دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك

Manju Sharma; Xiang Zhang; Shouxiong Huang

doi:10.3791/57528

Method Article

دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك

DOI:

10.3791/57528

⸱

October 29th, 2018

Manju Sharma¹ , Xiang Zhang¹ , Shouxiong Huang¹

¹Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويوفر نهج مثالي للكشف عن تغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا على الصعيدين الفردي وسكاني التصوير التدفق الخلوي. قد تجلى تعطل وظيفة اندوسيتيك لعرض مستضد الدهن في الخلايا الجذعية البشرية المعرضة للملوثات مع ترانسكريبتوميك مجتمعة التنميط التعبير الجيني ومظاهره المورفولوجية للاتجار بالبروتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل سكاني لتغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للبروتينات اندوسيتيك صعبة بسبب الطلب على التقاط الصور في إجراء تحليل صورة الإحصائية ومستوى خلية واحدة على مستوى سكاني. وللتغلب على هذه الصعوبة، استخدمنا التصوير التدفق الخلوي وترانسكريبتوميك التنميط (الحمض النووي الريبي-seq) لتحديد تغيير التعريب سوبسيلولار بالمجموعة من التمايز د 1 البروتين (CD1d) المرتبطة بالتعبير الجيني اندوسيتيك البصر في الإنسان الخلايا الجذعية (DCs)، التي تتعرض للمشترك محبتين الهواء الملوثات بنزو [أ] بيرين. وقد تم تحليل كولوكاليزيشن CD1d والبروتينات علامة اندوسيتيك Lamp1 الآلاف من خلية الصور التي تم التقاطها مع التصوير التدفق الخلوي استخدام الأفكار وفيجي إيماجيج البرامج. كانت تصور العديد من الصور الخلوية مع البروتينات CD1d و Lamp1 شارك الملون بعد النابضة في CD1d⁺Lamp1⁺ وحدات تحكم المجال Dc باستخدام الأفكار. كولوكاليزاتيون CD1d و Lamp1 المعززة عند التعرض تجلى كذلك استخدام سكاتيربلوتس ثريشولديد، اختبار مع المعاملات في ماندر لكثافة مترجمة شارك، ودبر BaP استناداً إلى النسبة المئوية للمناطق شارك المترجمة باستخدام إيماجيج وفيجي. وتوفر البيانات لدينا نهج الآلي و bioinformatic مفيدة لقياس البروتين كولوكاليزاتيون على المستويات الخلوية كل واحد وسكاني، دعم البصر نتيجة وظيفية لتغيير ترانسكريبتوميك في الإنسان المعرضة للملوثات وحدات تحكم المجال Dc.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مستضد العرض التقديمي عادة ما ينطوي على البروتين داخل الخلايا الاتجار بالأشخاص، التي قد تحقق غالباً استخدام توصيف الخصائص المورفولوجية والتنميط المظهرية من مستضد تقديم الخلايا¹^،²^،³. لدمج مزايا التصوير وأساليب فينوتيبينج، يصف لنا منصة تحليل تصوير في كل من خلية مفردة ومستويات السكان تبرهن كولوكاليزيشن تغيير بروتين في الخلايا الجذعية البشرية (DCs). في الببتيد مستضد العرض الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات الربط ببتيد قصيرة (8-10 البقايا) في هيولى لتنشيط CD8 التقليدية⁺ تي الخلايا، بينما MHC class ثانيا جزيئات تربط أطول نسبيا الببتيد (بقايا ~ 2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكولات البشرية في هذه الدراسة قد أقر "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة سينسيناتي، وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح. وتم الحصول على عينات دم من المانحين صحية من مركز الدم هوكسوورث في المركز الطبي في جامعة سينسيناتي.

1-ترانسكريبتوميك التنميط من المعرضة للملوثات البشرية المشتقة من الوحيدات وحدات تحكم المجال Dc

استخراج الحمض النووي الريبي مجموع البلدان النامية المعرضة BaP
1. التفريق بين وحدات تحكم المجال Dc البشرية باستخدام السيتوكينات GM-CSF، وايل-4، وفضح وحدات تحكم المجال Dc إلى BaP لمدة 4 أيام¹³.
2. فرز DCs يتعرض BaP استخدام التدفق الخلوي استناداً إلى علامات أعر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الملوثات محبتين BaP تبديل مجموعات الجينات اندوسيتيك في DCs المشتقة من الوحيدات DCs. الإنسان البشري من كل جهة مانحة (n = 3) المحتضنة مع BaP وفرزها لوحدات تحكم المجال Dc التقليدية، التي كانت تستخدم كذلك لتحليل الحمض النووي الريبي الاستخراج وترانسكريبتوميك كما هو موضح . عند تطبيع التعبير الجيني، جمعت الجينات المتغيرة بين المجموعات BaP المكشوفة وغير المكشوفة وفقا للعلاقة الوظيفية الأثران عن الجينات. ونحن إدخال قائمة الجينات المعدلة للبرنامج توبكلوستير¹⁶ لتحليل المسارات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هو تحدي تأكيد طريقا المعدلة الجينات الوظيفية، بسبب الجينات أثرت على نطاق واسع التي تنطوي على مسارات متعددة، وصعوبة إدماج الأنشطة الخلوية الفردية وسكاني. استخدمنا التصوير التدفق الخلوي للتحديد اختبار CD1d الاتجار في المقصورات اندوسيتيك. التصوير التدفق الخلوي يدمج سكاني قياس الخلايا والمظاهرة كل من كولوكاليزيشن سوبسيلولار من البروتينات المتعددة. [كنفوكل] مجهرية سبق لها تقديم عالية الدقة في قياس كولوكاليزاتيون البروتين، والتدفق الخلوي قادرة على توفير فينوتيبينج شاملة للسكان خلية مختلفة. التصوير التدفق الخلوي يجمع بين مزايا .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون جوليتو روبرت (مركز الدم هوكسوورث) لعينات الدم البشري ويقرأ الدكتور ليانغ نيو لتطبيع التعبير الجيني. ونشكر أيضا دعم منحة من "معهد البيئة الصحية العلوم الوطنية" (ES006096)، ومركز لعلم الوراثة البيئية (CEG) مشروع تجريبي (أدمغة)، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI115358) (أدمغة)، جامعة منح "مجلس البحوث في جامعة سينسيناتي" (أدمغة)، وجامعة "سينسيناتي كلية للطب الأساسية تعزيز التمويل" (عاشرا ض.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transcriptomics	Illumina	HiSeq 2500 v4	نظام Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	قياس التدفق الخلوي للتصوير
mirVana miRNA Isolation	Kit Thermo Fisher		Total RNA استخراج الحمض النووي
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		Total RNA QC
تحليل Veriti 96-Well Fast Thermal	Cycler Thermo فيشر		PCR ، تفاعل الإنزيم
NEBNext Poly (A) mRNA وحدة العزل المغناطيسي ؛	تنقية الحمض النووي الريبي في نيو إنجلاند Biolab		PolyA
نظام SMARTer Apollo الآلي	Takara		PolyA RNA
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit ل Illumina	New England		Biolab إعداد مكتبة
Agencourt AMPure XP حبات	مغناطيسية بيكمان كولتر		تنقية الحمض النووي ؛
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC ، تحليل توزيع الحجم
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent		Library QC ، تحليل توزيع الحجم
QuantStudio 5 نظام PCR في الوقت الحقيقي (Thermo Fisher) القياس	الكمي لمكتبة	Thermo Fisher
NEBNext Library Quant	England Biolab
LibrarycBot	Illumina		Library الجيل
من مجموعة TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot & ndash;	مجموعة مكتبة	Illumina
HiSeq 1000	Illumina		Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 دورة)	تسلسل Illumina
Phycoerythrin / السيانين 7 (PE / Cy7) Bio	Legend	L243
Phycoerythrin / Cyanine 5 (PE / Cy5)	Bio Legend	3.9
Brilliant violet 421	Bio Legend	L161
PE مضاد للماوس IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a (H4A3)

الريبي تنقية Kit New جيل HS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles