصية حبلا وفتح حلقة المحول لبكر.
- إجراء دورات 13 من PCR باستخدام كبسولة تفجير العالمية والخاصة بالرقم القياسي لإثراء المكتبة المفهرسة. تنظيف المكتبة وتشغيله على شريحة "بيواناليزير الحمض النووي حساسية عالية" للتحقق من جودة المكتبة وحجم التوزيع.
- استخدام أدوات القياس الكمي مكتبة ونظام PCR الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع معلومات حجم مكتبة لحساب المكتبة التركيز عن طريق أسلوب منحنى المعياري.
- التناسب تجمع مكتبات متوافقة مفهرسة فردياً وضبط التركيز الكلي النهائي إلى 15 بعد الظهر. أداء الجيل الكتلة مكتبة وتسلسل المكتبة في إعداد قراءة واحدة 1 × 50 شركة بريتيش بتروليوم لتوليد 25 مليون على ما يلي كل عينة.
- التسلسل
- تحميل الترتيب وفهرسة الكواشف على رفوف كاشف SBS وبي، على التوالي. ضع الكواشف في حمام مائي درجة مختبر ح 1 حتى جميعا قد ذاب الجليد ومختلطة الكواشف في كل زجاجة/الأنبوبة بشكل صحيح.
- إعداد مزيج السلعية بإضافة إنزيم المذابة صبغ و-20 درجة مئوية إلى الزجاجة ومزيج. إعداد حل هيدروكسيد الصوديوم طبقاً للإرشادات التي تظهر في التسلسل. وضع جميع المواد الكاشفة في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
- خلال ح 1 في انتظار فترة، السلطة في التسلسل. الانتظار لمحرك الأقراص دونوتيجيكت تظهر وقم بتوصيل الكمبيوتر إلى محرك أقراص شبكة اتصال.
- إطلاق برامج التحكم المنظم.
- إعداد 2 لتر حل صيانة المياه والصرف الصحي الذي يحتوي على 0.5% 20 توين و 0.03% المياه 300 درجة المختبر في بروكلين.
- في الرف كاشف SBS، إضافة ~ 100 مل من محلول الغسيل الصيانة لكل من زجاجات 8، والمسمار القمع أغطية للزجاجات. في الرف كاشف PE، إضافة ~ 12 مل من محلول صيانة المياه والصرف الصحي لكل من عشرة أنابيب مخروطية الشكل 15 مل، وتجاهل القبعات.
- رفوف تحميل الاثنين مع الحل تعبئة الزجاجات/أنابيب إلى جهاز التسلسل.
- من برامج التحكم المنظم، اختر "الغسيل الصيانة"؛ اتبع الإرشادات على الشاشة لتنظيف نظام التسلسل السوائل حتى يتم إكمال العملية.
- البدء "تشغيل جديدة" في علامة التبويب "سلسلة" من البرنامج؛ توجيه إخراج البيانات إلى محرك أقراص شبكة اتصال. اختر معلمات لقراءة واحدة 1 × 50 شركة بريتيش بتروليوم مع مكتبات فهرس واحد متعدد.
- بشكل اختياري، تسجيل الدخول إلى "لوحة الوصل التسلسل باسيسبيس" حيث أنه يمكن رصد حالة التسلسل عن بعد عن طريق الكمبيوتر أو الهاتف الذكي.
- تحميل "ورقة عينة" ل demultiplexing وتوفير المعلومات كاشف وفقا لمتطلبات البرامج.
- تحميل الكواشف SBS و PE للتسلسل. رئيس الوزراء النظام مع خلية تدفق المستخدمة (~ 15 دقيقة).
- وبمجرد الانتهاء من توليد الكتلة (ح ~4.5)، إخراج الخلية تدفق، طفيفة رش الخلية تدفق بالماء، ومسح الجاف باستخدام ورق العدسة. طفيفة رش الخلية تدفق مع الإيثانول 95% والقضاء على الجفاف. تحقق ضد ضوء للتأكد من أن السطح نظيفة دون الحطام أو بقايا الملح.
- بعد إكمال خطوة رئيس الوزراء، تحميل الخلية تدفق متفاوت المسافات وتبدأ التسلسل. سوف يتم تلقائياً تشغيل البرنامج "عارض تحليل تسلسل".
- مراقبة جودة البيانات التسلسل عبر ساف بما في ذلك كثافة الكتلة، ما يلي: تمرير مرشح، تمرير كتلة عامل التصفية %، % ≥Q30، وتركه المرحلة/الطور الأول %، فهرسة ومراقبة الجودة، إلخ وهذا يساعد على فهم نوعية البيانات، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
- تغيير طوقا خلية تدفق وأداء "يغسل الصيانة" بعد الانتهاء من التسلسل. التسلسل جاهز للتشغيل التالية.
- تحليل بيوينفورماتيك
- أداء تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي13المعلوماتية الحيوية.
2-مسار تحليل الملامح ترانسكريبتوميك (الشكل 1B)
- استخدم المقلم بيوكوندوكتور لمقارنة التهم كثافة التعبير الجيني الناتجة بين وحدات تحكم المجال Dc BaP مكشوفة وغير مكشوفة من ثلاث جهات مانحة. ثم تحديد الجينات أعرب متفاوتاً بين وحدات تحكم المجال Dc BaP المكشوفة وغير المكشوفة استناداً إلى التغيير المطلق إضعاف (> طيات 2) واكتشاف كاذبة معدل القيم (FDR)-المعدل ف-(< 0.05).
- للتنبؤ مجموعات وظيفية من خلطات أعرب عن الجينات، استخدام حزمة البرامج توبكلوستير للبحث عن المورثات المعدلة ضد العديد من قواعد البيانات بما في ذلك كيج وريكتومي وتوليد بيانات التجميع. توبكلوستير يستخدم اختبار الهندسة الفوقية للحصول على الإثراء الوظيفي عن طريق تحليل إثراء قائمة الجينات16.
- كذلك إدخال النتائج من هذه المجموعات الدالة إلى سيتوسكابي17،18 نسخة 3.3.0، منصة برمجيات مصدر مفتوح المستخدمة على نطاق واسع لتصور الشبكات المعقدة. وهكذا تظهر الجينات المشاركة في مجموعات مختلفة أو المسارات، بما في ذلك استقلاب الدهون، ومجموعات اندوسيتيك في شبكة الاتصال مع الشرح لون من إضعاف متوسط تغير الجينات التعبير (الشكل 1B)13.
3-تصوير التدفق الخلوي CD1d وكولوكاليزيشن Lamp1
- جسم وسم BaP تتعرض البلدان النامية
- فضح 0.5 × 106 DCs البشرية إلى 5.94 مم BaP لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية في 2 مل من إكمال دولبيكو المتوسطة "تعديل النسر". حصاد وحدات تحكم المجال Dc بالطرد المركزي في 400 غرام x للحد الأدنى 10 كتلة DCs المتباينة التي تفرخ الخلايا مع مانع مصل الدم البشري والإنسان المضادة الأجسام المضادة لمستقبلات Fc لمدة 10 دقيقة في الجليد، بما في ذلك الأجسام المضادة الإنسان CD16 و CD32 و CD64.
- احتضان "البنفسجي الرائع" 421-مكافحة--CD1c (L161)، فيكوريثرين/سينين صبغ 7 (PE/Cy7)--مكافحة--هلا-الدكتور، و PE/Cy5-ضد-CD11c مع وحدات تحكم المجال Dc لمدة 20 دقيقة في الجليد. ويبين الجدول 1 قائمة بهذه الأجسام المضادة.
- إصلاح وحدات تحكم المجال Dc مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني وبيرميبيليزي لهم مع "المخزن المؤقت للغسيل بيرميبيليزيشن". القيام بتلوين داخل الخلايا مع مزيج الإنسان المضادة المنقاة PE المسمى CD1d (51.1) والمسمى أليكسا فلور 647 مكافحة--Lamp1 (CD107a) (H4A3).
- التصوير قياس التدفق الخلوي (الشكل 2)
- تحليل العينات ملطخة باستخدام سيتوميتير تدفق تصوير في صميم التدفق الخلوي لمستشفى سينسيناتي "الأطفال" استخدام هدفا X 40 تسفر عن 300 بكسل لخلية مع حوالي 10 ملم في القطر. حجم بكسل واحد حوالي 0.5 مم من 0.5 مم للكائن.
- الحصول على 10000 صور الخلوية بطريقة غير متحيزة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4-التصوير تحليلات للتدفق الخلوي الصور
- تحليل كولوكاليزيشن باستخدام أفكار البرمجيات (الشكل 2)
- أداء التعويض مع الملطخة واحد مقابل عينات غير ملطخة بتعيين كثافة fluorescence عينات غير الملون عن العتبة، بما في ذلك غير الملون DCs BaP مكشوف مع BaP أوتوفلوريسسينسي، كما هو الحال في بيانات روتينية التدفق الخلوي تحليل.
- بوابة الملون الخلايا للحصول على مجموعات فرعية من هلا-الدكتور+CD11c+CD1d+Lamp1+ الخلايا (الشكل 2A) وإظهار الصور الخلوية في مجموعات فرعية المبوب (الشكل 2).
- حفظ صور الخلية في تنسيق png استناداً إلى معايير الاشتمال التقنية اثنين، البصرية وجود إشارات قوية شارك الملون والتعريب سوبسيلولار للبروتينات CD1d و Lamp1، للتحاليل كولوكاليزاتيون باستخدام إيماجيج وفيجي (الشكل 2).
- استخدام برنامج إيماجيج وفيجي لإجراء تحليل كولوكاليزيشن (الشكل 3).
- إعداد ملفات الصورة المدخلة عن طريق دمج الصور المحفوظة خلية 100 لغير المكشوفة والمعرضة BaP DCs البشرية، على التوالي (الشكل 3A).
- تحليل CD1d (أحمر) و Lamp1 كولوكاليزاتيون (الأخضر) باستخدام سكاتيربلوت.
- قم بتشغيل برنامج إيماجيج وفيجي. فتح ملف.png مع 100 صور الخلية (الشكل 3B و الشكل 4A): "الملف | فتح ".
- تقسيم الصورة مع قنوات الأحمر والأخضر المدمجة إلى اثنين من الصور مع قناة خضراء أو حمراء: "صورة | لون | تقسيم القنوات ".
- رسم سكاتيربلوت استخدام الأوامر "تحليل | كولوكاليزيشن | عتبة كولوكاليزيشن ". حفظ سكاتيربلوت استخدام مفتاح "PrintScreen" .
- حساب ماندر في كولوكاليزاتيون معاملات لكل صورة الخلوية واحدة (n = 100) (الشكل 4 باء)
- حدد صورة خلية واحدة فقط في ملف الصورة مع تقسيم القنوات باستخدام "البيضاوي" أداة التحديد.
- استخدام أوامر "تحليل | كولوكاليزاتيون | عتبة كولوكاليزيشن ". حدد "القناة الأولى" من مربع الحوار لمنطقة فائدة (العائد على الاستثمار). الاحتفاظ بكافة خيارات الحساب، بما في ذلك "ماندر لاستخدام عتبات" لكل صورة الخلية.
- كرر هذه العملية الحسابية لكل 100 خلية الصور.
- حفظ وفتح النتائج باستخدام جدول بيانات.
- الأرض متوسط والأخطاء المعيارية "معاملات ثريشولديد ماندر" (n = 100, 0 يعني لا كولوكاليزاتيون و 1 يعني الكمال كولوكاليزاتيون). استخدم اختبار t للطالب لحساب قيمة ف للمقارنة بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة (الشكل 4 باء).
- حساب النسبة المئوية لكثافة بكسل ثريشولديد مترجمة المشترك بين CD1d و Lamp1 لصور متعددة في الخلية (n = 100) (الشكل 4).
- استخدام بروتوكول تحليل نفسه في 4.2.3 وحدد الخيار نتيجة "% كثافتها عتبة كولوكاليزيد"بالإضافة إلى ذلك.
- إجراء هذا التحليل جنبا إلى جنب مع معاملات كولوكاليزاتيون في ماندر.
- وبالمثل الأرض متوسط والأخطاء المعيارية لكثافة % كولوكاليزيد بين CD1d و Lamp1. استخدم اختبار t للطالب لحساب قيمة ف للمقارنة بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة (الشكل 4).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الملوثات محبتين BaP تبديل مجموعات الجينات اندوسيتيك في DCs المشتقة من الوحيدات DCs. الإنسان البشري من كل جهة مانحة (n = 3) المحتضنة مع BaP وفرزها لوحدات تحكم المجال Dc التقليدية، التي كانت تستخدم كذلك لتحليل الحمض النووي الريبي الاستخراج وترانسكريبتوميك كما هو موضح . عند تطبيع التعبير الجيني، جمعت الجينات المتغيرة بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة وفقا للعلاقة الوظيفية الأثران عن الجينات. ونحن إدخال قائمة الجينات المعدلة للبرنامج توبكلوستير16 لتحليل المسارات...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هو تحدي تأكيد طريقا المعدلة الجينات الوظيفية، بسبب الجينات أثرت على نطاق واسع التي تنطوي على مسارات متعددة، وصعوبة إدماج الأنشطة الخلوية الفردية وسكاني. استخدمنا التصوير التدفق الخلوي للتحديد اختبار CD1d الاتجار في المقصورات اندوسيتيك. التصوير التدفق الخلوي يدمج سكاني قياس الخلايا والمظاهرة كل من كولوكاليزيشن سوبسيلولار من البروتينات المتعددة. [كنفوكل] مجهرية سبق لها تقديم عالية الدقة في قياس كولوكاليزاتيون البروتين، والتدفق الخلوي قادرة على توفير فينوتيبينج شاملة للسكان خلية مختلفة. التصوير التدفق الخلوي يجمع بين مزايا ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون جوليتو روبرت (مركز الدم هوكسوورث) لعينات الدم البشري ويقرأ الدكتور ليانغ نيو لتطبيع التعبير الجيني. ونشكر أيضا دعم منحة من "معهد البيئة الصحية العلوم الوطنية" (ES006096)، ومركز لعلم الوراثة البيئية (CEG) مشروع تجريبي (أدمغة)، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI115358) (أدمغة)، جامعة منح "مجلس البحوث في جامعة سينسيناتي" (أدمغة)، وجامعة "سينسيناتي كلية للطب الأساسية تعزيز التمويل" (عاشرا ض.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | نظام Illumina HiSeq |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | قياس التدفق الخلوي للتصوير |
| mirVana miRNA Isolation | Kit Thermo Fisher | Total RNA استخراج الحمض النووي | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC | |
| تحليل Veriti 96-Well Fast Thermal | Cycler Thermo فيشر | PCR ، تفاعل الإنزيم | |
| NEBNext Poly (A) mRNA وحدة العزل المغناطيسي ؛ | تنقية الحمض النووي الريبي في نيو إنجلاند Biolab | PolyA | |
| نظام SMARTer Apollo الآلي | Takara | PolyA RNA | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit ل Illumina | New England | Biolab إعداد مكتبة | |
| Agencourt AMPure XP حبات | مغناطيسية بيكمان كولتر | تنقية الحمض النووي ؛ | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC ، تحليل توزيع الحجم | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC ، تحليل توزيع الحجم | |
| QuantStudio 5 نظام PCR في الوقت الحقيقي (Thermo Fisher) القياس | الكمي لمكتبة | Thermo Fisher | |
| NEBNext Library Quant | England Biolab | ||
| LibrarycBot | Illumina | Library الجيل | |
| من مجموعة TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot & ndash; | مجموعة مكتبة | Illumina | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 دورة) | تسلسل Illumina | ||
| Phycoerythrin / السيانين 7 (PE / Cy7) Bio | Legend | L243 | |
| Phycoerythrin / Cyanine 5 (PE / Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE مضاد للماوس IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a (H4A3) |
المراجع
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325(2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085(2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594(2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
