عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

Summary

يصف لنا عزلة إيمونوماجنيتيك oligodendrocytes الماوس الأساسي، الذي يسمح لعزل الخلايا في المختبر الثقافة سريعة ومحددة.

Abstract

عزلة فعالة وقوية وثقافة oligodendrocytes الأولية (عملية شريان الحياة) أداة قيمة للدراسة في المختبر لتطوير أوليجوديندروجليا، فضلا عن بيولوجيا دملينتينغ الأمراض مثل التصلب المتعدد و بليزايوس-ميرتسباخر-مثل مرض (PMLD). هنا، فإننا نقدم بسيطة وتحقيق الكفاءة في اختيار الأسلوب لعزل إيمونوماجنيتيك المرحلة O4 ثلاث⁺ الخلايا بريوليجوديندروسيتيس من الجراء الفئران حديثي الولادة. منذ را غير ناضجة تشكل أكثر من 80% من هذه المسألة الأبيض القوارض في الدماغ عند الولادة يوم 7 (P7) لا يضمن هذا الأسلوب عزل عالية الغلة الخلوية، ولكن أيضا عزلة محددة من شريان الحياة للسودان ملتزمة بالفعل النسب أوليجوديندروجليال، تناقص إمكانية عزل الخلايا تلويث مثل أستروسيتيس والخلايا الأخرى من الدماغ الماوس. هذا الأسلوب هو تعديل التقنيات التي ذكرت سابقا، ويوفر oligodendrocyte إعداد نقاوة أعلى من 80% في حوالي 4 ح.

Introduction

Oligodendrocytes (عملية شريان الحياة) هي خلايا ميليناتينج الجهاز العصبي المركزي (CNS)¹. بالعزلة وثقافة oligodendrocytes الأولية في بيئة محكم تنظيم أداة قيمة للدراسة في المختبر لتطوير أوليجوديندروجليا، فضلا عن بيولوجيا دملينتينغ الأمراض مثل التصلب المتعدد² . وهذا يتطلب oligodendrocyte فعالة وقوية العزلة وثقافة أسلوب³. في هذه الدراسة، ونحن استغل للتعبير عن علامة سطح الخلية oligodendrocyte المميزة لتنفيذ تقنية عزل معدلة التي سريعة ومحددة.

وقد تم التعرف على أربع مراحل متميزة من النضج أوليجوديندروسيتي، بعضها يتسم بالتعبير عن علامات سطح الخلية المميزة لكل مرحلة من مراحل النمو (الشكل 1). هذه العلامات السطحية الخلية يمكن التعرف عليه بواسطة أجسام مضادة محددة^4،5، ويمكن استخدامها لعزل عملية شريان الحياة في مراحل محددة. وفي المرحلة الأولى، oligodendrocyte خلايا السلائف (OPCs) لديها القدرة على تتكاثر وتهاجر، وتحديداً التعبير عن عامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات (بدجف-Rα)⁶، جانجليوسيدي A2B5، وبروتيوغليكان NG2^7،8 ، بوليسياليك حمض العصبية خلية التصاق جزيء⁹ والأحماض الدهنية-ملزمة البروتين 7 (FABP7)¹⁰. وقد المعاونة مورفولوجيا القطبين مع بعض العمليات قصيرة النابعة من أقطاب المعارضة لخلايا الجسم، والتي من سمات الخلايا العصبية السلائف¹¹.

رقم 1: التعبير عن علامات سطح الخلية أثناء وضع الماوس أوليجوديندروسيتي. عملية شريان الحياة الخلية السطحية علامات مثل A2B5، GalC (O1)، NG2، O4، وبدجف-Rα يمكن استخدامها لعزل oligodendrocytes على وجه التحديد في مرحلة إنمائية محددة باستخدام أجسام مضادة محددة.   الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وفي المرحلة الثانية، تثير بريوليجوديندروسيتيس المعاونة ويعرب في غشاء الخلية علامات حزب مؤتمر اودوا الشعبي، ليس فقط، بل أيضا سولفاتيدي (جالاكتوليبيد مسلفت) المعترف بها من قبل ال^12،جسم O4¹³، بروتين GPR17¹⁴، التي استمرت حتى المرحلة oligodendrocyte غير ناضجة (الرتب الأخرى). وفي هذه المرحلة، تمديد بريوليجوديندروسيتيس العمليات قصيرة متعدد الأقطاب. بريوليجوديندروسيتيس هي مرحلة را رئيسيا في يوم الولادة 2 (P2) في هذا الشأن الأبيض الدماغي الجرذ والفأر مع سكان صغيرة غير ناضجة عملية شريان الحياة¹⁵.

خلال المرحلة الثالثة، وتواصل غير ناضجة عملية شريان الحياة التعبير عن O4 وتفقد التعبير عن علامات A2B5 وفي NG2 ويبدأ بالتعبير عن جالاكتوسيريبروسيدي ج¹⁶. في هذه المرحلة، ملتزمون بنسب أوليجوديندروجليال عملية شريان الحياة وتصبح الخلايا الانقسامية اللاحقة مع فروع متشعب طويل^17،18. را غير ناضجة تشكل أكثر من 80 في المائة من هذه المسألة الأبيض القوارض في P7 وتحترم الخلايا MBP⁺ الأولى في هذا الوقت^15،19،،من²⁰²¹. ولذلك، يمكن ضمان عزل عملية شريان الحياة في P7 عالية الغلة الخلوية.

في المرحلة الرابعة والنهائية من التنمية را، أعرب شريان ناضج ميليناتينج البروتينات (البروتين الأساسية المايلين (MBP) والبروتين بروتيوليبيد (حزب العمال التقدمي) وبروتين سكري المايلين المرتبطة (ماج) والمايلين أوليجوديندروسيتي بروتين سكري (موج)^{22،23 ،24،،}من²⁵²⁶. في هذه المرحلة، تمديد هذا الاتفاق شكل انورابينج مانعات حول محاور عصبية الأغشية شريان ناضج وقادرون على ميلينت. ويتزامن هذا مع ملاحظة أن الخلايا MBP⁺ في الدماغ الفئران والفأر، تصبح وفرة متزايدة في P14^19،،من²⁰²¹.

منذ عزل أول oligodendrocyte فوستر والزملاء في عام 1967²⁷، نفذت عدة طرق لعزل عملية شريان الحياة من القوارض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك إيمونوبانينج^28،،من²⁹³⁰، الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) استغلال الخلية الخاصة بسطح المستضدات^28،31، الطرد المركزي التدرج التفاضلية^32،،من^3334،35 وأسلوب هز على أساس الانضمام التفاضلية لإطلاق الجهاز العصبي المركزي مختلفة^36،37. ومع ذلك، أساليب الثقافة القائمة قد القيود، لا سيما من حيث النقاء والغلة والوقت المطلوب لتنفيذ إجراءات³⁸. ولذلك، أكثر كفاءة أساليب معزل oligodendrocytes المطلوبة.

في هذه الورقة، نقدم بسيطة وتحقيق الكفاءة في اختيار الأسلوب لعزل إيمونوماجنيتيك المرحلة O4 ثلاث⁺ الخلايا بريوليجوديندروسيتيس من الجراء الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب تعديل التقنيات التي ذكرت باميرى et al. ³⁹ ودينكمان et al. ⁴⁰ ويوفر نقاء إعداد oligodendrocyte أكثر من 80 في المائة في حوالي 4 ح.

Protocol

وكانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة يعتني بهم وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة ولاية نيويورك الولاية الطبي مركز الشعبة من مختبر الحيوان الموارد (دلار) البروتوكول عدد 15-10492.

ملاحظة: أوليجوديندروسيتيس الأولية كانت معزولة من حديثي الولادة (P5-P7 البرية من نوع C57Bl/6N) الفئران. وفي هذه المرحلة، تشكل شريان الحياة للسودان غير ناضجة أكثر من 80 في المائة من هذه المسألة الأبيض القوارض كفالة عالية الغلة الخلوية. تتوفر كافة المخزن المؤقت والتراكيب الكاشف في نهاية الجدول للمواد.

1-إعداد كوفيرسليبس

ملاحظة: بولي-د-يسين (PDL)/كوفيرسليبس لامينين المغلفة ينبغي أن تعد قبل عزلة الرتب الأخرى.

1. مكان #1 الألمانية الزجاج كوفيرسليبس في أنبوب 50 مل مخروطية وإضافة 35 مل من 70% EtOH لتنظيفها.
2. إغلاق الأنبوب ووضعه في خلاط نوتاتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل في حين تعصف بلطف. يمكن المحتضنة كوفيرسليبس بين عشية وضحاها.
3. تجاهل EtOH 70%.
4. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع المياه، وإزالة الماء كل مرة مع الشفط بالتخلية.
5. إضافة 30-35 مل PDL 50 ميكروغرام/مل كوفيرسليبس في 50 مل الأنبوب، ما يكفي لتغطية كوفيرسليبس.
6. ضع 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على كوفيرسليبس في خلاط نوتاتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل في حين تعصف بلطف.
7. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع المياه، إزالة الماء كل مرة مع الشفط بالتخلية.
8. نقل كوفيرسليبس إلى 60 ملم بيتري الأطباق التي تحتوي على المياه.
9. استخدام تلميح ماصة P200 لترتيب كوفيرسليبس كطبقة تغطي كامل سطح طبق بيتري.
10. بعناية، إزالة الماء من الأطباق مع الشفط بالتخلية.
11. إزالة فائض المياه في جميع أنحاء كوفيرسليبس والسماح لهم الجافة بين عشية وضحاها مع غطاء مفتوحة وتحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: يمكن تخزين PDL مغلفة الزجاج كوفيرسليبس في 4 درجات مئوية في أطباق بتري معقمة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
12. مكان كوفيرسليبس في لوحات 24-حسنا، واحد لكل بئر، باستخدام الملقط غرامة.
13. الانتقال كوفيرسليبس إلى مركز جيدا مع التأكد من الحواف لا تلمس جدار البئر.
14. إضافة 100 ميليلتر من 10 ميكروغرام/مل laminin المخفف في B27NBMA (انظر الجدول للمواد) ابتداء من وسط كل ساترة وتتحرك بطريقة دائرية نحو الحواف لتغطية كل منطقة.
    ملاحظة: نظراً لتشارك في صيانة را laminin ويعزز التمايز في شريان الناضجة، أنها عاملاً هاما في بقاء را^43،،من⁴² في المختبر الثقافة^41،44.
15. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية في 5% CO₂ ح 1 على الأقل أو حتى شريان الحياة للسودان على استعداد للطلاء.

2. الماوس تفارق قشرة الدماغ

1. التضحية الجراء الماوس C57Bl/6N 5-7 أيام القديمة بعد الولادة بقطع الرأس السريع مع مقص تنظيفها مسبقاً في الإيثانول 70%.
   ملاحظة: استخدمت كورتيسيس الدماغي من الجراء الفئران حديثي الولادة 5-6 لكل إعداد. وفي المتوسط، غلة واحد الماوس الدماغ 1-1.5 × 10⁶ عملية شريان الحياة.
2. قطع الجلد فروة الرأس على طول خط الوسط مع مقص تشريح الصغيرة، وسحب لفضح الجمجمة.
3. قطع الجمجمة بعناية على طول خط الوسط ابتداء من فتح في الجزء الخلفي من الجمجمة نحو منطقة أمامي، حتى رفع مع مقص لتفادي تلف الدماغ. بعد ذلك، فتح في الجزء الخلفي من الجمجمة باستخدام قطع تجاه كل محجر العين على طول قاعدة الجمجمة.
4. استخدام الملقط غرامة بلطف ندف كورتيسيس بعيداً عن midbrain ونقلها إلى طبق استنبات الأنسجة 60 ملم تحتوي على 7 مل B27NBMA. كرر الخطوات من 2.2 عن طريق 2.4 لكل الدماغ، وتجميع كورتيسيس تشريح.
5. نقل كورتيسيس إلى طبق استنبات الأنسجة 60 ملم جديدة تحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت للانفصال (B27NBMA و 20-30 U/mL غراء 2,500 يو الدناز أنا).
6. الزهر في كورتيسيس إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم³ باستخدام شفرة المبضع #15 واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حاضنة.
7. أضف 1 مل مصل النمو البقري (BGS) لوقف رد الفعل الأنزيمي.
8. نقل كورتيسيس جنبا إلى جنب مع وسائط الإعلام الانفصال إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام بيبيت مصلية 10 مل.
9. تبدأ بلطف أن تنأى بأنسجة المخ ببطء بيبيتينج أعلى وأسفل باستخدام 6-8 مرات من 10 مل بيبيت مصلية، واستخدام الرعاية لتصغير الفقاعات.
10. السماح لقطع الأنسجة تسوية لمدة 2-3 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
11. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/2500 "ش الدناز" أنا للأنسجة بيليه.
12. استخدام ماصة مصلية 5 مل أن تنأى بلطف بأنسجة المخ بينما بيبيتينج صعودا وهبوطاً 6-8 مرات. كن حذراً للتقليل من الفقاعات.
13. السماح لقطع الأنسجة تسوية لمدة 2-3 دقائق.
14. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا للأنسجة بيليه.
15. بلطف ننأى بأنسجة المخ باستخدام تلميح بيبيت P1000، بينما بيبيتينج المزيج من وسائل الإعلام والدماغ الأنسجة صعودا وهبوطاً. كرر الخطوات 2.13 و 2.14 حتى تبقى لا أجزاء كبيرة من الأنسجة أو حتى B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا استنفدت، أيهما يأتي أولاً. كن حذراً للتقليل من الفقاعات.
16. تعليق خلية تجمع مع سوبيرناتانتس السابقة.
17. مكان 70 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب 50 مل. استخدام بيبيت مصلية 10 مل، تمرير تعليق خلية المجمعة بلطف عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
18. أغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا.
19. تجاهل مصفاة الخلية. إحضار وحدة التخزين إلى 30 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا.
20. نقل تعليق الخلية إلى اثنين من أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقائق في 200 x ز.
21. إزالة المادة طافية دون ترك الخلايا المعرضة للهواء. وستكون المادة طافية غائم بسبب الحطام خلية. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS لبيليه.
22. ننأى بعناية بيليه الخلية باستخدام بيبيت P1000. إحضار وحدة التخزين إلى 15 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS.
23. تمرير تعليق خلية عبر مصفاة خلية جديدة 40 ميكرومتر.
24. أغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS. تجاهل مصفاة الخلية.
25. إحضار وحدة التخزين إلى 30 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS.
26. نقل تعليق خلية لأنابيب مخروطية 2 × 15 مل. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقائق في 200 x ز.
27. إزالة معظم المادة طافية دون ترك الخلايا المعرضة للهواء. ريسوسبيند الكريات الخلية في 5 مل من الجليد الباردة المغناطيسي الخلية الفرز المخزن المؤقت (MCS).

3-تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء

1. تمييع 100 ميليلتر من تعليق خلية مع 400 ميليلتر "حل تريبان الأزرق" في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لتحقيق تخفيف 1:5 في 0.4% (w/v).
2. مركز زجاج تغطي أكثر من دائرة هيموسيتوميتير والتعبئة دائرتي مع 10 ميليلتر لتمييع الخلية باستخدام ماصة P10 وتجنب أوفيرفيل. سيتم تمرير الحل تحت غطاء الزجاج بعمل شعري.
3. وضع في هيموسيتوميتير في مرحلة مجهر وضبط التركيز باستخدام 40 X التكبير.
   ملاحظة: يتم تسجيل عدد خلايا استخدام عداد اليد في كل من المربعات الخمسة (أربعة أركان ومركز واحد). الخلايا غير قادرة على البقاء فقط امتصاص الصبغة وتظهر زرقاء، بينما يعيش وخلايا صحية تظهر جولة والانكسار ولا تستوعب صبغة زرقاء اللون، مما يسمح لتحديد عدد من خلايا قابلة للحياة، ومجموع في المليلتر.

4-عزل O4⁺ أوليجوديندروسيتيس

1. الطرد المركزي بتعليق خلية في 200 غ س لمدة 10 دقائق.
2. تجاهل المادة طافية بعناية باستخدام الشفط بالتخلية، تجنب التعرض للخلايا في الهواء.
3. ريسوسبيند بيليه في 90 ميليلتر من المخزن المؤقت MCS الواحدة 1 × 10⁷ مجموع الخلايا متبوعاً بإضافة 10 ميليلتر لمكافحة O4 الخرز الواحدة 1 × 10⁷ الخلايا.
4. مزيج تعليق خلية والخرز بالتحريك بلطف الأنبوبة المخروطية 15 مل مع الإصبع 4-5 مرات.
5. احتضان هذا المزيج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، يسددها الأنبوبة المخروطية 15 مل مع الإصبع تيميسيفيري 4-5 5 دقيقة.
6. أغسل هذا المزيج بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت MCS الواحدة 1 × 10⁷ خلايا الأنبوب بلطف. الطرد المركزي ميكس في 200 غ س لمدة 10 دقائق.
7. تجاهل المادة طافية بعناية استخدام الشفط بالتخلية، تجنب التعرض للخلايا في الهواء. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة لكل الخلايا⁷ 1 × 10.
8. إرفاق فاصل مغناطيسي لموقف فاصل مغناطيسي. إرفاق عمود اختيار الفاصل المغناطيسي ومصفاة خلية 40 ميكرومتر على رأس العمود. مكان اثنين 15 مل أو أنبوب مخروطي 50 مل واحد أسفل عمود فصل للتدفق من خلال جمع.
9. قبل شطف 40 ميكرومتر خلية العمود مصفاة وفصل مع 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة وترك المخزن المؤقت من خلال العمود تشغيل دون السماح لها الجافة.
10. إضافة هذا المزيج من تعليق خلية والخرز إلى مصفاة الخلية وفي العمود الاختيار.
11. أغسل مصفاة خلية 40 ميكرومتر مع 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة.
12. تجاهل مصفاة الخلية والسماح المزيج من الخلايا والخرز والمخزن المؤقت من خلال العمود تشغيل دون السماح لها الجافة.
13. أغسل العمود فصل 3 مرات مع 3 مل من المخزن المؤقت للإشراف والوقت 1 مع را انتشار وسائط الإعلام.
14. إزالة العمود فصل من الفاصل المغناطيسي ووضعها بسرعة في أنبوب مخروطي 15 مل فورا إضافة 5 مل من الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
15. وضع المكبس على رأس العمود ودفع لطرد الخلايا المسماة في أنبوب مخروطي 15 مل بشدة.
16. إزالة 100 ميليلتر من تعليق خلية لتحديد عدد الخلايا وجدوى استخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير كما هو مبين في الباب 3.
    ملاحظة: صلاحية خلية فوق 80% يعتبر مقبولاً المضي قدما مع ثقافة عملية شريان الحياة، ولكن صلاحية أكبر من 90% الأمثل.

5-الطلاء O4 المعزولة⁺ أوليجوديندروسيتيس

1. تمييع تعليق خلية لرغبة تصفيح الكثافة (5 × 10⁵ خلايا كل ساترة) استخدام الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
   ملاحظة: را البذر كثافة مهم جداً، حيث ينبغي تأكيد كثافة الخلية المناسبة استخدام مجهر زراعة الأنسجة قبل المتابعة. بذر الكثافة أدناه خلايا 10,000/كوفيرسليبس قد يؤدي إلى بقاء الخلية الفقراء. في تصفيح الكثافة في الرتب الأخرى 10,000 إلى 25,000، هو التمايز المورفولوجي بطيئة⁴⁵. نحن لوحة عملية شريان الحياة في كثافة بذر لخلايا/كوفيرسليبس 50,000 على الأقل لضمان بقاء الخلية.
2. نقل 24-جيدا لوحات تحتوي على كوفيرسليبس المغلفة مع laminin من حاضنة هود زراعة الأنسجة.
3. إزالة لامينين من كل ساترة واستبدله مع 100 ميليلتر من تعليق الرتب الأخرى.
4. تبني عملية شريان الحياة في 37 °C/5% CO₂ الحاضنة لمدة أقصاها 45 دقيقة لتعزيز التصاق را إلى كوفيرسليبس.
5. بعد الحضانة، إزالة لوحات 24-جيدا من الحاضنة. الفيضانات كل جيدا لصفيحة 24-جيدا مع 500 ميليلتر من الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
6. مكان عملية شريان الحياة مرة أخرى في 37 °C/5% CO₂ الحاضنة ل 24 ساعة إضافية.
7. 24 ساعة بعد عملية شريان الحياة، والطلاء إزالة انتشار وسائط الإعلام واستبدال مع را التمايز وسائل الإعلام للحث على التفرقة.
8. عملية شريان الحياة مرة أخرى في الحاضنة ولا تقم بإزالة حتى الخلايا جاهزة للتثبيت.
   ملاحظة: التغيرات في درجة الحموضة الضارة لعملية شريان الحياة وتقليل بقاء الخلية، ولذا ينبغي تجنب إزالة لا لزوم لها من الثقافات شريان الحياة للسودان من الحاضنة.

6-الفلورة تلطيخ

1. للكشف عن الخلية علامات السطحية (NG2 O1 و O4)، قم بإزالة الوسائط من الآبار.
2. إضافة 250 ميليلتر من الماوس هيبريدوما supernatants تحتوي على الأجسام المضادة الأولية ضد O1 (مخفف)¹³ و O4 (مخفف)¹³ وارنب [بولكلونل] ضد NG2 (1:150 المخفف في B27NBMA).
   ملاحظة: إذا كانت الأجسام المضادة O1 المضادة ومكافحة O4 المتاحة تجارياً لاستخدامها، من المستصوب الاستفادة من تخفيف اقترحتها الشركة المصنعة.
3. احتضان الخلايا بجسم الابتدائي لمدة 45 دقيقة كحد أقصى في 37 °C/5% CO₂ حاضنة.
4. تغسل مرتين مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% (4% منهاج العمل) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
6. تمييع الماعز مترافق 488 أليكسا الماوس المضادة IgM أو أرنب المضادة مفتش الثانوي جسم (1: 400) في B27NBMA.
7. إزالة برنامج تلفزيوني العاشر توين-20/1 0.05% من كوفيرسليبس. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
8. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
9. لتلطيخ مزدوجة للكشف عن علامات الداخلية (توصيني)، إزالة توين-20/1 0.05% الخلايا X برنامج تلفزيوني وكتلة/بيرميبيليزي مع المخزن المؤقت كتلة/بيرميبيليزيشن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وإلا انتقل إلى الخطوة 6.17.
10. إزالة كتلة/permeabilization المخزن المؤقت وإضافة 250 ميليلتر الدجاج مكافحة--توصيني (1: 100) المخفف في المخزن المؤقت لكتلة/بيرميبيليزيشن.
11. احتضان الخلايا مع توصيني المناهضة ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
12. تمييع الماعز مترافق 594 أليكسا الدجاج المضادة مفتش الثانوي جسم (1: 400) في B27NBMA.
13. إزالة برنامج تلفزيوني العاشر توين-20/1 0.05% من كوفيرسليبس. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
14. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
15. كونتيرستين مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وجبل الخلايا مع تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI أنتيفادي.
16. كوفيرسليبس علاج بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
17. صورة الخلايا الملون مع مجهر ابيفلوريسسينسي.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم تصويرها في الخلايا في 40 X التكبير باستخدام وقت تعرض موحدة.

Results

وكان الغرض من هذه الدراسة لإنشاء أسلوب عزل محسنة ل O4⁺ أوليجوديندروسيتيس الماوس الأساسية التي تتطلب أقل قدر ممكن التلاعب بالخلايا الهدف. يأخذ الإجراء بأكمله من القتل الرحيم الجراء لطلاء الخلايا في كوفيرسليبس حوالي 4 ح والبيانات الموضحة هنا تمثل ثلاث تجارب مستقلة. بعد تفكك النسيج، كان متوسط 4.3 ± 0.46 × 10⁷ خلايا معزولة لكل تجربة مستقلة، مع بقاء 91% ± 5.6%. بعد عزل إيمونوماجنيتيك باستخدام O4 مكافحة معلم ميكروبيدس المغناطيسي في متوسط 6.9 ± 0.38 × 10⁶ شريان ا...

Discussion

في هذه الرسالة، نقدم طريقة لعزل الماوس غير ناضجة جداً المنقي oligodendrocyte الثقافات تتسم بالكفاءة. بالمقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا^39،40، أثمر هذا الأسلوب درجة نقاء أعلى بمستوى أقل بكثير من الإيجابية توصيني astrocytes ونسبة منخفضة جداً من الخلايا الأخرى غير تتميز. من المهم أن نشير إلى أن هذه هي شريان الحياة للسودان غير ناضجة التزمت بالفعل بنسب أوليجوديندروجليال. وهكذا، لا سيكون مفيداً لدراسة مراحل الأولى من التمايز هذه الخلايا.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 مل ماصات مصلية	فيشر ساينتفيك	13-676-10J
10 مل حقنة طرف Luer-Loc	BD ، Becton Dickinson	309604
15 مل أنابيب مخروطية Falcon		352097
ألواح زراعة الأنسجة 24 بئر Falcon
40 & micro ؛ مصفاة الخلايا	m فيشر ساينتفيك	22368547
50 مل أنابيب مخروطية	فالكون	352098
5 مل ماصات مصلية	فيشر ساينتفيك	13-676-10H
60 مم لوحات زراعة الأنسجة فالكون
70 & مايكرو ؛ مصفاة الخلايا m	فيشر Scientific	22363548
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgM (H + L) الجسم المضاد الثانوي	Invitrogen	A21042
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgM (H + L) الجسم المضاد الثانوي	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للدجاج IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي	Invitrogen	A11042
الخرز المضاد ل O4 - Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Apo-Transferrin البشري	Sigma	T1147
Autofil مجموعة مرشح كامل للزجاجة العلوية ، مرشح 0.22um ، 250 مل	الولايات المتحدة الأمريكية Scientific	6032-1101
Autofil مرشح كامل للزجاجة التجميع ، مرشح 0.22um ، 250 مل	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	6032-1102
B27 مكمل	غذائي Invitrogen	17504-044
حمض البوريك	Sigma	B7660
مصل نمو الأبقار (BGS) GE	Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
d-Biotin	Sigma	B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
مجهر التألق مع كاميرا Olympus DP70	Olympus	Bx51
مشارط الريشة التي تستخدم لمرة واحدة	Andwin	Scientific EF7281C
Forskolin	Sigma	F6886
أغطية زجاجية ألمانية ، # 1 سمك ، قطر 12 مم دائري	NeuVitro	GG-12-oz
GFAP الجسم المضاد	Aves	GFAP
	Glucose Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
الأنسولين	Invitrogen	12585-014
حامل فاصل مغناطيسي - MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
مغناطيسي - فاصل MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22 & micro ؛ وحدة الفلتر m	Millipore	SLG033RS
وسائط التركيب - إطالة الذهب مع DAPI	Thermo Fisher	P36930
N-acetyl-cysteine (NAC)	Sigma	A8199
لامينين الفأر الطبيعي	Invitrogen	23017-015
Neurobasal Medium A	Invitrogen	10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)	Peprotech	450-03
NG2 الأجسام المضادة	Millipore	AB5320
Papain	Worthington	LS003126
PBS بدون Ca2 + < / sup> و Mg2+< / sup>	Sigma	D5652
PDGF	Peprotech	100-13A
أطباق بتري	فالكون	351029
بولي دي ليسين	سيجما	P6407
بريموسين	إنفيفوجين	ant-pm-2
البروجسترون	سيجما	P8783
بوتريسين	سيجما	P5780
عمود الاختيار-أعمدة	LS Miltenyi Biotec	130-042-401
سيلينيت الصوديوم	سيجما	S5261
العناصر النزرة ب	كورنينج	25-000-CI
ثلاثي يودوثيرونين (T3)	سيجما	T6397
تريتون-إكس	سيجما	T8787
تريبان بلو سولوشن	كورنينج	25-900-CI
توين 20	سيجما	P1379
B27NBMA			487.75 مل متوسط عصبي أ ؛ 10 مل B27 الملحق ؛ 1 مل Primocin. 1.25 مل جلوتاماكس ؛ تصفية التعقيم وتخزينها في 4 درجات ؛ ج حتى الاستخدام.
B27NBMA + 10٪ BGS			27 مل B27NBMA ؛ 3 مل مخزون محلول CNTF مصل نمو البقر
(10 & micro; جم / مل ؛ 1000X)			طلب من Peprotech (450-50). المكياج من 0.1 إلى 1 مجم / مل وفقا للشركة المصنعة s التعليمات (قد تختلف من دفعة إلى أخرى) في المخزن المؤقت (مثل DPBS + 0.2٪ BSA). يخزن في -80 درجة مئوية حل العمل (10 & micro; جم / مل ، 1000X) 1. اصنع 0.2٪ BSA (فيشر العلمي BP-1600-100) في محلول DPBS وتعقيم الفلتر. 2. تخفيف الأسهم الرئيسية aliquot إلى 10 & micro ؛ جم / مل معقم ، مبرد 0.2٪ BSA / DPBS. 3. Aliquot (20 & micro; لتر / أنبوب) والتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل. 4. قم بتخزين الكميات عند -80 درجة مئوية.
محلول مخزون D-Biotin (50 & micro; جم / مل ؛ 5000X)			إعادة تعليق d-biotin (Sigma-B4639) في H2O المقطر المزدوج عند 50 & micro ؛ جم / مل (على سبيل المثال 2.5 مجم في 50 مل من ddH2O). قد يستغرق إعادة التعليق قدرا لا بأس به من التحريض / الدوامة ، أو الاحترار المعتدل لفترة وجيزة عند 37 درجة مئوية. إذا كان د-البيوتين لا يزال غير قابل للذوبان ، فلا بأس من تكوين أقل تركيزا (على سبيل المثال 10 ومايكرو ؛ g/ml)، ولإضافة حجم أكبر إلى B27NBMA (1/1000)، بدلا من 1/5000). يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
DNase I مخزون الحل			1. يذوب في 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml في HBSS المبرد على الثلج. 2. تعقيم الفلتر على الثلج 3. Aliquot في 200 & micro; ل ويجمد طوال الليل عند -20 درجة مئوية 4. قم بتخزين الحصص عند -20 إلى -30 درجة مئوية.
دولبيكو s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (بدون Ca2 + و Mg2 +)			قم بإذابة الكيس في 1 لتر من الماء لإنتاج 1 لتر من الوسط عند 9.6 جرام من المسحوق لكل لتر من الوسط. يخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
محلول مخزون فورسكولين (4.2 ملغ/مل; 1000X)			إضافة 1 مل من DMSO معقمة إلى 50 ملغ فورسكولين في زجاجة (سيغما-F6886) والماصة حتى معلقة. انقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وأضف 11 مل من DMSO المعقم لإحضاره إلى 4.2 مجم / مل. Aliquot (على سبيل المثال 20 & micro; ل) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
هانك الأملاح المتوازنة (HBSS) (سيجما			1. قياس 900 مل من الماء (درجة الحرارة 15-20 درجة ؛ ج) في اسطوانة ويقلب برفق. 2. أضيفي القوة وقلبي حتى تذوب. 3. اشطف العبوة الأصلية بكمية صغيرة من الماء لإزالة جميع آثار المسحوق. 4. أضف إلى الحل في الخطوة 2. 5. أضف 0.35 غرام من بيكربونات الصوديوم (7.5٪ وزن / حجم) لكل لتر من الحجم النهائي. 6. استمر في التقليب حتى يذوب. 7. اضبط درجة الحموضة في المخزن المؤقت أثناء التقليب إلى 0.1-0.3 وحدة أقل من درجة الحموضة = 7.4 لأنه قد يرتفع أثناء الترشيح. يوصى باستخدام 1N HCl أو 1N هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة. 8. أضف ماءا إضافيا ليصل الحجم النهائي إلى 1 لتر < / > 9. تعقيم عن طريق الترشيح باستخدام غشاء مسامية 0.22 ميكرون. 10. يخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
محلول مخزون الأنسولين (4000 وميكرو ؛ جم / مل)			قم بإذابة الزجاجة و Aliquot 25 & micro ؛ ل لكل أنبوب طرد مركزي دقيق وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
		Laminin	قم بإذابة اللامينين ببطء في البرد (2 درجة ؛ C إلى 8 درجة ؛ ج) لتجنب تكوين الهلام. ثم ، قم بتقطيعه إلى أنابيب البولي بروبلين. تخزينها في 5 درجات ؛ C إلى -20 درجة ؛ C في الحصص (على سبيل المثال 20 & micro; ل) ولا تجمد / تذوب بشكل متكرر. يمكن تخزين اللامينين في درجات الحرارة هذه لمدة تصل إلى ستة أشهر.
فرز الخلايا المغناطيسية (MCS) العازلة			تحضير المحلول الملحي المحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ودرجة الحموضة 7.2 ، و 0.5٪ ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، 0.5 ملي مولار EDTA ، 5 & micro ؛ جم / مل أنسولين ، 1 جم / لتر جلوكوز. تعقيم وتفريغ الغاز عن طريق ترشيح المخزن المؤقت عن طريق تمريره عبر 0.22 & ميكرو; م مرشح Millex. قم بتخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات ؛ C حتى استخدام
محلول مخزون N-Acetyl-L-cysteine (NAC) (5 ملغ/مل؛ 1000X)			بإذابة N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) بمعدل 5 ملغ/مل في DMEM (على سبيل المثال، 50 ملغ NAC في 10 مل B27NBMA). تعقيم الفلتر والتقدير (على سبيل المثال 20 وميكرو ؛ ل). تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
حل مخزون NT3 (1 & micro; جم / مل ؛ 1000X)			الأسهم الرئيسية: طلب من Peprotech (450-03). المكياج من 0.1 إلى 1 مجم / مل وفقا للشركة المصنعة s التعليمات (قد تختلف من دفعة إلى أخرى) ، في المخزن المؤقت (مثل DPBS + 0.2٪ BSA). يخزن في -80 درجة مئوية مخزون العمل (1 & micro; جم / مل ؛ 1000X): 1. اصنع 0.2٪ BSA في محلول DPBS وتعقيم الفلتر. 2. تخفيف الأسهم الرئيسية aliquot إلى 1 & micro ؛ جم / مل معقم ، مبرد 0.2٪ BSA / DPBS. 3. Aliquot (على سبيل المثال 20 & micro; لتر / أنبوب) والتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل. 4. تخزين الحصص عند -80 درجة مئوية.
حل مخزون PDGF (10 وميكرو ؛ جم / مل ؛ 1000X)			الأسهم الرئيسية: طلب من Peprotech (100-13A). المكياج من 0.1 إلى 1 مجم / مل وفقا للشركة المصنعة s التعليمات (قد تختلف من لوت إلى آخر) في المخزن المؤقت (مثل DPBS) + 0.2٪ BSA). يخزن في -80 درجة مئوية مخزون العمل (1 & micro; جم / مل ؛ 1000X): 1. اصنع 0.2٪ BSA في محلول DPBS وتعقيم الفلتر. 2. تخفيف الأسهم الرئيسية aliquot إلى 1 & micro ؛ جم / مل معقم ، مبرد 0.2٪ BSA / DPBS. 3. Aliquot (على سبيل المثال 20 & micro; لتر / أنبوب) والتجميد المفاجئ في النيتروجين السائل. 4. تخزين الحصص عند -80 درجة مئوية.
بولي د-ليسين (1 ملغ / مل ؛ 100X)			إعادة تعليق بولي د-ليسين ، الوزن الجزيئي 70-150 كيلو دالتون (سيجما P6407) عند 0.5 مجم / مل في 0.15 مجم حمض البوريك الرقم الهيدروجيني 8.4 (على سبيل المثال 50 مجم في 50 مل من البورات العازلة). تعقيم المرشح والتقدير (على سبيل المثال 100 وميكرو ؛ لتر / أنبوب). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، قم بتخفيف مرق 100X (1 مجم / مل) إلى 50 ميكرو ؛ جم / مل في ماء معقم.
وسائط			الجدول التكميلي 1
تمايز			انظر الجدول التكميلي 1
Sato (100X)			انظر الجدول التكميلي 1< / a>
المراجع: تم اعتماد قائمة الكواشف والوصفات من البروتوكولات التي وصفها Emery et al. 2013 (Emery، B. & amp; amp; amp Dugas، J. C. تنقية خلايا سلالة الخلايا قليلة التغصن من قشرة الفئران عن طريق المناعة. كولد سبرينج حرب بروتوك. 2013 (9) ، 854-868 ، doi: 10.1101 / pdb.prot073973 ، (2013)) و Dincman آخرون. (دينكمان ، تي إيه ، بيري ، جي إي ، أوهري ، إس إس وأمبير Whittemore، S.R. عزل الخلايا السليفة قليلة التغصن في الفأر القشري. طرق علوم العصاب J. 209 (1) ، 219-226 ، دوي: 10.1016 / j.jneumeth.2012.06.017 ، (2012))