Method Article

مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

DOI:

10.3791/57636

⸱

June 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS, 2METi, 3CNRS, LAAS, 4Univ de Toulouse, INSA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن بالتفصيل الأساليب التجريبية المستخدمة لتقييم قوي نتوء بودوسوميس تنطبق على فيلم متوافقة، من إعداد الفيلم للتحليل الآلي للصور الطبوغرافية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العديد من السياقات البيولوجية، تحتاج الخلايا الحيوانية من التفاعل فعلياً مع بيئتها بتطوير القوات الميكانيكية. ومن بين هذه الجر قوات كانت تتسم جيدا، ولكن هناك نقص في التقنيات التي تسمح بقياس بروز قوي تمارسه الخلايا أورثوجونالي إلى هذه الركيزة. لقد قمنا بتصميم إعداد تجريبية لقياس بروز قوي تمارسه الخلايا ملتصقة على هذه الركيزة. خلايا مطلي على ورقة فورمفار متوافقة مع تشوه هذه الركيزة وهو تعيين التضاريس الناتجة عن ذلك بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM) بمقياس نانومتر. ثم يتم استخراج قيم القوة من تحليل الشخصية تشوه استناداً إلى هندسة الهياكل الخلوية بارزة. ومن ثم، يمكن قياس قوي تمارسه الوحدات الفردية بارزة من خلية حية على مر الزمن. وستمكن هذه التقنية دراسة توليد القوة وتنظيمها في العديد من العمليات الخلوية التي تنطوي على نتوء. وهنا يصف لنا تطبيقه لقياس قوي بارزة المتولدة عن بودوسوميس التي شكلتها الضامة البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الحيوانية التفاعل فعلياً مع المصفوفة والخلايا الأخرى التي تشكل هذه البيئة1. وهذا مطلوب بالنسبة لهم ترحيل أو تدخيل الهيئات، والحصول على المعلومات الخارجية أو التفريق. في مثل هذه العمليات، يجب إنشاء الخلية القوات الميكانيكية، وكما أظهرت العديد من الدراسات على مدى السنوات الأخيرة، قدرة خلية لتوليد القوى، والتحقيق في بيئتها يؤثر على سلوكها البيولوجي، على سبيل المثال توجيه الانتشار أو تمايز2،3. بدوره، قياس قوات الخلوية مساعدة كبرى دراسة تنظيم توليد القوة وفهم أثره في الخلايا والأنسجة والسلوك مصير4،5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الشبكات المغلفة فورمفار

  1. تنظيف شبكات الميكروسكوب الإلكتروني مع الأسيتون النقي وتجفيفها على ورق الترشيح. ثم نظيف شريحة مجهر مع الإيثانول النقي، يمسح مع ورقة عدسة وإزالة الغبار مع منفاخ.
  2. مكان على شريحة زجاج تنظيفها الإيثانول عمودياً في القمع لجهاز صب الأفلام التي تتضمن حلاً فورمفار في الجزء السفلي. يغطي الجزء العلوي من القمع.
  3. ضخ 100 مل محلول فورمفار (0.5% في كلوريد الإيثيلين) مع لمبة رذاذ حتى يصل إلى المستوى الثلثين من الشريحة.
  4. ضع الشريحة في الحل لمدة 1 دقيقة.
  5. فتح الصمام الجهاز استنزاف الحل فورمفار في دفق مستمر. معدل تدفق من 10 إلى 15 مل/s سوف تسفر عن فيلم فورمفار من 30-80 نانومتر. يتم تحديد سمك الفيلم بتركيز حل ف....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول أعلاه توضح كيفية إعداد الإعداد التجريبية تحديد حجم القوات نتوء تطبقها بودوسوميس بلعم على الركازة فورمفار. وهذا يتحقق باستخدام فؤاد ويتضح في الشكل 1.

عند تحليل صورة طوبوغرافية تضخمات تحت بودوسوميس باستخدام برنامج معالجة البيانات جبك، ينبغي طرح متعدد حدود الدرجة الثالثة صالح من كل سطر التفحص بشكل مستقل. يمكن تقييم ارتفاع الحد الأقصى للمطبات الناجمة عن بودوسومي عن طريق إضافة مقياس لون z على .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خصائص المواد

اختيار المواد للغشاء تشوه، في حالتنا فورمفار، يحتاج إلى الوفاء ببعض المتطلبات. المواد التي يجب أن تكون شفافة للضوء المرئي ويحمل الأسفار السيارات المحدودة للسماح للملاحظات في الميدان مشرق والفحص المجهري الأسفار. خشونة الفيلم رقيقة يجب أن تكون أقل من 10 نانومتر لتجنب أي تأثير الطبوغرافية على التصاق الخلايا والسماح الملاحظة واضحة من نتوءات المستحثة بالخلية بتصوير فؤاد. وأخيراً، تصلب الغشاء، الذي يعتمد على معامل للشباب وسمك المواد، يحتاج إلى أن تكون مرتفعة بما يكفي لل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ممتنون لانا لابيرنادي وغيوم Charrière وباتريك ديلوبيلي على مساهمتها الأولى لهذا العمل سانشيز ماتيو وفيلا فرانسواز لمساعدتهم بتصوير الفيديو وتحريرها. ودعمت هذا العمل تم بالوكالة الوطنية de la البحوث (ANR14-CE11-0020-02)، مؤسسة لبحوث ميديكال (FRM DEQ2016 0334894)، INSERM خطة السرطان وسرطان تولوز مؤسسة وبرنامج العلوم الحدود البشرية (RGP0035/2016).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
200 شبكة شبكات النيكلعلوم المجهر الإلكترونيG200-Ni
ورق ترشيحSigma-Aldrich1001-055
شرائح مجهرفيشر Scientific10235612
ملصقات بيضاء 26 × 70 ممAveryDP033-100
جهاز صب الفيلم مع صمام في مخرجهعلوم المجهر الإلكتروني71305-01
Razorbladesعلوم المجهر الإلكتروني72000
الإيثانولVWR1.08543.0250
الأسيتونVWR20066.321
محلول Formvar 0.5٪ في علوم المجهر الإلكتروني ثاني كلوريد الإيثيلين15820
غطاء 12 ممVWR631-0666
مجهر مقلوبCarl ZeissAxiovert 200
مجهر القوة الذريةJPK InstrumentsNanoWizard III
حامل عينة يتم التحكم في درجة حرارته JPK InstrumentsBioCell
مع ثابت زنبركي اسمي يبلغ 0.01 نيوتن / مVeeco InstrumentsMLCT-AUHW
PBSGIBCO14190-094
شريط لاصق على الوجهينAPLI AGIPA118100
RPMI 1640Gibco31870-025
FCSSigma-AldrichF7524
HEPES سيجما ألدريتشH0887
أطباق بتري زجاجية ذات قاع زجاجي مقاس 35 ممWPIFD35-100
ناتئ نيتريد السيليكون

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  3. Engler, A. J., Se....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protrusion Force MicroscopyAtomic Force MicroscopyFormvar FilmPodosome FormationHuman MacrophagesForce QuantificationCell ProtrusionsSubstrate DeformationMechanical ModelAFM Imaging

Related Articles