Method Article

مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

DOI:

10.3791/57636

⸱

June 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS, 2METi, 3CNRS, LAAS, 4Univ de Toulouse, INSA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن بالتفصيل الأساليب التجريبية المستخدمة لتقييم قوي نتوء بودوسوميس تنطبق على فيلم متوافقة، من إعداد الفيلم للتحليل الآلي للصور الطبوغرافية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العديد من السياقات البيولوجية، تحتاج الخلايا الحيوانية من التفاعل فعلياً مع بيئتها بتطوير القوات الميكانيكية. ومن بين هذه الجر قوات كانت تتسم جيدا، ولكن هناك نقص في التقنيات التي تسمح بقياس بروز قوي تمارسه الخلايا أورثوجونالي إلى هذه الركيزة. لقد قمنا بتصميم إعداد تجريبية لقياس بروز قوي تمارسه الخلايا ملتصقة على هذه الركيزة. خلايا مطلي على ورقة فورمفار متوافقة مع تشوه هذه الركيزة وهو تعيين التضاريس الناتجة عن ذلك بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM) بمقياس نانومتر. ثم يتم استخراج قيم القوة من تحليل الشخصية تشوه استناداً إلى هندسة الهياكل الخلوية بارزة. ومن ثم، يمكن قياس قوي تمارسه الوحدات الفردية بارزة من خلية حية على مر الزمن. وستمكن هذه التقنية دراسة توليد القوة وتنظيمها في العديد من العمليات الخلوية التي تنطوي على نتوء. وهنا يصف لنا تطبيقه لقياس قوي بارزة المتولدة عن بودوسوميس التي شكلتها الضامة البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الحيوانية التفاعل فعلياً مع المصفوفة والخلايا الأخرى التي تشكل هذه البيئة1. وهذا مطلوب بالنسبة لهم ترحيل أو تدخيل الهيئات، والحصول على المعلومات الخارجية أو التفريق. في مثل هذه العمليات، يجب إنشاء الخلية القوات الميكانيكية، وكما أظهرت العديد من الدراسات على مدى السنوات الأخيرة، قدرة خلية لتوليد القوى، والتحقيق في بيئتها يؤثر على سلوكها البيولوجي، على سبيل المثال توجيه الانتشار أو تمايز2،3. بدوره، قياس قوات الخلوية مساعدة كبرى دراسة تنظيم توليد القوة وفهم أثره في الخلايا والأنسجة والسلوك مصير4،5.

وقد شهدت السنوات الأخيرة تطوير العديد من التقنيات لقياس القوى التي يمكن أن تمارسه خلية على البيئة6. أن غالبية هذه قد ساعدت في الكشف عن قوي الجر أن تمارس الخلايا كما أنها تسحب متنقلة المسابير أو تشوه الركازة. بيد قوي ميكانيكية المتورطين في نتوء في البيئة خارج الخلية تعاني من الافتقار إلى تقنيات القياس والتاريخ تتميز ليس على ما يرام.

للتغلب على هذا التحديد، نقدم طريقة لقياس القوى التي تمارس أورثوجونالي إلى الركيزة. وهو يتألف في طلاء الخلايا الحية على ورقة رقيقة مرنة التي يمكن أن تشوه في اتجاه متعامد، مما يجعل من الممكن لقياس التشوه الركيزة بالخلايا ونستنتج القوى المعنية. يقاس الطوبوغرافيا الركازة مع القرار النانو باستخدام مجهر القوة الذرية والتقييم للقوات من التشوه ويعتمد على معرفة هندسة الهياكل الخلوية بارزة7،8، 9.

هنا، نحن وصف الإعداد وتطبيقها لقياس القوى التي تم إنشاؤها بواسطة بودوسوميس، هياكل التصاق بارزة شكلتها الضامة لهجرتهم الوسيطة في بيئات ثلاثية الأبعاد10،11، 12،13،،من1415،،من1617. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب ستعزز التفاهم وتوليد القوة وتنظيمها في العديد من العمليات الخلوية التي تنطوي على نتوء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الشبكات المغلفة فورمفار

  1. تنظيف شبكات الميكروسكوب الإلكتروني مع الأسيتون النقي وتجفيفها على ورق الترشيح. ثم نظيف شريحة مجهر مع الإيثانول النقي، يمسح مع ورقة عدسة وإزالة الغبار مع منفاخ.
  2. مكان على شريحة زجاج تنظيفها الإيثانول عمودياً في القمع لجهاز صب الأفلام التي تتضمن حلاً فورمفار في الجزء السفلي. يغطي الجزء العلوي من القمع.
  3. ضخ 100 مل محلول فورمفار (0.5% في كلوريد الإيثيلين) مع لمبة رذاذ حتى يصل إلى المستوى الثلثين من الشريحة.
  4. ضع الشريحة في الحل لمدة 1 دقيقة.
  5. فتح الصمام الجهاز استنزاف الحل فورمفار في دفق مستمر. معدل تدفق من 10 إلى 15 مل/s سوف تسفر عن فيلم فورمفار من 30-80 نانومتر. يتم تحديد سمك الفيلم بتركيز حل فورمفار، ومعدل الصرف.
    ملاحظة: يمكن التحكم في سعر الصرف بواسطة التنفيس الضغط عن طريق صمام الهواء من خلال فتح ببطء الصمام. أسرع الصرف، وأكثر سمكا الفيلم. في الممارسة العملية، لأنه من الصعب التنبؤ بسمك الفيلم من معدل التدفق فورمفار، نحن إعداد عدة دفعات من الأفلام فورمفار ومراقبة سمكها حسب فؤاد (راجع الخطوة 2).
  6. إزالة الشريحة من الدائرة وجاف أنه دقيق على الورق مرشح لإزالة أي فورمفار السائلة.
  7. قطع مستطيل 20 مم × 50 مم من الفيلم فورمفار بشفرة حلاقة.
  8. ملء كوب ماء مقطر نظيفة ويغرق ببطء الشريحة عمودياً في الماء لتطفو قبالة الفيلم: الفيلم يجب أن تطفو على سطح الماء.
  9. مواجهة شبكات تنظيف الأسيتون الجافة مكان في الفيلم، لامعة.
  10. وضع زجاج جولة ساترة (Ø 12 مم) على عدد قليل من الشبكات. سيعمل هذا ساترة قياس سماكة الفيلم (راجع الخطوة 2).
  11. تغطية شريحة مجهر مع ملصق أبيض حجمها لتناسب ذلك. تراجع الشريحة عمودياً عند الحدود للفيلم فورمفار العائمة حتى الفيلم كله تلتزم بالشريحة. إزالة الماء الزائد من الشريحة مع ورق الترشيح وأتركها تجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

2-قياس سمك الفيلم

  1. قطع فورمفار حولها ساترة مع ملاقط لفصل فإنه من الشريحة.
  2. وضع علامة على موقع الشبكة تحت ساترة بقلم.
  3. قطع فورمفار حول الشبكة ملحوظ لفصل فإنه من ساترة. ولذلك ستكون ثقب في ورقة فورمفار المتبقية، والتي سوف تسمح لقياس سماكة الفيلم. تغطية ساترة مع برنامج تلفزيوني ووضعه على شريحة زجاج في المجهر.
  4. جبل ناتئ نيتريد سيليكون على كتلة الزجاج فؤاد، مع التأكد من أن الشريط الذهبي لا يشملها غيض من فصل الربيع.
    ملاحظة: حساسية وربيع ثابت ناتئ ينبغي أن يكون سابقا تم معايرة في برنامج تلفزيوني.
  5. جبل كتلة الزجاج على الوحدة النمطية فؤاد ومن ثم وضع الوحدة النمطية على المجهر.
  6. ضع ساترة المغلفة فورمفار في دائرة المراقبة وتغطية ذلك مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  7. المسح الضوئي من الثقب في ورقة فورمفار استخدام فؤاد في وضع الاتصال ومجموعة قوة 0.5 nN نقطة الحدود.
  8. استخدام سطح الزجاج ساترة كالمرجع لقياس الطول، وتقييم سمك فورمفار كارتفاع المقطع العرضي (إجراء قياسات على الأقل 10 كل دفعة فورمفار).

3-زرع الخلايا في الشبكات

  1. تحت غطاء عقيمة، وضع شريطا (12 ملم × 3 ملم) من شريط لاصق الوجهين على ساترة.
  2. قطع شبكة فورمفار المغلفة بملاقط ووضعه رأسا على قطاع لاصقة (حافة الشبكة فقط يحتاج لإلحاقها بالشريط). الفيلم فورمفار يجب أن تواجه ساترة.
  3. وضع هذا الجهاز في ثقافة جيدا.
  4. مكان معالجة تجميعية 10 ميليلتر من ربمي دون FCS التي تحتوي على 104 الضامة متباينة من وحيدات الإنسان16.
    ملاحظة: تأكد من عدم اتصال الشبكة مع طرف الماصة لمنع إتلاف طلاء فورمفار.
  5. احتضان لمدة 30 دقيقة (37 درجة مئوية، 5% CO2) للسماح للخلايا الالتزام.
  6. تملأ البئر مع 2 مل ربمي المحتوية على السفح 10%.
  7. احتضان الجهاز ح 2 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للسماح للخلايا الالتزام قبل المراقبة فؤاد.

4-تضاريس قياسات التشوهات الناجمة عن بودوسومي

  1. عصا الشريطين لتضاعف من جانب شريط لاصق على زجاج قاع طبق بيتري.
    ملاحظة: يجب أن تكون المسافة بين الشريطين أصغر من قطر الشبكة.
  2. فصل الشبكة مطلي بالضامة من الشريط اللاصق بعناية.
  3. تشغيل الشبكة رأسا من أجل الحصول على الخلايا التي يواجهها الزجاج وعصا الشبكة بين الشريطين لاصقة.
  4. إصلاح الشبكة مع اثنين شرائط جديدة من الضعف من جانب لاصق: الشبكة وبالتالي سوف يكون تقع بين الشريطين لاصقة، تاركاً المنطقة الوسطى من الشبكة موجوداً لنصيحة فؤاد.
    ملاحظة: تأكد من أن الشبكة الثابتة جيدا ولا الملتوية؛ ناتئ فؤاد قد لا تكون قادرة على الاقتراب من السطح فورمفار.
  5. ملء طبق بيتري مع 2 مل من قبل ساخنة في 37 درجة مئوية الثقافة المتوسطة (ربمي مع السفح 10 ٪) وتستكمل مع 10 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4).
  6. ضع الطبق الثقافة على سخان طبق 37 درجة مئوية.
  7. تثبيت سخان طبق في مرحلة فؤاد.
  8. السماح للنظام بتحقيق استقرار في 37 درجة مئوية.
  9. في وضع الاتصال مع قوة 0.5 nN، جعل صورة عالمية أولى لتحديد موقع بودوسوميس، ومن ثم مسح طبوغرافية فورمفار عند 3 هرتز مع كسل نانومتر كبيرة حوالي 20.
    ملاحظة: تجنب المسح الضوئي قرب حواف الشبكة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول أعلاه توضح كيفية إعداد الإعداد التجريبية تحديد حجم القوات نتوء تطبقها بودوسوميس بلعم على الركازة فورمفار. وهذا يتحقق باستخدام فؤاد ويتضح في الشكل 1.

عند تحليل صورة طوبوغرافية تضخمات تحت بودوسوميس باستخدام برنامج معالجة البيانات جبك، ينبغي طرح متعدد حدود الدرجة الثالثة صالح من كل سطر التفحص بشكل مستقل. يمكن تقييم ارتفاع الحد الأقصى للمطبات الناجمة عن بودوسومي عن طريق إضافة مقياس لون z على ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خصائص المواد

اختيار المواد للغشاء تشوه، في حالتنا فورمفار، يحتاج إلى الوفاء ببعض المتطلبات. المواد التي يجب أن تكون شفافة للضوء المرئي ويحمل الأسفار السيارات المحدودة للسماح للملاحظات في الميدان مشرق والفحص المجهري الأسفار. خشونة الفيلم رقيقة يجب أن تكون أقل من 10 نانومتر لتجنب أي تأثير الطبوغرافية على التصاق الخلايا والسماح الملاحظة واضحة من نتوءات المستحثة بالخلية بتصوير فؤاد. وأخيراً، تصلب الغشاء، الذي يعتمد على معامل للشباب وسمك المواد، يحتاج إلى أن تكون مرتفعة بما يكفي لل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ممتنون لانا لابيرنادي وغيوم Charrière وباتريك ديلوبيلي على مساهمتها الأولى لهذا العمل سانشيز ماتيو وفيلا فرانسواز لمساعدتهم بتصوير الفيديو وتحريرها. ودعمت هذا العمل تم بالوكالة الوطنية de la البحوث (ANR14-CE11-0020-02)، مؤسسة لبحوث ميديكال (FRM DEQ2016 0334894)، INSERM خطة السرطان وسرطان تولوز مؤسسة وبرنامج العلوم الحدود البشرية (RGP0035/2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
200 شبكة شبكات النيكلعلوم المجهر الإلكترونيG200-Ni
ورق ترشيحSigma-Aldrich1001-055
شرائح مجهرفيشر Scientific10235612
ملصقات بيضاء 26 × 70 ممAveryDP033-100
جهاز صب الفيلم مع صمام في مخرجهعلوم المجهر الإلكتروني71305-01
Razorbladesعلوم المجهر الإلكتروني72000
الإيثانولVWR1.08543.0250
الأسيتونVWR20066.321
محلول Formvar 0.5٪ في علوم المجهر الإلكتروني ثاني كلوريد الإيثيلين15820
غطاء 12 ممVWR631-0666
مجهر مقلوبCarl ZeissAxiovert 200
مجهر القوة الذريةJPK InstrumentsNanoWizard III
حامل عينة يتم التحكم في درجة حرارته JPK InstrumentsBioCell
مع ثابت زنبركي اسمي يبلغ 0.01 نيوتن / مVeeco InstrumentsMLCT-AUHW
PBSGIBCO14190-094
شريط لاصق على الوجهينAPLI AGIPA118100
RPMI 1640Gibco31870-025
FCSSigma-AldrichF7524
HEPES سيجما ألدريتشH0887
أطباق بتري زجاجية ذات قاع زجاجي مقاس 35 ممWPIFD35-100
ناتئ نيتريد السيليكون

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
  5. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  6. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
  7. Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343(2014).
  8. Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
  9. Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
  10. Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
  11. Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
  12. Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
  13. Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
  14. Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
  15. Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
  16. Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
  17. Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
  18. Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
  19. Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
  20. Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
  21. Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
  22. Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
  23. Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
  24. Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
  25. Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protrusion Force MicroscopyAtomic Force MicroscopyFormvar FilmPodosome FormationHuman MacrophagesForce QuantificationCell ProtrusionsSubstrate DeformationMechanical ModelAFM Imaging

Related Articles