Method Article

التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور الإسقاط الحركية وأربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا. بعد إيمونوستينينج للخلايا العصبية الحركية، استخدمنا الورقة الضوء الفلورية مجهرية للأجنة صورة للتحليل الكمي اللاحقة. ينطبق هذا البروتوكول على الأخرى عمليات الملاحة العصبية في الجهاز العصبي المركزي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توسيع العمود الفقري من الخلايا العصبية الحركية (MNs) على محاور عصبية التواصل مع أهدافها إينيرفاتينج، وبالتالي السيطرة على الحركة والمهام المعقدة في الفقاريات. وبالتالي، من المهم للكشف عن الآليات الجزيئية لكيف تستهدف السيارات انتقل إلى محاور عصبية وأربوريزي ويعصب العضلات المحيطة بهم خلال التنمية، وانحطاط. على الرغم من أن خطوط الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا منذ فترة طويلة أدت إلى تصور مسارات إكسون السيارات أثناء التطور الجنيني، وصفاً تفصيليا من الطيف الكامل من أربوريزاتيون الطرفية إكسون تظل ناقصة بسبب تعقد نمط و القيود المفروضة على المجهر الضوئي الحالي. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا محسنة التي تجمع بين الورقة الضوء الفلورية مجهرية () وتحليل صورة قوية كما وكيفا تصور وضع محاور عصبية المحرك. ويمكن اعتماد هذا النظام بسهولة عبر طفرات وراثية أو نماذج المرض مينيسوتا مع خطوط Hb9::GFP ، الكشف عن الآليات الجزيئية الرواية التي تؤدي إلى عيوب في موتور إكسون الملاحة وأربوريزيشن.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MNs العمود الفقري هي الجزء من الجهاز العصبي المركزي ولكن يعصب العضلات الطرفية للتحكم في الحركة. في الحبل الشوكي النامي، تقام المتكفل مينيسوتا (بمنس) وفقا للإشارات المنبثقة عن notochord وسميتس المتاخمة. كل ما يميز MNs الانقسامية بعد ثم يتم إنشاؤها من بمنس، مما أدى في نهاية المطاف إلى سلسلة من المخططات MN على طول محور روستروكودال في الحبل الشوكي1،2. MNs العمود الفقري منظمون طبوغرافيا وتشريحيا جيدا. ترتيب الخصائص المورفولوجية يرتبط بوضع هدف كل منهما في هامش3. عند الوصول إلى أهدافهم العضلات، تلقي محاور عصبية نيوروتروفيك الخلوية والخارجية من العوامل التي حملها على تمديد وفرع آخر في العضلات. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأبقى جميع الحيوانات الحية في ممرض محددة مجاناً (منتدى جنوب المحيط الهادئ) حيوانية منشأة، وافقت ويشرف على IACUC سينيكا.

1-التثبيت

  1. جمع الأجنة اليوم الجنينية 12.5 (E12.5) ثم قطع رأس وافيسسيراتي لهم.
  2. إصلاح الأجنة منفردة في لوحات 24-جيدا مع 1 مل/جيدا من الطازجة بارافورمالدهيد 4% في 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) بين عشية وضحاها. تبني في 4 درجات مئوية على شاكر.
  3. تغسل الأجنة ثابتة على الأقل 3 x، كل منهما لمدة 5-10 دقيقة، مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر لإزالة بارافورمالدهيد المتبقية.

2-كل-جبل إيمونوستينينج

  1. بيرميبيليز....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لسفم يوفر التصور 3D مفصلة من مينيسوتا أربوريزاتيون المسار ومحور عصبي في الماوس الأجنة. تحت حقل مشرقة، تظهر الأنسجة شفافة تماما بعد يجري منغمسين في الكاشف المقاصة التجارية. لاحظت لا انكماش أو تورم في العينة بعد تصل إلى أسبوع واحد للتخزين في مسح كاشف قبل التصوير. تحت قناة الأسفار، تتم تسمية الخلايا العصبية الحركية مع ترانسجينيكالي أعرب عن التجارة والنقل (فيلم 1). في بعض الحالات، تفاصيل الهيكل إكسون تتعرض للخطر. على سبيل المثال، يمثل الرقم 2 تصو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدة خطوات في البروتوكول قد تتعرض لتغيرات في ظروف معينة. على سبيل المثال، مدة التثبيت يعتمد على سن الأجنة، تتراوح بين ح 2 أيام 1 أو أكثر باستخدام بارافورمالدهيد الطازجة. منذ التثبيت تتم قبل كله جبل إيمونوستينينج، للأجسام المضادة التي تكون حساسة للبروتين كروسلينكينج، يمكن استخدام الميثانول كعامل مثبت بديلة. لارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند التلوين، من الضروري تحسين تركيز المنظفات (بين 0.1 0.5%). خطوات الغسيل إضافية قبل وبعد حضانة جسم يمكن أيضا زيادة نسبة الإشارة إلى الضجيج. وباﻹضافة إلى ذلك، المهم خطوة إزالة الأنسجة ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لسفم التجارب وتحليل البيانات أجريت باستخدام المجاهر الضوئية المتقدمة من "شعبة الخدمة صك" جزئيا في سينيكا، وبالمساعدة من السيدة شين شو-تشن. ونشكر السيدة سو بينغ لي من "التصوير الأساسية مرفق للمكتب البحري الدولي" لقدر كبير من المساعدة التقنية مع تحليل الصورة إيماريس. واستعرض "العلمية الإنجليزية الأساسية" للمكتب البحري الدولي تحرير المخطوطة. وتمول هذا العمل الوظيفي التابع سينيكا الأوساط الأكاديمية جائزة التنمية (الحزب الديمقراطي المسيحي-107-L05)، وآخر (104-2311-B-001-030-MY3)، والمؤسسات الوطنية (المؤسسات الوطنية-EX106-10315NC).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9 :: GFP005029 مختبر جاكسوناجمع أجنة اليوم الجنيني 12.5 (E12.5)
4٪ بارافورمالدهيد (PFA)ل 200 مل: أضف 20 مل 10X PBS ، 8 جم PFA في ddH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (10N). قم بالفلتر والتعقيم والتخزين عند -20 درجة مئوية.
ملحي عازل للفوسفات 10X (PBS 10X) ل1 لتر: أضف 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم KCl ، 14.4 جم Na2HPO4 ، 2.4 جم KH2PO4 وقم بتعبئتها ب ddH2O. الأوتوكلاف وتخزينه في RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
مصل الأبقار الجنينThermoFisher26140079
الأغنام متعدد النسيلة المضاد ل GFPAbD Serotec4745-10511: 1000
Alexa Fluor 488 الحمار المضاد للأغنامInvitrogenA-110151: 1000
RapiClear 1.49 كاشف المقاصةSunJinLab RC149001
1.5 مل مايكرو أنبوبSarstedt72.690.001
24 لوحة بئرThermoFisher142475
5 SA Tweezerideal-tek3480641
Iris Scissors striaght حاد / حادAesculapBC110R
مشارط الجراحة المجهرية ، استخدام واحدAesculapBA365
تشريح المجهرنيكونSMZ800
شاكرTKSRS-01
Lightsheet Z.1 مجهركارل زايس المجهر
Imaris 8.4.0 برنامج تحليل الصورBitplane ، زيورخ ، سويسرا
B6.Cg-Tg (Hlxb9-GFP) 1Tmj / J (Hb9 :: فئران GFP)مختبر جاكسون005029
محلول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor Axon NavigationLight Sheet MicroscopyAxon ArborizationMouse EmbryosHb9 GFP MiceImage Analysis SoftwareFilament QuantificationSample ClearingAntibody IncubationZ Stack Acquisition

Related Articles