كفاءة توليد من البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1⁺ الخلفي المعي/البنكرياس "موروث" من هبسكس في "الثقافات الالتصاق"

البنكرياس يتكون بشكل رئيسي من خلايا إفرازات والغدد الصماء، وبه خلل أو الزائد يسبب العديد من الأمراض، مثل التهاب البنكرياس ومرض السكري وسرطان البنكرياس. لتوضيح pathogeny بانكريتوباثي، من الضروري تحليل العملية التنموية ووظيفة خلايا البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب على إمدادات مستقرة من خلية مع وجوده لإنشاء خلية/الأنسجة مكملات العلاج. الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-مشتقة من خلايا البنكرياس مصدر خلايا واعدة لهذه الأغراض، والبروتوكول التمايز تجاه خلايا البنكرياس وقد درس مكثف^{1،2،3، 4}. التقدم الذي أحرز مؤخرا في توليد في المختبر من خلايا β البنكرياس تقليد توليد خلايا بيتا في الكبار البشرية، وهذه الخلايا تظهر الفعالية العلاجية على غرس في نموذج السكري الفئران^2،3. وباﻹضافة إلى ذلك، كشف تحليل الخلايا β المتولدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) في صحة جيدة والمانحين المريض السكري نوع 1 لا الاختلافات الوظيفية بما في ذلك عندما تحت الإجهاد⁵. وعلاوة على ذلك، تعمل المرض قد استنسخ جزئيا في خلايا البنكرياس المستحث مع إيبسكس المستمدة من المريض أو هبسكس إيواء الطفرات الوراثية في نفس الموقع كال^6،المرضى⁷.

لإنشاء خلايا البنكرياس من هبسكس، يستخدم التمايز موجها التدرجي الذي يلخص العمليات الإنمائية. البنكرياس مشتق من طبقة الأنسجة للجنين المبكر، التي تعبر عن الجنس تحديد المنطقة Y-مربع 17 (SOX17) وفورخياد مربع A2 (FOXA2)⁸. استناداً إلى الدراسات الماوس، تشكل طبقة اندوديرمال أنبوب القناة الهضمية البدائية، التي تتميز بالتعبير عن تتمثل العوامل النووية 1-بيتا (Hnf1β) وتتمثل العوامل النووية 4-ألفا (Hnf4α). أنبوب القناة الهضمية البدائية الغضروفي ويطور في الجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي، والأجهزة. بعد الإطالة، يصبح منطقة المعي الخلفي منطقة البنكرياس الظني، كما تميزت بالتعبير عن البروتين هوميوبوكس البنكرياس/العفج عامل النسخي 1 (PDX1)^8،،من⁹¹⁰. أجزاء الظهري والبطني PDX1⁺ القناة الهضمية أنبوب رشاقته على شكل براعم البنكرياس، التي تميزت بالتعبير المشترك عن البنكرياس النسخ عامل 1 ألفا فرعية (PTF1A) وهوميوبوكس NK6 1^8،(NKX6.1)¹¹. ويعتبر هذا التعبير بداية المورفولوجية organogenesis البنكرياس. خلايا الأنسجة البنكرياس، ومكونات البراعم البنكرياس، تشكل شبكة أنبوبية متفرعة من هياكل الظهارية¹² وتفرق في نهاية المطاف في إفرازات الغدد الصماء، والخلايا، بما في ذلك الخلايا β إفراز الأنسولين و إفراز الجلوكاجون α-الخلايا. التعبير عن PDX1 الكشف عن أولاً في منطقة البنكرياس الظني، ثم يلاحظ في جميع أنحاء تطوير البنكرياس كاملة، ويظهر التعريب إلى الخلايا β و δ^9،،من¹³¹⁴. على الرغم من Pdx1⁺ يميز منطقة الخلية التي لا تعبر عن Ptf1a أو Nkx6.1 في التجويف المعدة والاثني عشر والقناة الصفراوية اكستراهيباتيك وبعض الخلايا المعوية في منتصف إلى أواخر مرحلة التنمية في الفئران⁹، PDX1⁺ وتعتبر الخلايا المتكفل البنكرياس في مرحلة النمو المبكر في البشر.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين هبسكس في PDX1⁺ الخلايا لتوليد الأنساب البنكرياس. التمايز بتهيئة البروتوكول قبل البذر فصل خلايا مفردة^15،،من¹⁶¹⁷. عموما، يتم الاحتفاظ هبسكس غير متمايزة كمستعمرات أو المجاميع الخلية في التعليق أو في الالتصاق. كنتيجة لذلك، يبدأ معظم البروتوكولات المفاضلة بعد وقت قصير من باساجينج. ومع ذلك، في حالة المستعمرات أو المجاميع، الخلايا المعرضة للتغاير المكانية والنسخي^{18،19،20،،}من²¹²²، التي قد تعرقل خطوة أولى تمايز الأنسجة نهائي متبوعاً بتمايز الكفاءة إلى PDX1⁺ الخلايا. هذا البروتوكول قد يتيح سهولة التعامل لتحسين واستقرار كفاءة تمايز بعض خطوط هبسك التي عثر عليها سابقا التفريق بين كفاءة الأنساب اندوديرمال و PDX1 الخلايا^{+ 23، 24 , 25}.

تجارب باستخدام هبسكس بموافقة لجنة الأخلاقيات لقسم الطب ومدرسة الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو.

1-إعداد المواد

ملاحظة: إعداد جميع وسائل الإعلام والمواد الكاشفة لزراعة الخلايا في بيئة معقمة. الاحماء قاعدة وسائط الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام. المتوسطة للتمايز يتم استخدامه ضمن ح 6 في "تفاصيل الرايت" الكواشف يتم سردها في الجدول للمواد.

1. التمايز (الشكل 1A)
   1. المرحلة المتوسطة 1A: نقل المتوسط RPMI 1640 في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة الملحق خالية من المصل، وأضافت أ، CHIR99021، و Y-27632 بتركيز 1 x و 100 نانوغرام/مليلتر، 3 ميكرومتر و 10 ميكرومترات، على التوالي.
   2. المرحلة المتوسطة 1B: نقل المتوسط RPMI 1640 في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة ملحق خالية من المصل، أضافت A و CHIR99021 إلى تركيز 1 x، 100 نانوغرام/ملليلتر، ميكرو دي وان، على التوالي.
      ملاحظة: يجب أن يكون تركيز CHIR99021 أقل منه في المرحلة المتوسطة 1A، وإضافة ليس ضروريا، ولكن لأنه يزيد عدد الخلايا.
   3. 2 المرحلة المتوسطة: المتوسطة MEM تحسين نقل (إيميم) في أنبوب ماصة استخدام. إضافة الملحق خالية من مصل الدم وعامل النمو keratinocyte (KGF) بتركيز 0.5 x و 50 نانوغرام/مل، على التوالي.
   4. المتوسطة المرحلة 3: نقل iMEM المتوسطة في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة ملحق خالية من المصل، KGF، رأس، 3-Keto-N-أمينو إيثايل-N'سيكلوباميني-أمينوكابرويلديهيدروسينامويل (CYC) وحمض 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (تنبب) الماصة إلى تركيزات 0.5 x, 50 نانوغرام/مل, 100 نانوغرام/مل, 0.5 ميكرومتر و 10 نانومتر، على التوالي.
2. التدفق الخلوي (FCM)
   1. 1 x بيرميبيليزيشن/يغسل المخزن المؤقت: نقل المياه في أنبوب ماصة. إضافة المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن/يغسل ماصة إلى تركز 1 x.
   2. FCM عرقلة الحل: نقل 1 x بيرميبيليزيشن/يغسل المخزن المؤقت في أنبوب ماصة. إضافة المصل حمار ماصة لتركيز 2% (المجلد/المجلد).
3. إيمونوستينينج
   1. عرقلة الحل: فوسفاتيبوفيريد المالحة (دببس نقل دولبيكو) في أنبوب من ماصة. إضافة المصل حمار و "تريتون العاشر" ماصة لتركيزات من 5% (المجلد/المجلد) و 0.4% (المجلد/المجلد)، على التوالي.

2-هبسك التمايز إلى "فروعه" خلايا/البنكرياس المعي الخلفي (PDX1 الخلايا⁺ )

ملاحظة: القيام بكافة الإجراءات باستخدام تقنيات عقيمة. هبسكس تمسك جيدا 6 لوحات مطلية بمادة سطحية اصطناعية هبسكس مع هبسك الصيانة المتوسطة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة^17،26. عندما تصل إلى الخلايا استخدامها 50-80% كونفلوينسي (المرحلة 0) للتمايز.

1. إعداد الغشاء لوحات المغلفة بالمصفوفة.
   1. نقل 6 مل RPMI 1640 (4 درجةمئوية) في أنبوب تبريد إلى 4 درجةمئوية على الجليد. إضافة 2 مغ من الغشاء مصفوفة (4 درجةمئوية) مع نصائح مل-ماصة 1 تبريد ومزيج جيد من قبل بيبيتينج لطيف لجعل مصفوفة الغشاء 0.33 ملغ/مل.
   2. نقل 2 مل مصفوفة الغشاء المخفف لكل بئر من لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا ماصة. وضع اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 60-90 دقيقة في حاضنة. بعد ذلك، تبقى اللوحات في الرايت حتى الاستخدام (ضمن ح 3).
2. البذور هبسكس والشروع في المفاضلة للأنسجة قاطع (المرحلة 1 ألف).
   1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل حمض الإيثيلين 0.5 مم (يدتا) (RT) الواحدة وكذلك بواسطة ماصة لغسل هبسكس مثقف في لوحات 6-جيدا.
   2. نضح 0.5 مم يدتا وإضافة 2 مل من 0.5 مم يدتا الواحدة وكذلك بواسطة ماصة. احتضان اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 5 دقائق.
   3. نضح 0.5 مم يدتا وإضافة 1 مل من هبسك الصيانة المتوسطة في الرايت تستكمل مع 10 ميكرومترات Y-27632 الواحدة وكذلك ماصة. "الماصة؛" بلطف ولكن بسرعة لتفجير تعلق الخلايا على اللوحات وأن تنأى تحبب خفيف الخلايا إلى الخلايا المفردة. لا فقاعة تعليق الخلية أثناء بيبيتينج.
   4. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 50 مل تحتوي على 4 مل من هبسك الصيانة المتوسطة في الرايت تستكمل مع 10 ميكرو Y-27632. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية.
   5. حساب عدد الخلايا في تعليق خلية استخدام الإجراء استبعاد وصمة عار تريبان الأزرق.
      1. ميكس 15 ميكروليتر من تعليق خلية و 15 ميكروليتر تريبان الأزرق في أنبوب.
      2. نقل 10 ميكروليتر من تعليق خلية المخفف تريبان الأزرق على الخلية الشرائح في تكرار العد ماصة 10 ميكروليتر.
      3. عد الخلية رقم عداد خلية تلقائياً وحساب كثافة الخلية في تعليق خلية. البقاء عادة > 98 ٪.
   6. قاسمة تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 50 مل 1-1.5 × 10⁶ خلايا كل بئر 6-جيدا لوحات (1-1.5 × 10⁵ خلايا/سم²).
   7. الطرد المركزي في أنبوب 50 مل في 200 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
   8. نضح المادة طافية باستخدام ماصة وريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من المرحلة المتوسطة 1A (RT) كل بئر. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية وإضافة 1 مل آخر للمرحلة المتوسطة 1A (مجموع 2 مل كل بئر).
   9. نضح المصفوفة الغشاء المخفف في آبار لوحات ثقافة الخلية أعده ماصة ميكروليتر 1,000 في خطوة 2.1.2. المضي قدما إلى الخطوة التالية مباشرة.
   10. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية في الخطوة 2.2.8 مرة أخرى. فورا بعد الاختلاط، نقل تعليق خلية (2 مل) في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. وتغطي اللوحة برقائق ألومنيوم حماية اللوحة من الضوء. ضع اللوحة في مقاعد البدلاء نظيفة في RT لمدة 10-15 دقيقة.
       ملاحظة: لا تقم بتحريك اللوحة بعد البذر.
   11. بلطف ضع اللوحة إلى 37 درجةمئوية، 5% CO₂ حاضنة (جو هوميديفيد) والثقافة من أجل ح 24.
       ملاحظة: لا تهز اللوحة بعد البذر.
3. الحث على التفرقة في الأنسجة نهائي (المرحلة 1B).
   1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى الآبار بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
      ملاحظة: لإزالة أي خلايا ميتة من أحادي الطبقة، هزة بلطف اللوحة أمام كل طموح.
   2. نضح دببس المستخدمة قبل ماصة وإضافة 4 مل من المرحلة المتوسطة 1B (37 درجةمئوية) في البئر. بلطف ضع اللوحة في حاضنة 37 درجةمئوية (الغلاف الجوي هوميديفيد من 5% CO₂) والثقافة من أجل ح 48.
   3. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
      ملاحظة: إزالة الخلايا الميتة من أحادي الطبقة التي تهز لطيف قبل كل طموح.
   4. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من المرحلة المتوسطة 1B (37 درجةمئوية) في البئر. بلطف ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO₂) والثقافة من أجل ح 24.
4. الحث على التفرقة في أنبوب القناة الهضمية البدائية (المرحلة 2).
   1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة.
      ملاحظة: إزالة الخلايا الميتة من أحادي الطبقة التي تهز لطيف قبل كل طموح.
   2. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من 2 المرحلة المتوسطة (37 درجةمئوية) في البئر. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO₂) والثقافة لمدة 4 أيام.
5. الحث على التفرقة في PDX1⁺ الخلايا (المرحلة 3).
   1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
   2. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من 3 المرحلة المتوسطة (37 درجةمئوية) في البئر. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO₂) والثقافة لمدة 3 أيام.
6. الحث التمايز إلى خلايا الغدد الصماء في البنكرياس.
   1. أداء NKX6.1⁺ خلية التعريفي (المرحلة 4، لمدة 8 أيام) متبوعاً بتحريض خلايا الغدد الصماء (المرحلة 5، لمدة 12 يوما) مع بروتوكولات تم وصفه مسبقاً^3،،من¹⁶²⁶. تميز والتحقق من صحة التفريق بين خلايا الغدد الصماء إيمونوستينينج والكمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحليل.
      ملاحظة: الرجوع إلى تويودا et al.¹⁶ و كيمورا وآخرون²⁶ لإجراءات تجريبية مفصلة. يشير الجدول 1 لمتواليات التمهيدي المستخدمة لتحليل PCR قرة.

3-التدفق الخلوي (FCM)

1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل من 0.5 مم أدتا إلى البئر بواسطة ماصة. كرر بالطموح وإضافة 0.5 مم يدتا مرة واحدة.
   ملاحظة: هز اللوحة برفق لإزالة أي خلايا ميتة من الخلايا أحادي الطبقة قبل كل طموح.
2. لفصل الخلايا (حوالي 3-6 × 10⁶ خلايا كل بئر)، وإضافة 2 مل من 0.25% التربسين التي تحتوي على 0.5 مم يدتا كل بئر. احتضان اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 5-10 دقائق.
3. "الماصة؛" بلطف ولكن بسرعة فصل الخلايا تحبب خفيف إلى الخلايا المفردة. لا فقاعة تعليق الخلية أثناء بيبيتينج.
4. إضافة 8-10 مل من قاعدة المتوسطة (RPMI 1640 أو إيميم، RT) تحتوي على 0.5 x الملحق خالية من المصل و 10 ميكرومترات Y-27632 كل جيدا وتخلط بتعليق خلية. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي.
5. الطرد المركزي الأنبوب في 300 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
6. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 2 مل من 0.5 مم يدتا (RT). بلطف "الماصة؛" تعليق خلية.
7. الطرد المركزي الأنبوب في 300 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
8. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت للتثبيت و permeabilization الواحدة 10⁶ خلايا تحت غطاء محرك السيارة. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية تحت غطاء محرك السيارة. إبقاء الأنبوب في RT لمدة 30 دقيقة.
9. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لمدة 5 دقائق.
10. نضح المادة طافية تحت غطاء محرك السيارة وريسوسبيند الخلايا مع 500 ميكروليتر FCM عرقلة الحل الواحدة 10⁶ خلايا. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية. إبقاء الأنبوب في RT لمدة 30 دقيقة.
11. نقل 50 ميكروليتر من تعليق خلية لأنبوب (حوالي 1 × 10⁵ الخلايا). الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من جسم الابتدائي المخفف (انظر الجدول للمواد) في FCM عرقلة الحل واحتضان في 4 °C > ح 16.
12. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
13. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من جسم الثانوي المخفف (انظر الجدول للمواد) في FCM عرقلة الحل. الخلايا RT لمدة 60 دقيقة أو 4 °C لاحتضان > ح 16 مع الحماية من الضوء.
14. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
15. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 من المصل حمار 2% في دببس.
16. تصفية تعليق الخلية بنقل على مل 5 جولة الأنبوبة البوليستيرين أسفل الخلية مصفاة (35 قطار النايلون ميكرون) والحفاظ على 4 درجةمئوية مع حماية من الضوء حتى التحليل.
17. تحليل نسبة خلايا إيجابية ملطخة ب تدفق سيتوميتير²⁷.

4-إيمونوستينينج

1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
   ملاحظة: بلطف يهز لوحة لإزالة أي خلايا ميتة من الخلايا أحادي الطبقة قبل كل طموح.
2. إضافة 2 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) (4 درجةمئوية) كل بئر ماصة تحت غطاء محرك السيارة. احتفظ باللوحة عند 4 درجةمئوية لمدة 20 دقيقة.
3. إزالة منهاج عمل بيجين ماصة تحت غطاء محرك السيارة. إضافة 2 مل دببس في الرايت إلى البئر ماصة تحت غطاء محرك السيارة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
4. إضافة 2 مل من محلول حظر كل بئر وإبقاء اللوحة على RT لمدة 30 دقيقة.
5. نضح الحل المستخدمة وإضافة 1 مل جسم الأولية (انظر الجدول للمواد) في عرقلة الحل كل بئر. احتضان RT لمدة 60 دقيقة أو 4 °C > ح 16.
6. نضح الحل المستخدمة، إضافة 2 مل دببس التي تحتوي على 0.4% X-100 تريتون واحتضان في RT لأدنى 10 تكرار التطلع، بالإضافة للحل والحضانة مرة واحدة.
7. نضح الحل المستخدمة وإضافة 1 مل جسم الثانوية (انظر الجدول للمواد) في عرقلة الحل كل بئر. تبني على RT لمدة 60 دقيقة مع الحماية من الضوء.
8. نضح الحل المستخدمة، إضافة 2 مل دببس التي تحتوي على 0.4% Triton X-100 (RT) واحتضان في RT لمدة 5 دقائق مع الحماية من الضوء. كرر التطلع، بالإضافة للحل والحضانة مرتين.
9. أن ميكروجرافس لدراسة كفاءة التمايز تحت مجهر الأسفار²⁸.

نشر هيبسكس (585A1،من2930) يتم تكثيفه وتشكيل المونولاير متجانسة (الشكل 1B) التي مناسبة للتمايز. هيبسكس غير متمايز (المرحلة 0) نات، وإعادة المصنف كخلايا مفردة في الخلية منخفضة الكثافة (1-1.5 × 105 خلايا/سم2). ضمن ح 1، مرفقة باللوحة الخلايا وتبدأ في إظهار نتوء. في يوم 1، تكاثرت الخلايا وتوزيع جيد لتغطية 80-90% مساحة السطح. أثناء المرحلة 1B، تظهر وسائل الإعلام غائم بسبب الخلايا الميتة. إزالة الخلايا الميتة بالغة الأهمية للتمايز ذات كفاءة عالية حيث الخلايا الميتة يحتمل تخل بالبقاء على قيد الحياة والتمايز للخلايا الواقعة تحت. في أيام 3-4، تشكيل خلايا ورقة عمل أحادي الطبقة متجانسة يمكن وصفه بأنه مظهر حصاة كبيرة. عند هذه النقطة، معظم الخلايا تتوقف عن التعبير عن الجنس تحديد المنطقة Y-المربع 2 (SOX2)، علامة للحصول على خلايا غير متمايزة، وبدلاً من ذلك التعبير عن علامة نهائي الأنسجة، SOX17، في أكثر من 90% (الشكل 2 أ و ب). SOX17 معظم الخلايا+ FOXA2 إكسبرس (الشكل 2A). بدءاً من التفريق بين تنازلات كثافة خلية غير مناسب كفاءة التمايز في هذه الخطوة (الشكل 3). في المراحل 2 و 3، يرتاح موت الخلية، والمتوسطة المستخدمة ليست غائم، كما الحال في المرحلة 1B. خلايا التعبير عن علامات أنبوب القناة الهضمية البدائية HNF1β و HNF4α (الشكل 2)، وفي النهاية أعرب عن علامة السلف المعي الخلفي/البنكرياس، PDX1، في أكثر من 90% (الشكل 2D و ه). PDX1+ خلية التعريفي استنساخه في آخر سطر هيبسك، 1231A3 31وخط هيسك، خس-3 32 (الشكل 4). نتائج qRT PCR التعبير مرناً من علامات المرحلة كانت متسقة مع إيمونوستينينج (الشكل 5A). التعبير مرناً من PDX1 واضح في المرحلة 3، وتزيد كثيرا من الحجية.

PDX1+ الخلايا في مراحل النمو المبكر لديها القدرة على التفريق في خلايا البنكرياس فقط لا بل أيضا المعدة التجويف الإثني عشر والقناة الصفراوية اكستراهيباتيك وجزء من الأمعاء 9. ولدت إمكانيات التمايز في المختبر PDX1+ يمكن تقييم الخلايا إلى خلايا البنكرياس بثقافة موسعة مع البروتوكولات المبلغ عنها للأنسجة البنكرياس وخلايا الغدد الصماء في البنكرياس163،، 26-التعبير عن علامة الأنسجة البنكرياس، NKX6.1، وعلامات الغدد الصماء البنكرياس الأنسولين، و الجلوكاجون، لوحظت في أيام 19 (المرحلة 4) و 31 (المرحلة 5)، على التوالي (الشكل 5).

رقم 1: الممثل مظهر الخلايا تحت التمايز التدرجي. (أ) بمخطط التمايز الموجهة من هبسكس إلى الأنساب البنكرياس. تشير الأرقام بين قوسين إلى تركيزات (تتم كتابة وحدات أدناه). (ب) مجال مشرق الممثل ميكروجرافس من هيبسكس في الخطوات الرئيسية لثقافة التفريق. هيبسكس 585A1 نات كالخلايا المفردة والتي يسببها لتفرق في الأنسجة نهائي وأنبوب القناة الهضمية البدائية والسلف المعي الخلفي/البنكرياس. لوحات أقل الموسع آراء الأفرقة علوية. ربمي، ربمي 1640؛ AA، أضافت (نانوغرام/مل)؛ الفصل، CHIR99021 (ميكرومتر)؛ KGF (نانوغرام/مل)؛ وتد، رأس (نانوغرام/مل)؛ الفتوة، سيكلوباميني 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl (ميكرومتر)؛ تنبب، حمض 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (نيو مكسيكو). تغيير حجم أشرطة = 300 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: توجيه الممثل نحو الأنساب البنكرياس من هيبسكس. (أ) نسبة SOX2–SOX17+ الخلايا التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي قبل التمايز (المرحلة 0)، وفي يوم 4 (المرحلة 1B). متمايز هيبسكس (SOX2+SOX17–) كانت متباينة في الأنسجة نهائي (SOX2–SOX17+). SOX17 معظم الخلايا+ FOXA2 أعرب عن المشاركة. (ب) ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت الممثل في يوم 4 (المرحلة 1B). كانت الملون الخلايا الثابتة SOX17 (الأخضر)، SOX2 (أحمر)، ونوى (أزرق). (ج) ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت ممثل في أيام 4 (المرحلة 1B) و 8 (المرحلة 2). الخلايا الثابتة كانت الملون (الأخضر) HNF1β، HNF4α (أحمر) ونوى (أزرق). (د) نسبة الخلايا إيجابية بالنسبة PDX1، كما حللت بالتدفق الخلوي في أيام 4 (المرحلة 1B) و 11 (المرحلة 3). (ه) ممثل ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت PDX1 (الأخضر) ونوى (الأزرق) يوم 11 (المرحلة 3). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: تحريض الممثل نحو نهائي الأنسجة بدأت من خلية مختلفة الكثافات. (أ) الممثل الميداني مشرق ميكروجرافس ح 1 بعد تمايز الخلايا. هيبسكس نات كالخلايا المفردة والتي يسببها لتفرق في الأنسجة نهائي في خلية مختلفة الكثافة (1 × 104/cm2-50). لوحات أقل الموسع آراء الأفرقة علوية. (ب) نسبة SOX2–SOX17+ الخلايا التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي قبل التمايز (المرحلة 0)، وفي يوم 4 (المرحلة 1B). (ج) نسبة PDX1+ الخلايا التي تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي في أيام 8 (المرحلة 2) و 11 (المرحلة 3). تغيير حجم أشرطة = 300 ميكرومتر.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: تحريض الممثل نحو PDX1+ الخلايا في هيبكس وهيسكس. خط هيبسك، 1231A3 (A)، وبند هيس، قيس-3 (ب)، كانت متباينة للأنسجة قاطع و PDX1+ الخلايا. وقد تم تحليل تكوين خلية بالتدفق الخلوي. نسبة SOX2–SOX17+ وقد تم تحليل الخلايا قبل التمايز (المرحلة 0)، وفي يوم 4 (المرحلة 1B). نسبة PDX1+ وقد تم تحليل الخلايا في أيام 8 (المرحلة 2) و 11 (المرحلة 3).  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: تحريض الممثل نحو الأنسجة البنكرياس وخلايا الغدد الصماء. وقد ميزت هيبسكس (585A1) في PDX1+ الخلايا. كذلك كانت متباينة الخلايا في الأنسجة البنكرياس وخلايا الغدد الصماء البنكرياس مع البروتوكولات ذكرت3،،من1626. (أ) مرناً التعبير عن علامات المرحلة كانت تقاس بالكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR). البيانات تم تطبيع للتعبير جابده وقدم الحظيرة--التغيير في التعبير الجيني بالنسبة لقيمة الذروة. لاحظ أن التعبير PDX1 زيد في > برنامج من أيام 8 (المرحلة 2) 11 (المرحلة 3) وفي > 100-fold من أيام 11 (المرحلة 3) و 19 (المرحلة 4). ويرد التعبير في البنكرياس البشري الكبار ك Panc. SOX2، أسود؛ SOX17، أرجواني؛ Β HNF1، البنى؛ HNF4α، البرتقال؛ PDX1، الضوء الأخضر؛ NKX6.1، أخضر؛ الأنسولين، الأزرق؛ الجلوكاجون، الأحمر. (ب) ميكروجرافس إيممونوفلوريسسينت ممثل علامة الأنسجة البنكرياس، NKX6.1 (أحمر)، في أيام 11 (المرحلة 3) و 19 (المرحلة 4). PDX1 (الأخضر) ونوى (أزرق) قد شاركت الملون. (ج) ميكروجرافس إيمونوفلوريسسينت ممثل لصانعي الغدد الصماء البنكرياس الأنسولين (الوظائف الخضراء) والجلوكاجون (فريق التنسيق العالمي، الأحمر)، في أيام 19 (المرحلة 4) و 31 (المرحلة 5). نوى (أزرق) قد شارك الملون.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: كبسولة تفجير ل qPCR.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.