هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور الإسقاط الحركية وأربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا. بعد إيمونوستينينج للخلايا العصبية الحركية، استخدمنا الورقة الضوء الفلورية مجهرية للأجنة صورة للتحليل الكمي اللاحقة. ينطبق هذا البروتوكول على الأخرى عمليات الملاحة العصبية في الجهاز العصبي المركزي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توسيع العمود الفقري من الخلايا العصبية الحركية (MNs) على محاور عصبية التواصل مع أهدافها إينيرفاتينج، وبالتالي السيطرة على الحركة والمهام المعقدة في الفقاريات. وبالتالي، من المهم للكشف عن الآليات الجزيئية لكيف تستهدف السيارات انتقل إلى محاور عصبية وأربوريزي ويعصب العضلات المحيطة بهم خلال التنمية، وانحطاط. على الرغم من أن خطوط الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا منذ فترة طويلة أدت إلى تصور مسارات إكسون السيارات أثناء التطور الجنيني، وصفاً تفصيليا من الطيف الكامل من أربوريزاتيون الطرفية إكسون تظل ناقصة بسبب تعقد نمط و القيود المفروضة على المجهر الضوئي الحالي. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا محسنة التي تجمع بين الورقة الضوء الفلورية مجهرية () وتحليل صورة قوية كما وكيفا تصور وضع محاور عصبية المحرك. ويمكن اعتماد هذا النظام بسهولة عبر طفرات وراثية أو نماذج المرض مينيسوتا مع خطوط Hb9::GFP ، الكشف عن الآليات الجزيئية الرواية التي تؤدي إلى عيوب في موتور إكسون الملاحة وأربوريزيشن.
المقدمة
MNs العمود الفقري هي الجزء من الجهاز العصبي المركزي ولكن يعصب العضلات الطرفية للتحكم في الحركة. في الحبل الشوكي النامي، تقام المتكفل مينيسوتا (بمنس) وفقا للإشارات المنبثقة عن notochord وسميتس المتاخمة. كل ما يميز MNs الانقسامية بعد ثم يتم إنشاؤها من بمنس، مما أدى في نهاية المطاف إلى سلسلة من المخططات MN على طول محور روستروكودال في الحبل الشوكي1،2. MNs العمود الفقري منظمون طبوغرافيا وتشريحيا جيدا. ترتيب الخصائص المورفولوجية يرتبط بوضع هدف كل منهما في هامش3. عند الوصول إلى أهدافهم العضلات، تلقي محاور عصبية نيوروتروفيك الخلوية والخارجية من العوامل التي حملها على تمديد وفرع آخر في العضلات. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأبقى جميع الحيوانات الحية في ممرض محددة مجاناً (منتدى جنوب المحيط الهادئ) حيوانية منشأة، وافقت ويشرف على IACUC سينيكا.
1-التثبيت
- جمع الأجنة اليوم الجنينية 12.5 (E12.5) ثم قطع رأس وافيسسيراتي لهم.
- إصلاح الأجنة منفردة في لوحات 24-جيدا مع 1 مل/جيدا من الطازجة بارافورمالدهيد 4% في 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) بين عشية وضحاها. تبني في 4 درجات مئوية على شاكر.
- تغسل الأجنة ثابتة على الأقل 3 x، كل منهما لمدة 5-10 دقيقة، مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر لإزالة بارافورمالدهيد المتبقية.
2-كل-جبل إيمونوستينينج
- بيرميبيليز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لسفم يوفر التصور 3D مفصلة من مينيسوتا أربوريزاتيون المسار ومحور عصبي في الماوس الأجنة. تحت حقل مشرقة، تظهر الأنسجة شفافة تماما بعد يجري منغمسين في الكاشف المقاصة التجارية. لاحظت لا انكماش أو تورم في العينة بعد تصل إلى أسبوع واحد للتخزين في مسح كاشف قبل التصوير. تحت قناة الأسفار، تتم تسمية الخلايا العصبية الحركية مع ترانسجينيكالي أعرب عن التجارة والنقل (فيلم 1). في بعض الحالات، تفاصيل الهيكل إكسون تتعرض للخطر. على سبيل المثال، يمثل الرقم 2 تصو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عدة خطوات في البروتوكول قد تتعرض لتغيرات في ظروف معينة. على سبيل المثال، مدة التثبيت يعتمد على سن الأجنة، تتراوح بين ح 2 أيام 1 أو أكثر باستخدام بارافورمالدهيد الطازجة. منذ التثبيت تتم قبل كله جبل إيمونوستينينج، للأجسام المضادة التي تكون حساسة للبروتين كروسلينكينج، يمكن استخدام الميثانول كعامل مثبت بديلة. لارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند التلوين، من الضروري تحسين تركيز المنظفات (بين 0.1 0.5%). خطوات الغسيل إضافية قبل وبعد حضانة جسم يمكن أيضا زيادة نسبة الإشارة إلى الضجيج. وباﻹضافة إلى ذلك، المهم خطوة إزالة الأنسجة ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
لسفم التجارب وتحليل البيانات أجريت باستخدام المجاهر الضوئية المتقدمة من "شعبة الخدمة صك" جزئيا في سينيكا، وبالمساعدة من السيدة شين شو-تشن. ونشكر السيدة سو بينغ لي من "التصوير الأساسية مرفق للمكتب البحري الدولي" لقدر كبير من المساعدة التقنية مع تحليل الصورة إيماريس. واستعرض "العلمية الإنجليزية الأساسية" للمكتب البحري الدولي تحرير المخطوطة. وتمول هذا العمل الوظيفي التابع سينيكا الأوساط الأكاديمية جائزة التنمية (الحزب الديمقراطي المسيحي-107-L05)، وآخر (104-2311-B-001-030-MY3)، والمؤسسات الوطنية (المؤسسات الوطنية-EX106-10315NC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Hb9 :: GFP | 005029 مختبر جاكسون | اجمع أجنة اليوم الجنيني 12.5 (E12.5) | |
| 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) | ل 200 مل: أضف 20 مل 10X PBS ، 8 جم PFA في ddH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (10N). قم بالفلتر والتعقيم والتخزين عند -20 درجة مئوية. | ||
| ملحي عازل للفوسفات 10X (PBS 10X) ل | 1 لتر: أضف 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم KCl ، 14.4 جم Na2HPO4 ، 2.4 جم KH2PO4 وقم بتعبئتها ب ddH2O. الأوتوكلاف وتخزينه في RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| مصل الأبقار الجنين | ThermoFisher | 26140079 | |
| الأغنام متعدد النسيلة المضاد ل GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1: 1000 |
| Alexa Fluor 488 الحمار المضاد للأغنام | Invitrogen | A-11015 | 1: 1000 |
| RapiClear 1.49 كاشف المقاصة | SunJin | Lab RC149001 | |
| 1.5 مل مايكرو أنبوب | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 لوحة بئر | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght حاد / حاد | Aesculap | BC110R | |
| مشارط الجراحة المجهرية ، استخدام واحد | Aesculap | BA365 | |
| تشريح المجهر | نيكون | SMZ800 | |
| شاكر | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 مجهر | كارل زايس المجهر | ||
| Imaris 8.4.0 برنامج تحليل الصور | Bitplane ، زيورخ ، سويسرا | ||
| B6.Cg-Tg (Hlxb9-GFP) 1Tmj / J (Hb9 :: فئران GFP) | مختبر جاكسون | 005029 |
المراجع
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
- Kania, A., Jessell, T. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
