استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكول للحصول على بيانات تسلسل amplicon التربة ورهيزوسفيري وميكروبيوميس اندوسفيري الجذر. هذه المعلومات يمكن استخدامها للتحقيق في تركيبة وتنوع المجتمعات الميكروبية النباتية المرتبطة، وهي مناسبة للاستخدام مع مجموعة واسعة من الأنواع النباتية.

Abstract

التفاعل الحميم بين المضيف النبات والكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها أمر بالغ الأهمية في تحديد النبات اللياقة البدنية، ويمكن أن تعزز التسامح محسنة للضغوط غير الحيوية والأمراض. ميكروبيومي النباتية يمكن أن تكون معقدة للغاية، ومنخفضة التكلفة، غالباً ما أساليب الفائق مثل amplicon-على أساس تسلسل الجين الرنا الريباسي 16S المفضل لوصف تشكيلة الميكروبية والتنوع. اختيار المنهجية المناسبة عند إجراء مثل هذه التجارب غير ذات أهمية حاسمة للحد من التحيزات التي يمكن إجراء التحليل والمقارنة بين العينات والدراسات صعبة. ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية موحدة لجمع واستخراج الحمض النووي من التربة ورهيزوسفيري، وعينات الجذر. بالإضافة إلى ذلك، تسلط الضوء على خط أنابيب تسلسل amplicon الرنا الريباسي 16S راسخة التي تسمح لاستكشاف تركيبة المجتمعات البكتيرية في هذه العينات، ويمكن تكييفها بسهولة لجينات علامة أخرى. هذا الخط قد تم التحقق من صحة لمجموعة متنوعة من أنواع النباتات، بما في ذلك الذرة، والذرة والقمح، والفراولة، والاغاف، ويمكن أن تساعد في التغلب على القضايا المرتبطة بالتلوث من العضيات النباتية.

Introduction

ميكروبيوميس المرتبطة بالنباتات تتكون من المجتمعات الميكروبية دينامية ومعقدة تتألف من البكتيريا، العتيقات، والفيروسات والفطريات وغيرها من الكائنات الدقيقة حقيقية النواة. بالإضافة إلى دورها مدروسة في التسبب في أمراض النباتات، الميكروبات المرتبطة بالنبات يمكن أيضا التأثير إيجابيا الصحة النباتية بتحسين التسامح الإجهادات الحيوية واللاحيويه وتعزيز توافر المغذيات، وتعزيز نمو النبات من خلال إنتاج فيتوهورمونيس. ولهذا السبب، يوجد اهتمام خاص في وصف الأصناف التي تربط بجذر نبات اندوسفيريس، ورهيزوسفيريس، والتربة المحيطة بها. بينما يمكن أن تكون بعض الميكروبات المستزرعة في عزلة في مختبر الوسائط التي تم إنشاؤها، كثير لا يمكن، جزئيا لأنها قد تعتمد على علاقات تكافلية مع غيرها الميكروبات، تنمو ببطء شديد، أو تتطلب الظروف التي لا يمكن تكرارها في بيئة معمل. لأنها تلتف الحاجة إلى زراعة وغير مكلفة نسبيا وعالية الإنتاجية، على أساس تسلسل النشوء والتطور التنميط العينات البيئية وما يرتبط بها المضيف الميكروبية أصبحت طريقة مفضلة للمعايرة المجتمع الميكروبي تكوين.

اختيار التكنولوجيات التسلسل الملائم توفيرها من قبل مختلف الجيل التالي التسلسل (خ ع) منصات¹ يتوقف على احتياجات المستخدمين، مع العوامل الهامة بما في ذلك: التغطية المطلوبة، وطول أمبليكون، يتوقع المجتمع التنوع، فضلا عن تسلسل نسبة الخطأ، وطول القراءة، وفي التكلفة--كل--التشغيل/مجباس. هو متغير آخر يحتاج إلى النظر في التجارب المستندة إلى amplicon التسلسل سوف تفصيل ما هي الجينات، وسوف تستخدم كبسولة تفجير ما. عند تصميم أو اختيار الإشعال، كثيرا ما يجبر الباحثين جعل المفاضلات بين الطابع العالمي للتضخيم وقرار التقسيم يمكن تحقيقه من أمبليكونس الناتجة عن ذلك. ولهذا السبب، اختيار هذه الأنواع من الدراسات غالباً ما الإشعال وعلامات التي تستهدف مجموعات فرعية محددة ميكروبيومي بصورة انتقائية. تقييم تكوين المجتمعات البكتيرية شيوعاً أنجزه تسلسل واحد أو أكثر من مناطق هايبرفاريابل 16S البكتيرية الرنا الريباسي الجين^2،3. في هذه الدراسة، يصف لنا أمبليكون أساس تسلسل البروتوكول وضع لمنصة خ ع تلك الأهداف 500 bp V3-V4 المنطقة الجينات الرنا الريباسي 16S البكتيرية، التي تسمح للتضخيم واسعة من الأنواع البكتيرية مع تقلب كافية لتوفير التمييز بين الأنواع المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة أن هذا البروتوكول تطويعها للاستخدام مع مجموعات التمهيدي الأخرى، مثل تلك التي تستهدف علامة ITS2 للفطريات أو وحدة فرعية الرنا الريباسي 18S حقيقيات النوى.

بينما الآخر النهج مثل metagenomics بندقية، وميتاترانسكريبتوميكس، وتسلسل خلية واحدة، توفر مزايا أخرى بما في ذلك حل الجينومات الميكروبية والقياس المباشر أكثر من وظيفة المجتمع، هذه التقنيات عادة أكثر ووصف مكلفة ومكثفة حسابياً من التنميط النشوء والتطور هنا⁴. بالإضافة إلى ذلك، أداء metagenomics بندقية وميتاترانسكريبتوميكس على عينات الجذر غلة نسبة مئوية كبيرة من القراء الذين ينتمون إلى جينوم النبات المضيف، وأساليب للتغلب على هذا القيد لا يزال حاليا نمواً^5،6.

كما هو الحال مع أي برنامج تجريبي، على أساس amplicon التنميط يمكن إدخال عدد من التحيزات المحتملة التي ينبغي أن ينظر فيها أثناء تحليل التصميم والبيانات التجريبية. وتشمل هذه الأساليب لجمع العينات، والحمض النووي استخراج وانتقاء من [بكر] كبسولة تفجير، وكيف يتم إعداد مكتبة. يمكن أن يؤثر تأثيراً كبيرا على كمية البيانات للاستخدام التي تم إنشاؤها بأساليب مختلفة، ويمكن أن يعوق الجهود المبذولة لمقارنة النتائج بين الدراسات. على سبيل المثال، الأسلوب لإزالة البكتيريا رهيزوسفيري⁷ واستخدام تقنيات الاستخراج مختلفة أو الاختيار من الحمض النووي استخراج مجموعات^8،9 قد ثبت أن تأثير كبير تحليل المتلقين للمعلومات، الأمر الذي يؤدي إلى استنتاجات مختلفة فيما يتعلق بأي من الميكروبات الحاضر وعلى وفرة نسبية. حيث يمكن تخصيصها على أساس amplicon التنميط، أن إجراء مقارنات عبر الدراسات يمكن أن يكون تحديا. وقد اقترح المشروع ميكروبيومي الأرض استفادة الباحثين دراسة النظم المعقدة مثل ميكروبيومي المرتبطة بالنبات من تطوير بروتوكولات موحدة كوسيلة لتقليل التقلبات الناجمة عن تطبيق أساليب مختلفة بين الدراسات^10،11. هنا، نحن مناقشة العديد من المواضيع المذكورة أعلاه وتقديم اقتراحات بشأن أفضل الممارسات بحيث المناسبة.

البروتوكول يوضح عملية جمع التربة، رهيزوسفيري، وعينات الجذر من السرغوم ذو لونين واستخراج الحمض النووي باستخدام الحمض النووي عزلة طقم راسخة¹¹. بالإضافة إلى ذلك، لدينا بروتوكول يتضمن سير عمل تسلسل amplicon مفصلة، باستخدام منصة خ ع تستخدم عادة، لتحديد هيكل المجتمعات البكتيرية^12،،من¹³¹⁴. وقد تم التحقق من هذا البروتوكول لاستخدامها في طائفة واسعة من مضيفي النباتات في دراسة نشرت مؤخرا من الجذور، رهيزوسفيري، والتربة المرتبطة 18 monocot الأنواع بما في ذلك السرغوم ذو لونين، ميس زيا، و قمح أيستيفوم¹⁵. هذا الأسلوب كما تم التحقق من للاستخدام مع جينات علامة أخرى، كما تجلى في التطبيق الناجح لدراسة الجينات علامة ITS2 الفطرية في دراسات الأغاف ميكروبيومي^16،17 والفراولة ميكروبيومي ¹⁸.

Protocol

1-جمع وفصل من الجذر اندوسفيري، رهيزوسفيري، وعينات من التربة

1. قبل الدخول إلى الميدان، اﻷوتوكﻻف الماء عالي النقاوة (على الأقل 90 مل مياه كل عينة) لتعقيم. إعداد الهوائي إزالة المخزن المؤقت (على الأقل 25 مل كل عينة) عن طريق إضافة 6.75 ز خ₂ص₄و 8.75 ز ك₂هبو₄1 مل من X-100 تريتون، إلى 1 لتر الماء المعقم. تعقيم المخزن المؤقت باستخدام عامل تصفية فراغ مع 0.2 حجم المسام ميكرومتر.
   1. للحصول على خطوات 1.2 إلى 1.5 ارتداء قفازات نظيفة معقمة مع الإيثانول في جميع الأوقات واستبدال القفازات بين كل عينة لمنع التلوث. تعقيم جميع المعدات مع الإيثانول 70% ومسح تنظيف جميع المعدات بين العينات. قبل أخذ العينات، تحديد عمق العينة المثلى للتجربة، وتكون متسقة مع جميع مجموعات التربة والجذر.
2. لجمع عينات التربة السائبة، استخدم جامع أساسية الإيثانول تعقيم تربة للحصول على التربة التي خالية من جذور النباتات بتجميع نواة تقريبا من 23 إلى 30 سم من قاعدة النبات.
3. نقل التربة بكيس من بلاستيك وتجانسه التربة التي تهز لطيف ونقل قاسمة عينة التربة (حوالي 600 مغ) لملء أنبوب 2 مل واحد. فورا وضع أنبوب 2 مل على الثلج الجاف أو فلاش تجميد الأنبوب في سائل ن₂ حتى على استعداد للمضي قدما في استخراج الحمض النووي (الخطوة 2).
   1. في بعض البيئات، التربة المحيطة بها يمكن أن تحتوي على المواد النباتية. في هذه الحالة، استخدم غربال معقمة 2 مم لفصل الحطام النبات من التربة قبل وضعها في الكيس من البلاستيك.
4. جمع الجذر ورهيزوسفيري، استخدم مجرفة تعقيم الإيثانول لحفر المصنع، مع الحرص على الحصول على قدر من الجذر ممكن. العمق مرهون بالمصنّع. في حين يمكن إزالة النباتات الصغيرة مثل القمح بحفر عدة سنتيمترات، قد تتطلب أكبر من النباتات مثل الذرة 30 سم أو أكثر. بلطف التخلص من التربة الزائدة من الجذور حتى يكون هناك حوالي 2 ملم تربة الانضمام إلى سطح الجذر.
   ملاحظة: العناية عند العمل مع محطات صغيرة، ذات الجذور الهشة، أو في التربة الجافة، والطين عالية المحتوى. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هناك فقط طبقة رقيقة من التربة المتبقية على الجذور بعد الهز. إذا بقيت مجاميع كبيرة من التربة، يمكن استخدام مطرقة مطاطية لإزاحة التربة بلطف ضرب القاعدة لتبادل لإطلاق النار. إذا تجاوزت كمية التربة المتبقية بعد هذه العملية أو يقصر عن 2 مم، الجدير بسماكة تقريبية.
5. للمنشآت الكبيرة، استخدام مقص معقم و/أو مقص لقص فقرة تمثيلية من جذورها ووضع حد أدنى من 500 ملغ أنسجة الجذر في قنينة مخروطية 50 مل. للأعشاب أصغر، وضع النظام بأكمله الجذر إلى القنينة. إضافة المخزن المؤقت لإزالة الهوائي ما يكفي تغطية الجذور، ثم وضع العينة فورا على الثلج الجاف أو فلاش تجميد العينة في سائل ن₂.
   ملاحظة: الحرص على عدم أوفيرفيل القنينة المخروطية 50 مل، أنها سوف تجعل الغسيل خطوة صعبة. ينبغي أن تكون هناك مساحة فارغة كافية يكون المخزن المؤقت الهوائي قادرة على التدفق إلى الأسفل وتحيط الجذور في جميع أنحاء القنينة، وتغطية الأعلى. نظراً لأن بعض الأعشاب قد الكتلة الأحيائية الجذرية أكثر مما تحتويه في قنينة مخروطية 50 مل، ينبغي أن تجمع فرعي من الجذور. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن قطع الجذور يمكن أن تؤدي إلى بكتيريا اندوفيتيك التي يجري غسلها في الكسر رهيزوسفيري، وينبغي التقليل من ذلك كسر الجذور. إذا لم تتم معالجة العينات مباشرة بعد عودته إلى مختبر، يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية.
6. فصل في رهيزوسفيري من الجذور، إذابة العينة الجذر على الجليد، ثم sonicate في نماذج الجذر عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع البقول من 160 ث ل 30 s، فصلها بنقل س. 30 الجذور في برود (4 درجة مئوية)، وتنظيف 50 مل الأنبوبة باستخدام الملقط العقيمة. عدم التصرف في الأنبوب الأصلي مع المخزن المؤقت، والتربة، وهو الكسر رهيزوسفيري (الشكل 1).
7. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت ورهيزوسفيري لفلاش 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية، 4,000 س زاي صب المادة طافية، تجميد الأنبوب الذي يحتوي على الكسر رهيزوسفيري في السائل ن₂، وتخزين الكسر رهيزوسفيري في-80 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما مع الحمض النووي استخراج (الخطوة 2).
8. لتغسل الجذور، إضافة حوالي 20 مل الماء المعقم المثلجة (4 درجة مئوية) إلى الكسر الجذري. تغسل الجذرية التي تهز بقوة (باليد أو خلاط، ل s 15-30)، ومن ثم استنزاف المياه.
9. كرر هذه الخطوة مرتين على الأقل، حتى لا يزال أي التربة على سطح الجذر. إذا كان لا يتم استخراج الحمض النووي (الخطوة 2) فورا، التفاف الجذور في رقائق الألومنيوم العقيمة، فلاش تجميد الجذور في سائل ن₂، وتخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما في استخراج الحمض النووي.

2. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: في جميع أنحاء الخطوات 2 و 3، قفازات نظيفة معقمة مع الإيثانول يجب أن تلبس في جميع الأوقات وجميع الأعمال ينبغي أن يقوم على سطح تعقيمها مع الإيثانول.

1. استخراج الحمض النووي من عينات التربة ورهيزوسفيري.
   1. استخدام ملعقة معقمة بسرعة نقل 250 ملغ من التربة ورهيزوسفيري من الخطوات 1.3 و 1.7 إلى أنابيب مجموعة منفصلة قدمت في مجموعة عزل الحمض النووي تجاري المصممة للاستخراج من التربة، ثم المضي في عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة المورد البروتوكول.
   2. بعد التينج تخزين الحمض النووي في المخزن المؤقت المقدمة من عدة عزل الحمض النووي، شطف الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى على استعداد للمضي قدما في الخطوة 3.
2. استخراج الحمض النووي من عينات الجذر.
   1. البرد تعقيم قذائف الهاون والمدقة باستخدام سائل ن₂. قياس بملغ 600 إلى 700 من أنسجة الجذر ووضع الأنسجة في الهاون. بعناية، إضافة كافية السائل ن₂ لتغطية الجذور.
   2. طحن الجذور إلى قطع صغيرة. تستمر عملية إضافة السائل ن₂ وطحن (مرتين على الأقل، تكون متسقة بين العينات)، حتى تكون الجذور مسحوق ناعم. ضمان أن الأنسجة الجذرية لا ذوبان الجليد أثناء هذه الخطوة.
      تحذير: استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معطف مختبر والنظارات الواقية والقفازات المبردة) عندما تعمل مع سائل ن₂.
      ملاحظة: لاستخراج الحمض النووي منخفضة جودة، يمكن أن تكون مفيدة طحن الجذور الزائدة إلى مسحوق وتخزين المسحوق في-80 درجة مئوية.
   3. بسرعة، يبدأ مسحوق قبل الجذر لذوبان الجليد، واستخدام ملعقة عقيمة لنقل مسحوق الجذر إلى أنابيب قبل وزنه 1.5 مل على الجليد. سجل وزن الأنبوبة ومسحوق. عادة، يتم نقل 300-400 ملغ مسحوق.
   4. استخدام ملعقة معقمة بسرعة نقل 150 ملغ مسحوق الجذر إلى أنبوب جمع المنصوص عليها في مجموعة عزل الحمض النووي تجاري المصممة للاستخراج من التربة، ثم المضي في عزل الحمض النووي باستخدام بروتوكول مجموعة المورد.
      ملاحظة: بعض العينات الجذر، يمكن أن يكون تركيز عال من المواد العضوية المتبقية في بيليه الحمض النووي، مما يحول دون تضخيم الحمض النووي خلال PCR، خصوصا عندما بروتوكول استخراج الحمض النووي مختلفة (على سبيل المثال-، استخراج كتاب) يستخدم. إذا لزم الأمر، بتنظيف الحمض النووي باتباع الإرشادات المتوفرة في مجموعة أدوات تنظيف الحمض النووي البيئية.
3. قياس تركيز جميع عينات من الحمض النووي من فلوروميتير benchtop حساسية عالية باستخدام.
   1. إضافة 1-20 ميليلتر من كل عينة الحمض النووي التيد داخل أنابيب المقدمة في أدوات تحليل حساسية عالية دسدنا. إضافة حل عملي فلوروميتير (1: 200 صبغ: المخزن المؤقت) ما يصل إلى 200 ميليلتر.
   2. إعداد اثنان أنابيب إضافية تحتوي على 10 ميليلتر من الحمض النووي 1 القياسية (0 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي) أو 10 ميليلتر من 2 القياسية (100 نانوغرام/ميليلتر)، وإضافة ميليلتر 190 fluorometer العامل الحل لكل معيار.
   3. قياس تركيز المعايير وكل عينة. إذا لم يتم ذلك تلقائياً، احسب تركيز الحمض النووي من إخراج امتصاص بانحدار خطي اثنين من المعايير.

3-أمبليكون المكتبة إعداد وتقديم

1. قم بإعداد مواد لرد فعل التضخيم.
   1. ذوبان الجليد عينات من الحمض النووي في 4 درجات مئوية وإبقائهم على الجليد في الخطوة 3. بطريقة عشوائية على نظام عينات الحمض النووي للتقليل من التحيز بسبب الموقع على لوحة بكر (الجدول 2).
   2. في صفيحة بكر 96، حسنا، تمييع الحمض النووي من كل عينة في الماء الجزيئية الصف إلى 5 نانوغرام/ميليلتر في إجمالي حجم 20 ميليلتر. إضافة 20 ميليلتر الجزيئية الصف المياه إلى الآبار الزوايا الأربع كعناصر سلبية للتضخيم (فراغات) (الجدول 2).
   3. ترتيب الإشعال المراقب (10 ميكرومتر) في أنابيب قطاع بكر أو لوحة 96-جيدا أن يمكن إضافتها مع ماصة متعدد القنوات (الشكل 2).
   4. إعداد كاف بكر مزيج الرئيسي تضخيم كل عينة الحمض النووي في ثلاث نسخ. إعداد 1.5 ميليلتر لجيش صرب البوسنة (20 ملغ/مل)، ميليلتر 37.5 مسبقة الصنع 2 x ميكس الرئيسية (تتألف من المخزن المؤقت بكر مجكل₂، دنتبس و بوليميراز الدنا بوليميراز)، 0.57 ميليلتر من بلاستيدات الخضراء السلطة الوطنية الفلسطينية (100 ميكرومتر)، 0.57 ميليلتر من السلطة الوطنية الفلسطينية المتقدرية (100 ميكرومتر)، و 25.86 ميليلتر من الماء الصف الجزيئية.
   5. صب المزيج الرئيسي إلى 25 مل عقيمة من خزان ماصة متعددة القنوات وتوزيع ميليلتر 66 من مزيج الرئيسي في كل بئر من صفيحة بكر 96-بئر جديدة استخدام ماصة متعددة القنوات.
      ملاحظة: عند حساب حجم الكاشف لمزيج الرئيسي، تأكد من أيضا تشمل 4 آبار فارغة للوحة الواحدة.
   6. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 6 ميليلتر من 5 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي (من لوحة الحمض النووي تم تسويتها) على اللوحة الرئيسية ميكس. ثم إضافة إلى ميليلتر اللوحة الرئيسية 1.5 من 10 ميكرون التمهيدي إلى الأمام كل عمود رمز شريطي مختلفة إلى الأمام، وميليلتر 1.5 من 10 ميكرون عكس التمهيدي كل صف له رمز شريطي عكس مختلفة (الشكل 2) له.
      ملاحظة: قبل إضافة كبسولة تفجير، لوحات تجارب معشاة ومزيج الرئيسي يمكن لتضخيم الجينات الفطرية للبحث عن أو ITS2 إذا أضيفت الإشعال المختلفة. إذا كان هذا هو الحال، يمكن استخدام تصميم التمهيدي مماثلة.
   7. تدور أسفل اللوحة بإيجاز في غ. س 3,000 استخدام ماصة متعدد القنوات المزيج بلطف، ثم تقسم إلى ثلاث لوحات مع 25 ميليلتر من خليط رد فعل.
      ملاحظة: على الرغم من أن replicates الثلاثة ليست ضرورية تماما، فإنه يقلل تأثير التغير التقني.
2. تضخيم الحمض النووي في كل لوح باستخدام ثيرموسيكلير للشروط التالية: 180 s عند 98 درجة مئوية، 30 دورات من: 98 درجة مئوية ل 45 s (يشوه)، 78 درجة مئوية لمدة 10 ق (السلطة الوطنية الفلسطينية الصلب)، 55 درجة مئوية مقابل 60 s (التمهيدي الصلب)، و 72 درجة مئوية ل 90 s (ملحق) ، 600 ثم اضغط s عند 72 درجة مئوية، يليه 4 درجات مئوية بخطوة. بعد التضخيم، تجمع ثلاث لوحات نسخ متماثل إلى لوحة 96-بئر واحدة واحدة.
3. تحديد كمية الحمض النووي باستخدام الكواشف fluorometer حساسية عالية في قارئ لوحة 96-جيدا.
   1. إضافة 2 ميليلتر لكل منتج PCR ميكروسكوبية 96، حسنا، جنبا إلى جنب مع ميليلتر 98 fluorometer العامل الحل (1: 200 صبغ: المخزن المؤقت). وتشمل 4 آبار كمعايير: 5 ميليلتر من الحمض النووي 1 القياسية (من 0 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي)، ميليلتر 1 2 القياسية (10 نانوغرام/ميليلتر) و 2 ميليلتر من 2 قياسية (20 نانوغرام/ميليلتر) 5 ميليلتر من 2 القياسية (50 نانوغرام/ميليلتر). قم بإضافة فلوروميتير حل عملي لوحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر.
      ملاحظة: كل عينة يمكن أن تقاس باستخدام فلوروميتير benchtop كما هو موضح في الخطوة 2، 3 إذا لم يتوفر قارئ لوحة.
   2. احسب تركيز الحمض النووي من إخراج امتصاص بانحدار خطي للمعايير الأربعة.
   3. للمراقب بنجاح تضخيم تجمع المنتجات (تلك التي تحتوي تركيز أكبر من 15 نانوغرام/ميليلتر)، 100 نانوغرام لكل عينة في أنبوب واحد 1.5 مل (الجدول 2).
   4. حساب متوسط حجم العينات إضافة إلى التجمع باستخدام الدالة =AVERAGE() في برنامج جدول بيانات. إضافة حجم منتجات PCR "فارغة" للعينات المجمعة.
      ملاحظة: نظراً لمنتجات PCR "فارغة" تركيبات الباركود الفريدة الخاصة بهم، يمكن متسلسلة للتحقق من وجود أي ملوثات المختبر.
4. قياس تركيز المنتج المجمعة باستخدام فلوروميتير benchtop كما هو موضح في الخطوة 2، 3، وتأخذ 600 نانوغرام من الحمض النووي وتمييع في الماء الجزيئية الصف إلى وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر في أنبوب 1.5 مل. تخزين المنتج المجمعة المتبقية في-20 درجة مئوية.
5. يغسل الحمض النووي نغ 600 الكوة باتباع عملية تنقية PCR المقررة مع التنقية باراماجنيتيك الخرز في شكل 96-جيدا مع بعض الاستثناءات القليلة.
   1. جعل ميليلتر 600 جديدة الكوة من الإيثانول 70%. يهز زجاجة الخرز المغناطيسي إعادة تعليق الخرز التي تترسب في القاع.
   2. إضافة 1 x حجم (100 ميليلتر) الحل حبة إلى قاسمة نغ 600 من الحمض النووي. مزيج دقيق من بيبيتينج 10 مرات. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. ضع الأنبوب على موقف المغناطيسي ل 2 دقيقة (أو حتى الحل الواضح) لفصل حبات من الحل. بينما لا يزال الأنبوب الوقوف المغناطيسي ونضح المادة طافية واضحة بعناية دون لمس الخرز المغناطيسية، وتجاهل المادة طافية واضحة.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، المنتجات أمبليكون بد أن الخرز المغناطيسية. أي الخرز التي مطمح الانزعاج أو فقدت خلال سيؤدي إلى فقدان الحمض النووي.
   4. ترك الأنبوب في موقف المغناطيسية وإضافة 300 ميليلتر من الإيثانول 70% إلى الأنبوب؛ احتضان في درجة حرارة الغرفة ل Aspirate س. 30 الإيثانول وتجاهل. كرر هذه العملية، وإزالة جميع الإيثانول بعد الغسيل الثاني. إزالة الأنبوب من موقف المغناطيسية، والهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
   5. إضافة 30 ميليلتر من الماء الجزيئية الصف الخرز المجففة ومزيج من بيبيتينج 10 مرات. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 عودة الأنبوب بالحامل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز من الحل. نقل النذرة بأنبوب جديد.
      ملاحظة: المغناطيسي الخرز لن يؤثر على ردود فعل المتلقين للمعلومات.
6. قياس تركيز النهائي لتنظيفها، والحمض النووي المجمعة باستخدام فلوروميتير benchtop كما هو موضح في الخطوة 2، 3. يضعف قاسمة إلى 10 نانومتر في حجم نهائي 30 ميليلتر، أو لتركيز وحجم المفضل من قبل مرفق التسلسل.
7. الاستعانة بخدمات مرفق التسلسل لتسلسل الحمض النووي على منصة خ ع، 2 × 300 bp إقران نهاية التسلسل.

Results

ينبغي أن يؤدي تنفيذ البروتوكول الموصى بها في مجموعة بيانات المفهرسة يقرأ نهاية الاقتران يمكن مطابقة مرة أخرى لكل عينة وتم تعيينها إلى أما البكتيريا الوحدات التصنيفية التشغيلية (أسامة) أو متغير التسلسل الدقيق (ESV، كما يشار إلى أمبليكون تسلسل البديل (ASV) ووحدة تصنيفية سوبوبيراشونال (سوتو))، اعتماداً على تحليل المتلقين للمعلومات. من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة التسلسل، يجب الحرص في كل خطوة الحفاظ على الاتساق بين العينات والتقليل من إدخال أي تحيز محتمل أثناء تجهيز العينة أو إعداد الم...

Discussion

هذا البروتوكول يوضح خط أنابيب ثابتة لاستكشاف اندوسفيري الجذر، رهيزوسفيري، وتركيبة المجتمع الميكروبي التربة، من المعاينة الميدانية لتجهيز العينات وتسلسل المتلقين للمعلومات. دراسة ميكروبيوميس المرتبطة بجذور تحديات فريدة من نوعها، يرجع جزئيا إلى الصعوبات الكامنة في أخذ العينات من التربة. التربة الغاية متغير من حيث الخصائص الفيزيائية والكيميائية، وظروف التربة المختلفة يمكن أن تكون مفصولة أقل قدر بضعة مليمترات^28،29. وهذا يمكن أن يؤدي إلى العينات التي جمعت من مواقع أخذ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-10 / 20 & مايكرو ؛ L ماصة دقيقة مصفاة	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	1120-3810	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	1615-5510	يمكن استبدالها بما يعادل من الموردين الآخرين.
10 وميكرو ؛ L ماصة	Eppendorf	3122000027 متعددة	القنوات يمكن استبدالها بمعادلة من موردين آخرين.
10 وميكرو ؛ لتر ، 100 وميكرو ؛ L ، و 1000 & L الماصات الدقيقة	Eppendorf	3120000909	يمكن استبدالها بما يعادلها من موردين آخرين.
100 وميكرو ؛ L ماصة	Eppendorf	3122000043 متعددة	القنوات يمكن استبدالها بمعادلة من موردين آخرين.
1000 & ميكرو; L ماصة دقيقة مصفاة نصائح	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	1122-1830	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
2 مل أنابيب الطرد المركزي	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	1620-2700	يمكن استبدالها بما يعادل من الموردين الآخرين.
مم غربال التربة	الموردين	الغابات 60141009	يمكن استبدالها بما يعادل من الموردين الآخرين.
200 وميكرو ؛ L متصفى أطراف الماصة الدقيقة	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	1120-8810	يمكن استبدالها بما يعادلها من موردين آخرين.
25 مل خزانات	VWR International LLC	89094-664	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
50 مل قوارير مخروطية	الشكل يمكن استبدال Thermo Fisher Scientific	352098	بما يعادل من موردين آخرين.
500 مل فلاتر فراغ (0.2 & micro; حجم المسام)	VWR International LLC	156-4020
96 بئر لوحات	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	655900
لوحات PCR 96 جيدا	BioRad	HSP9631
Agencourt AMPure XP	الخرز Thermo Fisher Scientific	NC9933872	تعليمات الاستخدام: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 & documentName=B37419AA.pdf
رقائق الألومنيوم	Boardwalk	7124	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
مقياس تحليلي بدقة 0.001 جم	يمكن استبدال Ohaus Pioneer	PA323	بما يعادل من موردين آخرين.
Bioruptor Plus بالموجات فوق الصوتية	Diagenode	B01020001
ألبومين مصل الأبقار (BSA) 20 مجم / مل	نيو إنجلاند Biolabs	B9000S
جهاز طرد مركزي	Eppendorf	5811000908	بما في ذلك محولات دلو لوحة 50 مل و 96 بئر
قفازات مبردة	يمكن استبدال Millipore Sigma	Z183490	بما يعادل من موردين آخرين.
مجموعة DNeasy PowerClean (اختيارية)	Qiagen Inc.	12877-50	سابقا MoBio
DNeasy PowerSoil kit	Qiagen Inc.	12888-100	سابقا MoBio
Dry ice	أي
DynaMag-2	Thermo Fisher Scientific	12321D	لا تستبدل
الإيثانول	VWR International LLC	89125-188	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
أكياس الفريزر بحجم جالون	يمكن استبدال Ziploc	NA	بما يعادلها من موردين آخرين.
جزيئية قارئ الصفيحة الدقيقة Gemini EM			استخدام مقياس فلوري آخر يقرأ لوحا بسعة 96 بئرا من الأعلى.
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Lab coat	Workrite	J1367	يمكن استبداله بما يعادل من موردين آخرين.
سائل N2< / sub>	استبدال أي	NA	بما يعادل من موردين آخرين.
سائل N2< / sub> dewar	Thermo Fisher Scientific	4150-9000	يمكن استبداله بما يعادل من الموردين الآخرين.
نظام تنقية المياه فائق النقاء Milli-Q	Millipore Sigma	SYNS0R0WW
أجهزة الطرد المركزي الصغيرة	Eppendorf	5404000014
المياه من الدرجة الجزيئية	تحل محل 4387937	Thermo Fisher Scientific	بما يعادل من موردين آخرين.
يمكن استبدال Mortars	VWR International LLC	89038-150	بما يعادل من موردين آخرين.
قفازات النتريل	Thermo Fisher Scientific	19167032B	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
المناشف الورقية VWR	International LLC	BWK6212	يمكن استبدالها بما يعادل من الموردين الآخرين.
فيلم ختم لوحة PCR	Thermo Fisher Scientific	NC9684493
أنابيب شريط PCR الولايات	المتحدة الأمريكية Scientific	1402-2700
Pestles	VWR International LLC	89038-166	يمكن استبداله بما يعادل من موردين آخرين.
ملاعق بلاستيكية	LevGo، Inc.	17211
بلاتينيوم هوت ستارت بي سي آر ماستر ميكس (2x)	ثيرمو فيشر 13000014
ال PNAs - البلاستيدات الخضراء والميتوكوندريا	PNA Bio	NA	تأكد من التحقق من تسلسل المعلوماتية الحيوية
نظارات واقية	Millipore Sigma	Z759015	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
كيوبيت 3.0 مقياس الفلور	الحراري فيشر العلمي	Q33216
كيوبيت dsDNA HS طقم الفحص	Thermo Fisher Scientific	Q32854
مطرقة مطاطية (اختياري)	يمكن استبدال	أجهزة Ace 2258622	بما يعادل من موردين آخرين.
المقصات أو المقصات	VWR International LLC	89259-936	يمكن استبدالها بما يعادل من موردين آخرين.
يمكن استبدال Shovel	Home Depot	2597400	بما يعادل من موردين آخرين.
مجمع قلب التربة (قطر صغير: < 1 بوصة)	يمكن استبدال Ben Meadows	221700	بما يعادل من موردين آخرين.
يمكن استبدال زجاجات الرش	Santa Cruz Biotechnology	sc-395278	بما يعادل من موردين آخرين.
بادئات قياسية مشفرة محلاة (10 وميكرو ؛ م) (الجدول 1)	IDT	NA	4 nmole Ultramer DNA Oligo مع تحلية قياسية. تم تصميم محول NGS وبرايمر التسلسل (الجدول 1) للاستخدام مع Illumina MiSeq باستخدام كيمياء v3.
Thermocycler	Thermo Fisher Scientific	E950040015	محل ما يعادله من موردين آخرين.
استبدال Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	بما يعادل من موردين آخرين.
استبدال قوارب الوزن	Spectrum Chemicals	B6001W	بما يعادل من موردين آخرين.