يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد مواقع النسخ Olig2 عامل ربط الجينوم في حدة تنقية PDGFRα + الخلايا من الكروماتين خلية منخفض إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل التحليل

8.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57547

⸱

أبريل 16, 2018

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم بروتوكول الذي يهدف إلى تحليل ملزمة على نطاق الجينوم عامل النسخ oligodendrocyte 2 (Olig2) في الدماغ تنقية حادة oligodendrocyte خلايا السلائف (OPCs) بأداء منخفضة خلايا الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة) ، إعداد مكتبة والتسلسل الفائق وتحليل البيانات بيوينفورماتيك.

الملخص

في خلايا الثدييات، ينظم التفاعلات بين العوامل النسخي مع الحمض النووي الجينات النسخ بطريقة محددة نوع خلية. وتعتبر عوامل النسخ الخاصة بالنسب القيام بأدوار أساسية في مواصفات الخلية والتمايز من خلال التنمية. رقاقة مقترنة بتسلسل الحمض النووي الفائق (الرقائق-seq) يستخدم على نطاق واسع لتحليل مواقع على نطاق الجينوم ربط عوامل النسخ (أو المعقدة المرتبطة به) للحمض النووي. ومع ذلك، عدد كبير من الخلايا مطلوبة من أجل رد رقاقة قياسي واحد، مما يجعل من الصعب على دراسة عدد محدود من الخلايا الأولية المعزولة أو خلية نادرة السكان. من أجل فهم الآلية التنظيمية للنسخ الخاصة بالنسب oligodendrocyte يظهر عامل Olig2 في الماوس المنقي حادة المعاونة، طريقة مفصلة باستخدام رقاقة seq لتحديد المواقع على نطاق الجينوم ملزمة Olig2 (أو Olig2 المعقدة). أولاً، البروتوكول يوضح كيفية تنقية ألفا مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGFRα) المعاونة الإيجابية من العقول الماوس. المقبل، بوساطة جسم Olig2 رقاقة وتتم بناء مكتبة. ويصف الجزء الأخير بيوينفورماتيك البرامج والإجراءات المستخدمة لتحليل Olig2 رقاقة-seq. وباختصار، تقارير هذه الورقة أسلوباً لتحليل الارتباطات على نطاق الجينوم النسخي عامل Olig2 في الدماغ تنقية حادة المعاونة.

المقدمة

من المهم دراسة البروتين (أو البروتين المعقدة) ربط الحمض النووي وعلامات جينية لبناء الشبكات التنظيمية النسخي الضالعة في العمليات البيولوجية المختلفة. خاصة، ارتباطات عوامل النسخ إلى الحمض النووي يمكن أن تلعب دوراً هاما في تنظيم الجينات، والتفريق بين الخلية، وتطوير الأنسجة. أداة قوية لدراسة تنظيم النسخي والآليات جينية الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة). نظراً للتقدم السريع في تكنولوجيا الجيل القادم على التسلسل، يستخدم رقاقة مقترنة بتسلسل الحمض النووي الفائق (الرقائق-seq) لتحليل روابط البروتين-الحمض النووي وعلامات جينية1. ومع ذلك، تتطلب بروتوكول seq رقاقة قياسي الخلايا حوالي 20 مليون كل رد فعل، الأمر الذي يجعل تطبيق هذه التقنية صعبة عندما يقتصر عدد الخلايا، مثل الخلايا الأولية المعزولة وخلية نادرة السكان.

وتوزع على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ oligodendrocyte خلايا النسب بما في ذلك الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) و oligodendrocytes وضرورية للتنمية ووظيفة المخ. كنوع من خلايا السلائف، قادرون على المعاونة للتجديد الذاتي والتمايز. المعاونة ليس فقط بمثابة المتكفل ل oligodendrocytes ولكن أيضا تلعب دوراً هاما في نشر الإشارات العصبية بالتواصل مع أنواع أخرى من خلايا الدماغ2. وأشارت الدراسات السابقة أن التنمية أوليجوديندروسيتي يخضع لعوامل النسخ الخاصة بالنسب مثل Olig2 و Sox103،4. تم العثور على هذه العوامل النسخ لربط مناطق المروج أو محسن لبعض الجينات الحاسمة للتأثير على التعبير عنها أثناء أوليجوديندروسيتي مواصفات وتفرقة. ومع ذلك، أنها صعبة لتحديد ربط الحمض النووي للبروتين (أو البروتين المعقدة) الاهتمام بالمعاونة الأولية النقية حادة مع عدد محدود جداً من الخلايا.

هذا البروتوكول وصف كيفية التحقيق بشكل منهجي إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي الجينوم ب Olig2 في الماوس المنقي المعاونة في نطاق الجينوم باستخدام تقنية رقاقة seq. المعاونة من العقول الماوس حادة تنقيته من إيمونوبانينج والمستخدمة في تجربة رقاقة دون الانتشار في المختبر. عدد محدود من المعاونة يمكن الحصول عليها من إيمونوبانينج وهو غير كاف لإجراء التجارب على رقاقة seq القياسية. هنا، أن بروتوكول seq رقاقة خلية منخفض مع منخفضة تصل إلى 20 ألف الخلايا كل رقاقة رد فعل لعوامل النسخ وصف. وباختصار، تفكيك خلايا cross-linked وسونيكاتيد بجهاز سونيكيشن القص في الكروماتين. كان المحتضنة الكروماتين المنفصمة مع الأجسام المضادة Olig2، فضلا عن البروتين الخرز المغلفة يعجل بالحمض النووي Olig2 جسم ملزمة. بعد شطف من البروتينات المغلفة بالخرز والعابرة للربط العكسي، تمت تنقية الحمض النووي عجلت بجسم Olig2 باستخراج الفينول كلوروفورم. وناتج كمياً وتعرض لتراجع تي، التمهيدي الصلب القالب التبديل والتمديد، إضافة محولات والتضخيم، واختيار حجم المكتبة وتنقية خطوات لبناء مكتبة شرائح seq.

بعد التسلسل، وقد تم تحليل النوعية من الخام على ما يلي من العينة أعد مع جسم عامل النسخ Olig2 ونموذج عنصر تحكم. زوج قاعدي منخفض الجودة والتي تحتوي على محول قراءة أجزاء تم اقتطاعها. كانت محاذاة القراءات القادمة، قلصت إلى الجينوم إشارة الماوس. مناطق الجينوم التي كانت أثرت إلى حد كبير على رقاقة على ما يلي، بالمقارنة إلى نموذج عنصر تحكم، تم الكشف عنها كقمم. تم تصفية قمم كبيرة، تمثل مواقع الربط عامل النسخ المحتملة، وتصور في مستعرض جينوم.

جدير بالذكر أن الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها على نطاق واسع ل seq رقاقة من عوامل النسخ الأخرى مع أي نوع من الخلايا لعدد محدود.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع استخدام الحيوان والبروتوكولات التجريبية تجري وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها لجنة السلامة المؤسسية ولجنة رعاية الحيوان في مركز العلوم الصحية في جامعة تكساس هيوستن.

1-تنقية PDGFRα إيجابية الخلايا Oligodendrocyte النسب من "الدماغ الماوس" (معدلة من إيمونوبانينج هو موضح سابقا البروتوكولات5،،من67)

  1. إعداد صفيحة إيمونوبانينج لتحديد الخلية إيجابية PDGFRα ولوحات 2 لاستنفاد الخلايا البطانية وميكروجليا.
    ملاحظة: يرجى ملاحظة أن أطباق بيتري لكن لا خلية ثقافة الأطباق تعمل للتجربة إيمونوبانينج؛ إذا كان سيتم استخدام الخلايا المنقي لاستزراع، يجب تنفيذ الخطوات إيمونوبانينج في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء
    1. معطف من 10 سم لوحة بيتري مع 30 الفئران لمكافحة الماعز ميليلتر مفتش في 10 مل pH 9.5، 50 مم تريس-HCl بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تحرض على لوحة للتأكد من أسطح اللوحات يشملها الحل الطلاء بالتساوي وبشكل كامل.
    2. تحضير PDGFRα جسم حل بتمييع ميليلتر 40 من جسم PDGFRα مكافحة الفئران مع 12 مل من الفوسفات مخزنة المالحة في دولبيكو (دببس) يحتوي على 0.2% جيش صرب البوسنة.
    3. بعد يغسل 3 من لوحة مفتش المغلفة مع 10 مل احتضان x DPBS 1، كل لوحة المغلفة بمفتش مع حل جسم PDGFRα في درجة حرارة الغرفة ح 4.
    4. أغسل PDGFRα مكافحة الفئران جسم معدني مغلف لوحة 3 مرات مع 10 مل كل 1 x DPBS. إضافة حل دببس على طول الجدار الجانبي اللوحة بلطف وعدم الإزعاج الأسطح المطلية.
    5. معطف 2 15 سم بيتري لوحات جديدة لاستنزاف خلايا بطانية و microglia مع 20 مل دببس التي تحتوي على 2.3 ميكروغرام/مل من يكتين سيمبليسيفوليا بانديريايا 1 (BSL-1) ح 2.
    6. أغسل المغلفة BSL-1 لوحات 3 مرات مع 20 مل 1 x DPBS. إضافة حل دببس على طول الجدار الجانبي من اللوحات بلطف وعدم الإزعاج الأسطح المطلية.
  2. يتم تعديل تنقية PDGFRα الإيجابية oligodendrocyte خلايا النسب من أساليب المنشورة سابقا6 , 7 , 8-
    1. تشريح الأنسجة القشرية من 2 بعد الولادة يوم 7 (P7) الماوس العقول سابقا وفقا للبروتوكولات المنشورة5،6.
    2. ننأى بالانسجة لتوليد تعليق خلية واحدة مع تفكك الأنسجة العصبية كيت (ع) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مفصلة.
    3. بإيجاز، يقتطع قطعة مع مشرط تشريح الأنسجة القشرية وإخضاعها الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية. وبعد الهضم، يدوياً ننأى بالقطع مع الزجاج المصقول النار الماصات باستور في تعليق خلية واحدة.
    4. الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة على 300 غرام x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتعليق بيليه خلية تستخدم 15 مل من المخزن المؤقت إيمونوبانينج (إيمونوبانينج المخزن المؤقت هو دببس مع جيش صرب البوسنة 0.02 في المائة و 5 ميكروغرام/مل الأنسولين).
    5. احتضان تعليق خلية واحدة من العقول الماوس 2 التتابع في لوحات BSL-1 المغلفة 2 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف لصفيحة كل 5 دقائق لضمان أفضل استنفاد microglia وخلايا بطانية.
    6. بلطف دوامة لوحة لجمع الخلايا غير ملتصقة في تعليق خلية واحتضانها لهم على لوحة المغلفة بالأجسام المضادة PDGFRα الفئران لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. بعد الحضانة لتعليق خلية في لوحة المغلفة بجسم الجرذ-PDGFRα، بلطف دوامة لوحة لجمع تعليق خلية، وشطف لوحة 8 مرات مع دببس للتخلص من الخلايا غير ملتصقة. بلطف إضافة الحل أغسل على طول الجدار الجانبي اللوحة وتحرض اللوحة عدة مرات للتخلص من الخلايا غير ملتصقة.
    8. فصل الخلايا من لوحة جسم معدني مغلف الفئران-PDGFRα استخدام مل 4 خلايا مفرزة حل المعاملة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. اهتزاز لوحة لإزاحة الخلايا ملتصقة.
    9. جمع المعاونة المنقي بالطرد المركزي في ز 300 x في درجة حرارة الغرفة، وتعليق بيليه الخلية مع 2 مل OPC خلية الثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير (500 مل خلية الثقافة المتوسطة هو DMEM/F12 المتوسطة التي تحتوي على 5 مل الحل البنسلين والستربتوميسين (P/S)، 5 مل N2، 10 مل B27, 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، 0.1% جيش صرب البوسنة، 20 نانوغرام/مل بفجف و 10 نانوغرام/مل PDGFRα).
  3. التحقق من صحة نقاء المعاونة بعد إيمونوبانينج.
    1. بغية تقييم إثراء المعاونة بعد إيمونوبانينج، واستخدام بعض المعاونة المنقي لاستخراج الحمض النووي الريبي مع ثيوسيانات جوانيديوم أساس استخراج وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    2. إجراء qRT PCR باستخدام صبغ أخضر نيون مزيج الرئيسي للتحقق من أجل إثراء التعبير PDGFRα في تنقية المعاونة بالمقارنة مع خلايا الدماغ ينتابها وفقا للمواد المنشورة سابقا4.
    3. بالإضافة إلى ذلك، بذور بعض المعاونة المنقاة في بولي-د-يسين مغلفة ألواح 24 جيدا إيمونوستينينج مع مكافحة NG2 كبريتات شوندروتن بروتيوغليكان (NG2) الأجسام المضادة كما سبق نشر المواد9.

2-إعداد شرائح منخفض-الخلية وبناء مكتبة شرائح للتسلسل الفائق

  1. إعداد شرائح منخفضة-خلية Olig2 مع نظام سونيكيشن متاحة تجارياً وعدد خلايا منخفض متاحة تجارياً رقاقة كيت (انظر الجدول للمواد) باتباع الإجراءات القياسية مفصلة من إرشادات الشركة المصنعة.
    1. بعد فصلها من الفئران مكافحة--PDGFRα وضع لوحة المغلفة بالأجسام المضادة وخلية العد مع تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير 1 مل OPC خلية الثقافة المتوسطة لكل رد فعل رقاقة 20,000 المعاونة المنقي.
    2. إضافة 27 ميليلتر من 36.5% فورمالدهايد لإصلاح تعليق خلية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: يرجى ملاحظة أنه يجب استخدام الفورمالدهايد في غطاء الأبخرة الكيميائية لأسباب تتعلق بالسلامة.
    3. إيقاف البروتين الحمض النووي العابرة للربط مع 50 جليكاين 2.5 م ميليلتر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: جميع الخطوات يجب أن تنفذ على الجليد أو في غرفة باردة 4 درجات مئوية من هذه النقطة.
    4. تغسل الكريات خلية cross-linked مع 1 مل من متوازن الملح الحل (حبس المثلج هانكس) مع مثبطات البروتياز كوكتيل والحصول على خلايا القريبون من يبرد قبل أجهزة الطرد مركزي في 300 غرام x عند 4 درجة مئوية.
    5. بيليه الخلية في 25 ميليلتر الكامل "تحلل المخزن المؤقت" لمدة 5 دقائق على الجليد.
      ملاحظة: تحرض على أنبوب لتعليق الخلايا الموجودة في "المخزن المؤقت لتحلل".
    6. الملحق الخلية مع 75 ميليلتر المثلج حبس المحتوية على مثبطات البروتياز كوكتيل والقص الكروماتين خلية التي تبرد قبل نظام سونيكيشن مع 5 دورات 30 ق على وق 30 إيقاف البرنامج. دائماً sonicate أنابيب 6 معا والتأكد من رصيد أنابيب تحتوي على 100 ميليلتر المياه.
    7. وبعد القص، الطرد المركزي في س 14,000 ز لمدة 10 دقائق 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية في أنبوب جديد بعد الطرد المركزي.
    8. تمييع 100 ميليلتر من الكروماتين المنفصمة مع تساوي حجم الجليد "العازلة رقاقة" كاملة مع مثبط البروتياز.
    9. إنقاذ 20 ميليلتر من الكروماتين المنفصمة المخفف كنموذج عنصر تحكم الإدخال.
      ملاحظة: نموذج عنصر تحكم الإدخال مطلوب أيضا بالمقارنة إلى Olig2 إيمونوبريسيبيتاتيد العينة لتحديد Olig2 جسم إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي.
    10. أضف 1 ميليلتر من جسم olig2 مكافحة الأرانب إلى 180 ميليلتر من تضعف المنفصمة الكروماتين واحتضان الأنبوب رد فعل على عجلة دوارة في 40 دورة في الدقيقة ح 16 عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غرفة باردة.
    11. لكل رد فعل رقاقة، أغسل ميليلتر 11 بروتين المغناطيسي الخرز المغلفة بألف مع ميليلتر 55 "الخرز يغسل المخزن المؤقت" ووضع حبة بيليه في ميليلتر 11 حبة يغسل المخزن المؤقت بعد يغسل 2.
      ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غرفة باردة.
    12. لكل رد فعل رقاقة، إضافة 10 ميليلتر من حبات المغلفة بالبروتين قبل غسلها لرقاقة رد فعل أنبوب. تنفيذ هذه الخطوة في غرفة باردة.
    13. احتضان الأنبوب رقاقة رد الفعل عند 4 درجة مئوية لآخر ح 2 على عجلة دوارة.
    14. وضع أنبوب رد فعل رقاقة على الرف المغناطيسية لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غرفة باردة.
    15. إزالة المادة طافية ولا إزاحة بيليه حبة.
    16. تغسل حبة بيليه مع 100 ميليلتر لكل من مخازن الغسيل 4 على التوالي لمدة دقيقة 4 على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية.
    17. بعد يغسل، إضافة 200 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى بيليه حبة واحتضان الأنبوب رقاقة رد الفعل عند 65 درجة مئوية ح 4 عكس قياس البروتين-الحمض النووي.
    18. بالإضافة إلى ذلك، أضف ميليلتر 180 شطف المخزن المؤقت إلى نموذج عنصر تحكم الإدخال ميليلتر 20 واحتضان عند 65 درجة مئوية ح 4 عكس قياس البروتين الحمض النووي، وكذلك.
    19. إضافة 200 ميليلتر 25:24:1 (v/v) خليط من الكحول الفينول كلوروفورم وإيسواميل لكل أنبوبة رد فعل رقاقة.
    20. الدوامة بقوة عن 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل في المرحلة العليا لأنبوب جديد.
    21. إضافة ميليلتر 40 م 3 صوديوم اسيتات الحل، 1,000 ميليلتر من الإيثانول 100% و 2 ميليلتر من الجليكوجين مرسب مرتبطة تساهميا بصبغة زرقاء لكل أنبوبة رد فعل رقاقة بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
    22. أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    23. تجاهل المادة طافية وتغسل مع 500 ميليلتر الباردة الإيثانول 70% والطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    24. تجاهل المادة طافية والحفاظ على الهواء بيليه الجافة لمدة 10 دقائق وحل بيليه مع 50 ميليلتر المياه.
  2. رقاقة بناء مكتبة للتسلسل الفائق
    1. تنظيف وتركز "رقاقة الحمض النووي" مع مجموعة أدوات تنظيف وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
    2. تحديد حجم العينة رقاقة من بيكو-أخضر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    3. استخدام مجموعة شرائح seq تي-تراجع والنسخ المتماثل وتراجع، وتبديل القالب والتمديد، إضافة محولات والتضخيم، واختيار حجم المكتبة وتنقية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      1. بعد تمسخ دسدنا، ديفوسفوريلاتي 3 ' نهاية سدنى بالجمبرى الفوسفاتيز القلوية وإضافة ذيل بولي (T) إلى سدنى ترانسفيراز ديوكسينوكليوتيديل المحطة الطرفية.
      2. يصلب التمهيدي "بولي الحمض النووي" (دا) على قالب سدنى لتكرار الحمض النووي وتبديل القالب.
      3. بعد القالب التبديل، تضخيم المكتبة seq رقاقة ببكر مع الإشعال إلى الأمام وعكس للفهرسة.
      4. حدد بكر تضخيم مكتبة seq رقاقة مع الشظايا التي تتراوح ما بين 250 إلى 500 bp بالخرز باراماجنيتيك بالخيار 2 لمضاعفة حجم التحديد.
      5. دراسة نوعية المكتبة seq رقاقة المحدد باستخدام جهاز التفريد الشعرية رقاقة موائع جزيئية.

3-بيانات التحليل

  1. إعداد بنية الدليل.
    1. قم بإنشاء دليل لتنفيذ تحليل البيانات رقاقة seq. داخل الدليل الذي تم إنشاؤه حديثا، قم بإنشاء الدلائل الفرعية الستة مع الأسماء التالية: raw.files، fastqc.output، bowtie.output، homer.output، macs2.output، motif.analysis، والتقارير.
  2. إعداد البيانات والقيام بتحليل مراقبة الجودة للبيانات الأولية تسلسل.
    1. الانتقال إلى الدليل "raw.files" وتحميل ملفات البيانات رقاقة seq.
    2. التحقق من أسماء الملفات. إذا كان التسلسل نهاية الاقتران، سيكون هناك 4 ملفات (اثنان للعلاج)، واثنان للإدخال مع أسماء قاعدة مشابهة: PDGFRα_Olig2.read1.fastq، PDGFRα_Olig2.read2.fastq، PDGFRα_input.read1.fastq، و PDGFRα_input.read2.fastq. إذا كانت أسماء الملفات مختلفة، إعادة تسميتها باستخدام الأمر "أم".
    3. الانتقال إلى الدليل "fastqc.output".
    4. الحصول على مقاييس الجودة من يقرأ الخام باستخدام برامج مراقبة جودة ملف فستق10. استخدام الأمر في الشكل S1A لتشغيل عملية مراقبة الجودة بشكل منفصل لكل ملف فاستق. سيتم عرض البرنامج عدة مقاييس مراقبة الجودة في ملف html.
    5. فتح ملف html مراقبة الجودة والتحقق من عدد ما يلي: قراءة طول الواحدة ونوعية قاعدة التسلسل، كل تسلسل الجودة عشرات وتسلسل GC المحتوى، ومستويات التسلسل الازدواجية، المحتوى المحول والمحتوى kmer.
  3. تقليم زائدة على ما يلي منخفضة الجودة والمحتوى المحول.
    1. مراقبة "لكل تسلسل قاعدة نوعية" وقطع "محول المحتوى". تحديد طول التشذيب لكل رأس وذيل لكل عملية قراءة. هو طول الكافي للتشذيب حيث نوعية قاعدة أقل من 30 وهناك أدلة على المحتوى المحول.
    2. الانتقال إلى الدليل "raw.files".
    3. تحميل وتثبيت برنامج حاسوبي لاقتطاع ما يلي:11. استخدم الأمر في الشكل S1B للتشذيب العلاج والإدخال بشكل منفصل. المعلمة 'المحاصيل' يشير إلى طول القراءة المتبقية بعد اقتطاع قواعد من النهاية و 'هيدكروب' يحدد عدد القواعد القضاء على من بداية القراءة.
    4. كما يتضمن الأمر اقتطاع الحد الأدنى قراءة طول مقبولاً بعد التصفية في المعلمة 'مينلين'. إذا كان يقرأ على الأقل 50 شركة بريتيش بتروليوم، استخدام 35 شركة بريتيش بتروليوم، كعتبة طول القراءة.
    5. الانتقال إلى الدليل "fastqc.output".
    6. أداء تحليل مراقبة جودة الملف فستق بعد التشذيب على ما يلي. تحقق من أن قضايا مراقبة الجودة قد تم حلها. استخدم الأمر في الشكل S1C للحصول على قياسات مراقبة الجودة.
  4. قم بمحاذاة يقرأ seq رقاقة واحدة-نهاية أو نهاية الاقتران للجينوم إشارة الماوس.
    1. الانتقال إلى الدليل "bowtie.output" لرسم الخرائط.
    2. تحميل الجينوم إشارة الماوس mm10 جينكودي. إعادة تسمية جينوم إشارة الماوس mm10 ك "mm10.fa".
    3. تحميل مخطط قراءة12 وتثبيته في النظام.
    4. إنشاء ملف فهرس الجينوم المرجع الذي تم تحميله باستخدام الأمر في S2A الشكل. يتم تلقائياً إنشاء ملفات ستة: mm10.1.bt2، mm10.2.bt2، mm10.3.bt2، mm10.4.bt2، mm10.rev.1.bt2، و mm10.rev.2.bt2.
    5. استخدم الأمر في الشكل S2B لتنفيذ المحاذاة وضبط المعلمة "-ف" إلى عدد أساسيات المعالجة وفقا لإعدادات النظام. في حالة تشغيل وضع نهاية الاقتران، معلمات "-1" و "-2" تشير إلى أسماء الملفات فستق المشذبة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ التعيين بشكل منفصل للعينات المعاملة والمدخلات، ويتم إنشاء ملفات السجل متري الإخراج لكل عينة.
    6. تنزيل برامج لمعالجة الملفات في تنسيق سام13 وتثبيته في النظام. تحويل ملف سام تمت محاذاته إلى أم ملف باستخدام الأمر في S2C الشكل.
  5. الحصول على مقاييس مراقبة الجودة للقراءات المعينة قبل ذروة يدعو كلا إقران نهاية العلاج ومراقبة العينات.
    1. واحدة من أهم مقاييس الجودة لعنوان هو عمق التسلسل. فتح ملفات "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" و "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" في الدليل bowtie.output وتأكد من أن عدد أزواج قراءة فريد تم تعيينه في كل عينة أكبر من 10 مليون.
    2. الانتقال إلى الدليل "homer.output".
    3. تنزيل برامج لاكتشاف الحافز والجيل التالي تسلسل تحليل14 وتثبيته في النظام.
    4. قم بإنشاء دليل يسمى "تاجدير".
    5. للتحقق من كلوناليتي العلامة، استخدم الأمر مبين في الشكل S3A. الأمر "ماكيتاجديريكتوري" سيقوم بإنشاء أربعة مراقبة جودة الإخراج files:tagAutocorrelation.txt، tagCountDistribution.txt، tagInfo.txt، و tagLengthDistribution.txt.
    6. الانتقال إلى الدليل "تاجدير".
    7. نسخ الملف "tagCountDistribution.txt" في الدليل "تقارير".
    8. الانتقال إلى الدليل "تقارير".
    9. افتح الملف tagCountDistribution.txt باستخدام برنامج جدول بيانات وإنشاء شريط الأرض عدد من العلامات كل موقف الجينوم. تخزين ملف الرسم البياني باسم "tag.clonality.xlsx".
    10. تثبيت R برمجة اللغة15 في النظام.
    11. في المحطة الطرفية، اكتب 'R' واضغط على ENTER للوصول إلى بيئة البرمجة R.
    12. تحميل حزمة R لتجهيز seq رقاقة البيانات16 وتثبيته باستخدام الأمر مبين في الشكل S3B.
    13. استخدام البرنامج النصي R في الشكل S3C مؤامرة الصليب حبلا-العلاقة المتبادلة.
  6. الكشف الذري باستخدام مخطط ذروته.
    1. الانتقال إلى الدليل "macs2.output". تنزيل وتثبيت مخطط ذروة17 في النظام الخاص بك.
    2. استخدم الدالة "كالبيك" مع العلاج والسيطرة على سوق بكارا للأسلحة الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.4.6.
      ملاحظة: معلمات أخرى تشمل "-و" لتنسيق ملف الإدخال، "-ز" لحجم الجينوم، "-اسم" لتشير إلى الاسم الأساسي لكافة ملفات الإخراج، و "-ب" لتخزين تصادم الشظايا في تنسيق بيدجراف. يتم تضمين الذروة إكمال استدعاء الأمر في S4A الشكل. استخدام بدب للعينات المزدوجة الغرض.
    3. تأكد من أن مخطط الذروة ولدت ستة ملفات: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls، PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak، PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed، PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r، PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg، و PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. فتح ملف PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls لعرض قمم تسمى، الموقع وطول، وموقف مؤتمر القمة، وتصادم والمقاييس تخصيب الذروة:-log10(pvalue)، أمثال تخصيب اليورانيوم، و-log10(q-value).
  7. تصفية وتعليم قمم تسمى.
    1. باستخدام الملف الذي فتحه في الخطوة السابقة، تصفية قمم الناتجة وفقا لإثراء إضعاف، قيمة p و/أو q-القيمة. لتحديد عتبات التصفية المناسبة، جعل مؤامرة الرسم بياني لتحديد الكثافة من كل متري. تصفية قيم العتبة محددة للحصول على قمم كبيرة.
    2. تحميل القائمة السوداء mm10 (مناطق معروفة بإشارة ارتفاع مصطنع) وتصفية الرقاقة-seq القمم التي تكون داخل أي من تلك المناطق قطعة أثرية.
    3. قم بإنشاء ملف سرير مع قمم المصفاة التي تحتوي على الأعمدة التالية: كروموسوم، بداية ونهاية، بيكيد، موك وحبلا. ملء العمود وهمية مع نقطة "." نظراً لأنه لا يستخدم. في العمود ستراند، تعيين كافة القيم إلى "+". احفظ الملف سرير ك "filtered.peakData2.bed".
    4. نسخ الملف "filtered.peakData2.bed" في الدليل "تقارير".
    5. الانتقال إلى الدليل "تقارير".
    6. لإضافة تعليق توضيحي القمم التي تمت تصفيتها إلى منطقة جين معين، استخدم الدالة "أنوتاتيبيكس" مع ملف سرير بإنشائه في الخطوة السابقة. ويبين الشكل S5Aالأمر المستخدم.
    7. افتح الملف "filtered.annotatedPeaks.txt" باستخدام برمجيات إحصائية.
    8. تصفية قمم الناتجة عن الكذب في منطقة إينتيرجينيك على مسافة أكبر من 5 كيلو من خدمات الدعم التقني مشروح. استخدام العمود "المسافة إلى خدمات الدعم التقني" في الملف كالمسافة للتصفية. تخزين على قمم المصفاة في ملف excel المسمى "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. تخزين الناتج عن تصفية قمم في ملف بيدجراف مع الأعمدة: كروموسوم، بداية، نهاية، و-log10(q-value). اسم الملف "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. إنشاء ملفات نتأمل للتصور المستعرض.
    1. تحميل وتثبيت برنامج حاسوبي للجينوم الحسابية18.
    2. تحميل أداة لتحويل بيدجراف لنتأمل وتثبيتها في النظام. تحميل الملف 'mm10.chrom.sizes'.
    3. استخدم الأمر في الشكل S6A لإنشاء ملف نتأمل.
    4. تنزيل وتثبيت مستعرض جينوم19 في النظام.
    5. افتح مستعرض الجينوم وتحميل الملف "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" لتصور قمم الهامة التي تمت تصفيتها ومواقعها فيما يتعلق بالجينات المعروفة.
  9. فكرة البحث.
    1. الانتقال إلى الدليل "motif.analysis".
    2. تحميل عزر نوفو دي المسح والحافز لتخصيب وتثبيته في النظام الخاص بك20.
    3. تحميل قاعدة بيانات فكرة شاملة تتضمن زخارف Olig2.
    4. الحصول على تسلسل الجينوم من 500 bp مناطق تركزت في مؤتمرات قمة هامة. تخزن في التسلسل ك peak.sequences.txt. استخدم الأمر في الشكل S7 للبحث عن زخارف Olig2 داخل كل منطقة من مناطق ذروة bp 500.
    5. تصفية زخارف الناتجة باستخدام قيمة ه كافية (الافتراضي = 0.05).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

منخفض-خلية رقاقة-seq أنجز وأجريت تحليلات بيوينفورماتيك للتحقيق في التفاعلات المحتملة من عامل النسخي Olig2 مع الحمض النووي في الدماغ تنقية حادة المعاونة. ويبين الشكل 1 سير عمل عامة التجريبية وإجراءات تحليل البيانات. في هذا البروتوكول، وتم فصل أدمغة الفئران بعد الولادة إلى تعليق خلية واحدة. وبعد تفكك النسيج، أجرى إيمونوبانينج لتنقية المعاونة باستخدام الأجسام المضادة PDGFRα. ويبين الشكل 2 في إثراء كبيرا PDGFRα، التعبير القليل من الع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

شبكات تنظيم الجينات الثدييات معقدة جداً. رقاقة-seq وسيلة قوية للتحقيق في تفاعلات البروتين على نطاق الجينوم الحمض النووي. ويشمل هذا البروتوكول كيفية أداء رقاقة-seq Olig2 باستخدام عدد قليل من المعاونة المنقي من العقول الماوس (منخفضة كخلايا 20 ألف كل رد فعل). الخطوة الرئيسية الأولى لهذا البروتوكول هو تنقية المعاونة من الماوس العقول التي إيمونوبانينج مع الأجسام المضادة PDGFRα. للتحديد الإيجابي للمعاونة مع لوحات PDGFRα المغلفة، المغلفة المعاونة ربط ضعيفة في كثير من الأحيان إلى PDGFRα لوحات. وحتى بعد يغسل عدة، لا تزال هناك بعض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

جقو XD، ركد و YY كانت تدعمها المنح المقدمة من المعاهد الوطنية من NS088353 R01 على الصحة؛ منح المعهد الوطني للصحة 1R21AR071583-01؛ مؤسسة هيرمان اوغيلفي الصندوق-النصب التذكاري ستمان؛ مبادرة المخ أوثيالث وكتسا UL1 TR000371؛ ومنحة من جامعة تكساس نظام علم الأعصاب، ومعهد بحوث الأعصاب (منحة #362469).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >كاشف / معدات< / قوي> Banderiaea
simplicifolia lectin 1مختبرات ناقلات# L-1100
جرذ مضاد للجسم المضاد PDGFRaBD Bioscience# 558774
مجموعة تفكك الأنسجة العصبية (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
Accutase STEMCELL# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Anti-NG2 شوندروتن كبريتات البروتيوغليكان الأجسام المضادةMillipore# AB5320
Bioruptor Pico جهاز صوتنةDiagenode# B01060001
مجموعة MicroChIP الحقيقيةDiagenode# C01010130
الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25:24: 1 ، الخامس / الحجم)الحرارية فيشر# 15593031
NucleoSpin Gel ومجموعة تنظيف PCRMACHEREY-NAGEL# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seq kitمختبرات Clontech# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
بيكو جرينثيرموفيشر # P11496
D-PBSثيرمو فيشر# 14190-144
SYBR جرين ماستر ميكسبيو راد المختبرات# 1725124
DMEM / F12فيشر العلمي# 11-320-033
البنسلين الستربتومايسين (P / S)فيشر العلمي# 15140122
مكمل N-2فيشر العلمي# 17502048
B-27 مكملفيشر العلمي# 17504044
الأنسولينسيجما# I6634تحضير محلول الأنسولين 0.5 مجم / مل عن طريق إذابة 5 مجم الأنسولين في 10 مل ماء و 50 مو ؛ ل من 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك.
ألبومين مصل الأبقار ، مناسب لزراعة الخلايا (BSA)سيجما# A4161قم بإعداد محلول BSA بنسبة 4٪ عن طريق إذابة 4 جم BSA في 100 مل D-PBS وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4
بروتين أساسي لعامل نمو الخلايا الليفية ، مؤتلف بشري (bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR# 102061-188
POLY-D-lysineVWR# IC15017510تحضير محلول 1 مجم / مل بولي دي ليسين عن طريق إذابة 10 مجم بولي دي ليسين في 10 مل من الماء وتخفيفه 100 مرة عند الاستخدام.
أطباق بتري فالكون التي تستخدم لمرة واحدة ، معقمة ، كورنينج ، 100 × 15 ممVWR# 25373-100
أطباق بتري فالكون التي يمكن التخلص منها ، معقمة ، كورنينج ، 150 × 15 ممVWR# 25373-187
HBSS ، 10X ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيوم ، لا فينول ريدفيشر العلمي# 14185-052
الخلايا الجذعيةالزرقاء# 07050
كوكتيل مثبط للبروتيازسيجما# 11697498001
<قوي> البرمجيات
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/الحصول على مقاييس مراقبة الجودة للقراءات الخام والمشذبة
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticالتشذيب وتصفية القراءات
الخامGENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzالجينوم المرجعي للفأر
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlالمحاذاة يقرأ إلى جينوم مرجعي
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/تحويل ملف SAM إلى تنسيق BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/إنشاء دليل علامات والتعليق على المناطق الجينومية المخصبة برموز الجينات
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/البرامج النصية ووظائف
التشغيل SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppإنشاء مخطط ارتباط متبادل للخيط
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSالعثور على مناطق إثراء ChIP على التحكم
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/حساب الجينوم
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/تحويل ملف bedGraph إلى
متصفح IGV bigwig 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/تصور وتصفح قمم ChIP-seq كبيرة
Microsoft ExcelSpreasheet برنامج
ENCODE القائمة السوداءhttps://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsتصفية قمم
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.تحويل ملف bedGraph إلى
قاعدة بيانات زخارف ENCODEالكبيرة [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/قاعدة بيانات الحافز الشاملة مطلوبة لإثراء الحافز
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlتحليل إثراء الحافز واكتشاف الحافز
أسماء التمهيدي المستخدمة ل qPCR< / strong><تسلسلات تمهيدية قوية> تستخدم ل qPCR< / strong>
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTCTTGGAGGAAGGGGGAC
Mog-R:TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGG
GAPDH-RCATACCAGAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCACAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT
تقنياتتقنيات برمجة

المراجع

  1. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
  2. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
  3. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
  4. Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).
  5. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562(2007).
  6. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  7. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
  10. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  11. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  12. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  15. Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
  16. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
  17. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
  21. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  22. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  23. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  24. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  25. Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
  26. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  27. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  28. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
  29. Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
  30. Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
  31. Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
  32. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
  33. Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Olig2 PDGFR alpha
تحديد مواقع النسخ Olig2 عامل ربط الجينوم في حدة تنقية PDGFRα + الخلايا من الكروماتين خلية منخفض إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل التحليل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.