مقالة منهجية

كفاءة توليد من البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ الخلفي المعي/البنكرياس "موروث" من هبسكس في "الثقافات الالتصاق"

5.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

مارس 27, 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) في البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ (PDX1+) الخلايا لتوليد الأنساب البنكرياس استناداً إلى النمو غير مستعمرة نوع أحادي الطبقة فصل الخلايا المفردة. هذا الأسلوب مناسبة لإنتاج الخلايا المستمدة من هبسك متجانسة، والتلاعب بالجينات والفرز.

الملخص

الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-مشتقة من خلايا البنكرياس مصدر خلية واعدة للطب التجديدي، ومنبرا لدراسة العمليات الإنمائية البشرية. Stepwise توجيه التمايز الذي يلخص العمليات الإنمائية واحدة من الطرق الرئيسية لتوليد خلايا البنكرياس بما في ذلك البنكرياس/العفج هوميوبوكس البروتين 1+ (PDX1+) خلايا البنكرياس السلف. بدء البروتوكولات التقليدية التمايز مع المستعمرات الصغيرة بعد المرور وقت قصير. ومع ذلك، في الدولة للمستعمرات أو المجاميع، الخلايا المعرضة للتغاير، التي قد تعوق التفرقة إلى PDX1+ الخلايا. نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين هبسكس في PDX1+ الخلايا. ويتكون من أربع خطوات البروتوكول ويبدأ التمايز ببذر خلايا مفردة معزولة. تحريض SOX17+ وأعقب خلايا الأنسجة نهائي التعبير عن علامات أنبوب القناة الهضمية البدائية اثنين و HNF1β و HNF4α، والتمايز في نهاية المطاف إلى PDX1+ الخلايا. هذا البروتوكول يوفر سهولة التعامل وقد تحسين واستقرار كفاءة تمايز بعض خطوط هبسك التي عثر عليها سابقا التفريق بين طريقة غير فعالة في الأنساب اندوديرمال أو PDX1+ الخلايا.

المقدمة

البنكرياس يتكون بشكل رئيسي من خلايا إفرازات والغدد الصماء، وبه خلل أو الزائد يسبب العديد من الأمراض، مثل التهاب البنكرياس ومرض السكري وسرطان البنكرياس. لتوضيح pathogeny بانكريتوباثي، من الضروري تحليل العملية التنموية ووظيفة خلايا البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب على إمدادات مستقرة من خلية مع وجوده لإنشاء خلية/الأنسجة مكملات العلاج. الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-مشتقة من خلايا البنكرياس مصدر خلايا واعدة لهذه الأغراض، والبروتوكول التمايز تجاه خلايا البنكرياس وقد درس مكثف1،2،3، 4. التقدم الذي أحرز مؤخرا في توليد في المختبر من خلايا β البنكرياس تقليد توليد خلايا بيتا في الكبار البشرية، وهذه الخلايا تظهر الفعالية العلاجية على غرس في نموذج السكري الفئران2،3. وباﻹضافة إلى ذلك، كشف تحليل الخلايا β المتولدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) في صحة جيدة والمانحين المريض السكري نوع 1 لا الاختلافات الوظيفية بما في ذلك عندما تحت الإجهاد5. وعلاوة على ذلك، تعمل المرض قد استنسخ جزئيا في خلايا البنكرياس المستحث مع إيبسكس المستمدة من المريض أو هبسكس إيواء الطفرات الوراثية في نفس الموقع كال6،المرضى7.

لإنشاء خلايا البنكرياس من هبسكس، يستخدم التمايز موجها التدرجي الذي يلخص العمليات الإنمائية. البنكرياس مشتق من طبقة الأنسجة للجنين المبكر، التي تعبر عن الجنس تحديد المنطقة Y-مربع 17 (SOX17) وفورخياد مربع A2 (FOXA2)8. استناداً إلى الدراسات الماوس، تشكل طبقة اندوديرمال أنبوب القناة الهضمية البدائية، التي تتميز بالتعبير عن تتمثل العوامل النووية 1-بيتا (Hnf1β) وتتمثل العوامل النووية 4-ألفا (Hnf4α). أنبوب القناة الهضمية البدائية الغضروفي ويطور في الجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي، والأجهزة. بعد الإطالة، يصبح منطقة المعي الخلفي منطقة البنكرياس الظني، كما تميزت بالتعبير عن البروتين هوميوبوكس البنكرياس/العفج عامل النسخي 1 (PDX1)8،،من910. أجزاء الظهري والبطني PDX1+ القناة الهضمية أنبوب رشاقته على شكل براعم البنكرياس، التي تميزت بالتعبير المشترك عن البنكرياس النسخ عامل 1 ألفا فرعية (PTF1A) وهوميوبوكس NK6 18،(NKX6.1)11. ويعتبر هذا التعبير بداية المورفولوجية organogenesis البنكرياس. خلايا الأنسجة البنكرياس، ومكونات البراعم البنكرياس، تشكل شبكة أنبوبية متفرعة من هياكل الظهارية12 وتفرق في نهاية المطاف في إفرازات الغدد الصماء، والخلايا، بما في ذلك الخلايا β إفراز الأنسولين و إفراز الجلوكاجون α-الخلايا. التعبير عن PDX1 الكشف عن أولاً في منطقة البنكرياس الظني، ثم يلاحظ في جميع أنحاء تطوير البنكرياس كاملة، ويظهر التعريب إلى الخلايا β و δ9،،من1314. على الرغم من Pdx1+ يميز منطقة الخلية التي لا تعبر عن Ptf1a أو Nkx6.1 في التجويف المعدة والاثني عشر والقناة الصفراوية اكستراهيباتيك وبعض الخلايا المعوية في منتصف إلى أواخر مرحلة التنمية في الفئران9، PDX1+ وتعتبر الخلايا المتكفل البنكرياس في مرحلة النمو المبكر في البشر.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتفريق بين هبسكس في PDX1+ الخلايا لتوليد الأنساب البنكرياس. التمايز بتهيئة البروتوكول قبل البذر فصل خلايا مفردة15،،من1617. عموما، يتم الاحتفاظ هبسكس غير متمايزة كمستعمرات أو المجاميع الخلية في التعليق أو في الالتصاق. كنتيجة لذلك، يبدأ معظم البروتوكولات المفاضلة بعد وقت قصير من باساجينج. ومع ذلك، في حالة المستعمرات أو المجاميع، الخلايا المعرضة للتغاير المكانية والنسخي18،19،20،،من2122، التي قد تعرقل خطوة أولى تمايز الأنسجة نهائي متبوعاً بتمايز الكفاءة إلى PDX1+ الخلايا. هذا البروتوكول قد يتيح سهولة التعامل لتحسين واستقرار كفاءة تمايز بعض خطوط هبسك التي عثر عليها سابقا التفريق بين كفاءة الأنساب اندوديرمال و PDX1 الخلايا+ 23، 24 , 25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تجارب باستخدام هبسكس بموافقة لجنة الأخلاقيات لقسم الطب ومدرسة الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو.

1-إعداد المواد

ملاحظة: إعداد جميع وسائل الإعلام والمواد الكاشفة لزراعة الخلايا في بيئة معقمة. الاحماء قاعدة وسائط الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام. المتوسطة للتمايز يتم استخدامه ضمن ح 6 في "تفاصيل الرايت" الكواشف يتم سردها في الجدول للمواد.

  1. التمايز (الشكل 1A)
    1. المرحلة المتوسطة 1A: نقل المتوسط RPMI 1640 في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة الملحق خالية من المصل، وأضافت أ، CHIR99021، و Y-27632 بتركيز 1 x و 100 نانوغرام/مليلتر، 3 ميكرومتر و 10 ميكرومترات، على التوالي.
    2. المرحلة المتوسطة 1B: نقل المتوسط RPMI 1640 في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة ملحق خالية من المصل، أضافت A و CHIR99021 إلى تركيز 1 x، 100 نانوغرام/ملليلتر، ميكرو دي وان، على التوالي.
      ملاحظة: يجب أن يكون تركيز CHIR99021 أقل منه في المرحلة المتوسطة 1A، وإضافة ليس ضروريا، ولكن لأنه يزيد عدد الخلايا.
    3. 2 المرحلة المتوسطة: المتوسطة MEM تحسين نقل (إيميم) في أنبوب ماصة استخدام. إضافة الملحق خالية من مصل الدم وعامل النمو keratinocyte (KGF) بتركيز 0.5 x و 50 نانوغرام/مل، على التوالي.
    4. المتوسطة المرحلة 3: نقل iMEM المتوسطة في أنبوب باستخدام ماصة. إضافة ملحق خالية من المصل، KGF، رأس، 3-Keto-N-أمينو إيثايل-N'سيكلوباميني-أمينوكابرويلديهيدروسينامويل (CYC) وحمض 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (تنبب) الماصة إلى تركيزات 0.5 x, 50 نانوغرام/مل, 100 نانوغرام/مل, 0.5 ميكرومتر و 10 نانومتر، على التوالي.
  2. التدفق الخلوي (FCM)
    1. 1 x بيرميبيليزيشن/يغسل المخزن المؤقت: نقل المياه في أنبوب ماصة. إضافة المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن/يغسل ماصة إلى تركز 1 x.
    2. FCM عرقلة الحل: نقل 1 x بيرميبيليزيشن/يغسل المخزن المؤقت في أنبوب ماصة. إضافة المصل حمار ماصة لتركيز 2% (المجلد/المجلد).
  3. إيمونوستينينج
    1. عرقلة الحل: فوسفاتيبوفيريد المالحة (دببس نقل دولبيكو) في أنبوب من ماصة. إضافة المصل حمار و "تريتون العاشر" ماصة لتركيزات من 5% (المجلد/المجلد) و 0.4% (المجلد/المجلد)، على التوالي.

2-هبسك التمايز إلى "فروعه" خلايا/البنكرياس المعي الخلفي (PDX1 الخلايا+ )

ملاحظة: القيام بكافة الإجراءات باستخدام تقنيات عقيمة. هبسكس تمسك جيدا 6 لوحات مطلية بمادة سطحية اصطناعية هبسكس مع هبسك الصيانة المتوسطة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة17،26. عندما تصل إلى الخلايا استخدامها 50-80% كونفلوينسي (المرحلة 0) للتمايز.

  1. إعداد الغشاء لوحات المغلفة بالمصفوفة.
    1. نقل 6 مل RPMI 1640 (4 درجةمئوية) في أنبوب تبريد إلى 4 درجةمئوية على الجليد. إضافة 2 مغ من الغشاء مصفوفة (4 درجةمئوية) مع نصائح مل-ماصة 1 تبريد ومزيج جيد من قبل بيبيتينج لطيف لجعل مصفوفة الغشاء 0.33 ملغ/مل.
    2. نقل 2 مل مصفوفة الغشاء المخفف لكل بئر من لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا ماصة. وضع اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 60-90 دقيقة في حاضنة. بعد ذلك، تبقى اللوحات في الرايت حتى الاستخدام (ضمن ح 3).
  2. البذور هبسكس والشروع في المفاضلة للأنسجة قاطع (المرحلة 1 ألف).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل حمض الإيثيلين 0.5 مم (يدتا) (RT) الواحدة وكذلك بواسطة ماصة لغسل هبسكس مثقف في لوحات 6-جيدا.
    2. نضح 0.5 مم يدتا وإضافة 2 مل من 0.5 مم يدتا الواحدة وكذلك بواسطة ماصة. احتضان اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 5 دقائق.
    3. نضح 0.5 مم يدتا وإضافة 1 مل من هبسك الصيانة المتوسطة في الرايت تستكمل مع 10 ميكرومترات Y-27632 الواحدة وكذلك ماصة. "الماصة؛" بلطف ولكن بسرعة لتفجير تعلق الخلايا على اللوحات وأن تنأى تحبب خفيف الخلايا إلى الخلايا المفردة. لا فقاعة تعليق الخلية أثناء بيبيتينج.
    4. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 50 مل تحتوي على 4 مل من هبسك الصيانة المتوسطة في الرايت تستكمل مع 10 ميكرو Y-27632. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية.
    5. حساب عدد الخلايا في تعليق خلية استخدام الإجراء استبعاد وصمة عار تريبان الأزرق.
      1. ميكس 15 ميكروليتر من تعليق خلية و 15 ميكروليتر تريبان الأزرق في أنبوب.
      2. نقل 10 ميكروليتر من تعليق خلية المخفف تريبان الأزرق على الخلية الشرائح في تكرار العد ماصة 10 ميكروليتر.
      3. عد الخلية رقم عداد خلية تلقائياً وحساب كثافة الخلية في تعليق خلية. البقاء عادة > 98 ٪.
    6. قاسمة تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي 50 مل 1-1.5 × 106 خلايا كل بئر 6-جيدا لوحات (1-1.5 × 105 خلايا/سم2).
    7. الطرد المركزي في أنبوب 50 مل في 200 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
    8. نضح المادة طافية باستخدام ماصة وريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من المرحلة المتوسطة 1A (RT) كل بئر. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية وإضافة 1 مل آخر للمرحلة المتوسطة 1A (مجموع 2 مل كل بئر).
    9. نضح المصفوفة الغشاء المخفف في آبار لوحات ثقافة الخلية أعده ماصة ميكروليتر 1,000 في خطوة 2.1.2. المضي قدما إلى الخطوة التالية مباشرة.
    10. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية في الخطوة 2.2.8 مرة أخرى. فورا بعد الاختلاط، نقل تعليق خلية (2 مل) في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. وتغطي اللوحة برقائق ألومنيوم حماية اللوحة من الضوء. ضع اللوحة في مقاعد البدلاء نظيفة في RT لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: لا تقم بتحريك اللوحة بعد البذر.
    11. بلطف ضع اللوحة إلى 37 درجةمئوية، 5% CO2 حاضنة (جو هوميديفيد) والثقافة من أجل ح 24.
      ملاحظة: لا تهز اللوحة بعد البذر.
  3. الحث على التفرقة في الأنسجة نهائي (المرحلة 1B).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى الآبار بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
      ملاحظة: لإزالة أي خلايا ميتة من أحادي الطبقة، هزة بلطف اللوحة أمام كل طموح.
    2. نضح دببس المستخدمة قبل ماصة وإضافة 4 مل من المرحلة المتوسطة 1B (37 درجةمئوية) في البئر. بلطف ضع اللوحة في حاضنة 37 درجةمئوية (الغلاف الجوي هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة من أجل ح 48.
    3. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
      ملاحظة: إزالة الخلايا الميتة من أحادي الطبقة التي تهز لطيف قبل كل طموح.
    4. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من المرحلة المتوسطة 1B (37 درجةمئوية) في البئر. بلطف ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة من أجل ح 24.
  4. الحث على التفرقة في أنبوب القناة الهضمية البدائية (المرحلة 2).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة.
      ملاحظة: إزالة الخلايا الميتة من أحادي الطبقة التي تهز لطيف قبل كل طموح.
    2. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من 2 المرحلة المتوسطة (37 درجةمئوية) في البئر. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة لمدة 4 أيام.
  5. الحث على التفرقة في PDX1+ الخلايا (المرحلة 3).
    1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
    2. نضح دببس المستخدمة واسطة ماصة، وإضافة 4 مل من 3 المرحلة المتوسطة (37 درجةمئوية) في البئر. ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجةمئوية، جو هوميديفيد من 5% CO2) والثقافة لمدة 3 أيام.
  6. الحث التمايز إلى خلايا الغدد الصماء في البنكرياس.
    1. أداء NKX6.1+ خلية التعريفي (المرحلة 4، لمدة 8 أيام) متبوعاً بتحريض خلايا الغدد الصماء (المرحلة 5، لمدة 12 يوما) مع بروتوكولات تم وصفه مسبقاً3،،من1626. تميز والتحقق من صحة التفريق بين خلايا الغدد الصماء إيمونوستينينج والكمية في الوقت الحقيقي النسخ العكسي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحليل.
      ملاحظة: الرجوع إلى تويودا et al.16 و كيمورا وآخرون26 لإجراءات تجريبية مفصلة. يشير الجدول 1 لمتواليات التمهيدي المستخدمة لتحليل PCR قرة.

3-التدفق الخلوي (FCM)

  1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل من 0.5 مم أدتا إلى البئر بواسطة ماصة. كرر بالطموح وإضافة 0.5 مم يدتا مرة واحدة.
    ملاحظة: هز اللوحة برفق لإزالة أي خلايا ميتة من الخلايا أحادي الطبقة قبل كل طموح.
  2. لفصل الخلايا (حوالي 3-6 × 106 خلايا كل بئر)، وإضافة 2 مل من 0.25% التربسين التي تحتوي على 0.5 مم يدتا كل بئر. احتضان اللوحات في 37 درجةمئوية لمدة 5-10 دقائق.
  3. "الماصة؛" بلطف ولكن بسرعة فصل الخلايا تحبب خفيف إلى الخلايا المفردة. لا فقاعة تعليق الخلية أثناء بيبيتينج.
  4. إضافة 8-10 مل من قاعدة المتوسطة (RPMI 1640 أو إيميم، RT) تحتوي على 0.5 x الملحق خالية من المصل و 10 ميكرومترات Y-27632 كل جيدا وتخلط بتعليق خلية. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 300 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
  6. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 2 مل من 0.5 مم يدتا (RT). بلطف "الماصة؛" تعليق خلية.
  7. الطرد المركزي الأنبوب في 300 س ز على RT لمدة 5 دقائق.
  8. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت للتثبيت و permeabilization الواحدة 106 خلايا تحت غطاء محرك السيارة. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية تحت غطاء محرك السيارة. إبقاء الأنبوب في RT لمدة 30 دقيقة.
  9. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لمدة 5 دقائق.
  10. نضح المادة طافية تحت غطاء محرك السيارة وريسوسبيند الخلايا مع 500 ميكروليتر FCM عرقلة الحل الواحدة 106 خلايا. بلطف "الماصة؛" تعليق خلية. إبقاء الأنبوب في RT لمدة 30 دقيقة.
  11. نقل 50 ميكروليتر من تعليق خلية لأنبوب (حوالي 1 × 105 الخلايا). الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من جسم الابتدائي المخفف (انظر الجدول للمواد) في FCM عرقلة الحل واحتضان في 4 °C > ح 16.
  12. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
  13. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع 100 ميكروليتر من جسم الثانوي المخفف (انظر الجدول للمواد) في FCM عرقلة الحل. الخلايا RT لمدة 60 دقيقة أو 4 °C لاحتضان > ح 16 مع الحماية من الضوء.
  14. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 1 × بيرم/يغسل المخزن المؤقت.
  15. الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ز على RT لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ميكروليتر 180 من المصل حمار 2% في دببس.
  16. تصفية تعليق الخلية بنقل على مل 5 جولة الأنبوبة البوليستيرين أسفل الخلية مصفاة (35 قطار النايلون ميكرون) والحفاظ على 4 درجةمئوية مع حماية من الضوء حتى التحليل.
  17. تحليل نسبة خلايا إيجابية ملطخة ب تدفق سيتوميتير27.

4-إيمونوستينينج

  1. نضح المتوسطة المستخدمة وإضافة 2 مل دببس إلى البئر بواسطة ماصة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
    ملاحظة: بلطف يهز لوحة لإزالة أي خلايا ميتة من الخلايا أحادي الطبقة قبل كل طموح.
  2. إضافة 2 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) (4 درجةمئوية) كل بئر ماصة تحت غطاء محرك السيارة. احتفظ باللوحة عند 4 درجةمئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. إزالة منهاج عمل بيجين ماصة تحت غطاء محرك السيارة. إضافة 2 مل دببس في الرايت إلى البئر ماصة تحت غطاء محرك السيارة. كرر الطموح، وإضافة دببس مرة واحدة.
  4. إضافة 2 مل من محلول حظر كل بئر وإبقاء اللوحة على RT لمدة 30 دقيقة.
  5. نضح الحل المستخدمة وإضافة 1 مل جسم الأولية (انظر الجدول للمواد) في عرقلة الحل كل بئر. احتضان RT لمدة 60 دقيقة أو 4 °C > ح 16.
  6. نضح الحل المستخدمة، إضافة 2 مل دببس التي تحتوي على 0.4% X-100 تريتون واحتضان في RT لأدنى 10 تكرار التطلع، بالإضافة للحل والحضانة مرة واحدة.
  7. نضح الحل المستخدمة وإضافة 1 مل جسم الثانوية (انظر الجدول للمواد) في عرقلة الحل كل بئر. تبني على RT لمدة 60 دقيقة مع الحماية من الضوء.
  8. نضح الحل المستخدمة، إضافة 2 مل دببس التي تحتوي على 0.4% Triton X-100 (RT) واحتضان في RT لمدة 5 دقائق مع الحماية من الضوء. كرر التطلع، بالإضافة للحل والحضانة مرتين.
  9. أن ميكروجرافس لدراسة كفاءة التمايز تحت مجهر الأسفار28.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نشر هيبسكس (585A1،من2930) يتم تكثيفه وتشكيل المونولاير متجانسة (الشكل 1B) التي مناسبة للتمايز. هيبسكس غير متمايز (المرحلة 0) نات، وإعادة المصنف كخلايا مفردة في الخلية منخفضة الكثافة (1-1.5 × 105 خلايا/سم2). ضمن ح 1، مرفقة باللوحة الخلايا وتبدأ في إظهار نتوء. في يوم 1، تكاثرت الخلايا وتوزيع جيد لتغطية 80-90% مساحة السطح. أثناء المرحلة 1B، تظهر وسائل الإعلام غائم بسبب الخلايا الميتة. إزالة الخلايا الميتة بالغة الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

جيل PDX1+ الخلايا وتتألف من خطوات متعددة؛ ولذلك، من المهم لعلاج الخلايا في الوقت المناسب. ومن بين الخطوات، كفاءة التعريفي الأنسجة نهائي يؤثر إلى حد كبير على كفاءة التعريفي النهائي، وربما بتدخل من تلويث النسب الخلايا الأخرى (أي mesoderm والأديم الظاهر)، التي قد تنتشر و/أو إفراز العوامل التي تعطيل التمايز محددة. إذا كانت نسبة SOX17+ الخلايا أقل من 80% في يوم 4 (المرحلة 1 باء)، كفاءة تنظيم دورات تعريفية ل PDX1+ خلايا من المرجح أن تتعرض للخطر.

تمسك الدول غير متمايز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) عن طريق Scientific Research (C) (JSPS كاكينهي Number15K09385 المنح و 18 ك 08510) T.T.، ومعونات للزملاء الباحثين JSPS (JSPS كاكينهي عدد المنح 17J07622) لحزب العدالة والتنمية، والوكالة اليابانية "الأبحاث الطبية" والتنمية (AMED) من خلال بحوثه منح "مركز الأساسية للبرامج المتكاملة أبحاث الخلايا، شبكة مركز البحوث لتحقيق الطب التجديدي" كو يشكر المؤلفون الدكتور بيتر كاراجيانيس لقراءة المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-Keto-N-aminoethyl-N & Prime ؛ -aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamineToronto ResearchChemicals K171000CYC
4- [(E) -2- (5،6،7،8-Tetrahydro-5،5،8،8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propenyl] -حمض البنزويكسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-203303TTNPB
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم البولي بروبيلينالحرارية فيشر العلمي339652
الأجسام المضادة المضادة ل CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2 ، & مرات ؛ 1/1000
التخفيف B-27 الملحق (50 مرة;)Thermo Fisher Scientific17504-044مكمل خال من المصل
BD FACSAria II Cell SorterBD Biosciencesلقياس التدفق
الخلوي الفريزر الطبيالحيوي SANYOMDF-U538ل -30 درجة ؛ C تخزين
شرائح عد الخلايا لعداد الخلايا TC10 / TC20 ،منزلقمزدوج الغرفة BIO-RAD1450011
ثقافة الخلية متعددة الآبار ، 6 بئر ، PS ، شفافGreiner bio-One657165لثقافة التمايز / جهاز طرد مركزي بلوحة 6 آبار
TOMYAX-310لزراعة الخلايا
جهاز طردTOMYMX-305ل RT-QPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
CLEAN BENCHSHOWA KAGAKU S-1601PRVمقعد نظيف
Corning CellBIND 6-well لوحةCorning3335للثقافة الخالية من المغذيات ل hPSCs / لوحة 6 آبار
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix عامل نمو مخفضةCorning354230مصفوفة غشاء القاعدة
Corning Synthemax II-SC الركيزةCorning3535للثقافة الخالية من المغذيات من hPSCs / المواد السطحية الاصطناعية ل hPSCs
CryostatLeicaLeica CM1510 Sللتلوين المناعي للركام.
Cytofix / Cytoperm KitBecton Dickinson554714Perm / Wash buffer is   النفاذية / المخزن المؤقت للغسيل. المخزن المؤقت Cytofix / Cytoperm هو التثبيت والنفاذية العازلة.
داكو قلمداكوS2002للتلوين المناعي لمزيج dNTP المجاميع
(10 ملم)Thermo Fisher Scientific18427-088الممتز للحمار RT-qPCR
المضاد للماعز IgG (H + L) ، الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055، & مرات ؛ 1/500 تخفيف
الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa فلور 546ثيرمو فيشر ScientificA10036الجسم المضاد الثانوي ، & مرات ؛ 1/500 تخفيف
الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040الجسم المضاد الثانوي ، & 1/500 تخفيف
مصل الحمارMerck MilliporeS30مصل الحمار
D-PBS (-) بدون Ca أو MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher Scientific A1517001للثقافة الخالية من المغذيات لوسط صيانة hPSCs / hPSC
فالكون 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير ، مع مصفاة الخلية المفاجئة كابكورنينج3522355 مل أنبوب البوليسترين القاع المستدير مع مصفاة الخلية
طرف المرشح ، 1,000 & micro ؛ LWatoson124-1000Sاستخدم مع الماصات
طرف المرشح ، 20 & micro ؛ LWatoson124-P20Sاستخدم مع الماصات
طرف الفلتر ، 200 & micro ؛ LWatoson124-P200Sاستخدم مع الماصات
المجهر الفلوريKeyenceBZ-X700للتلغيخ
المناعي Forma Steri-Cycle CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher Scientific370Aحاضنة
HNF-1 & بيتا ؛ الجسم المضاد (C-20)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-7411المضادة ل HNF1 & beta ;, & مرات ؛ 1/200 تخفيف
HNF-4 &alpha ؛ الجسم المضاد (H-171)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-8987Anti-HNF4 & alpha ; ، & مرات ؛ 1/200 التخفيف
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570لتلوين النواة ، & مرات ؛ 1/200 تخفيف
البنكرياس البشري إجمالي الحمض النووي الريبيAmbionAM7954ل RT-qPCR
البشري PDX-1 / IPF1 الأجسام المضادةR & D SystemsAF2419Anti-PDX1 ، الماعز IgG ، & مرات ؛ 1/200 تخفيف
الأجسام المضادة البشرية SOX17R & D SystemsAF1924Anti-SOX17 ، & مرات 1/200 تخفيف
محسن MEM خيار الزنك متوسطThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
غرفة حضانةCosmo Bio10DOللتلوين المناعي للمجاميع
قفازات فحص اللاتكسAdachi
MAS المغلفة زجاجماتسوناميالزجاج 83-1881ل تلوين مناعي من الركام
MicroAmp Fast 96-well Reaction PlateApplied Biosystems / Thermo FisherScientific 4346907لمجهر RT-qPCR
OlympusCKX41N-31PHPلزراعة الخلايا
MicrotubeWatoson131-515CS
أحادي النسيلة المضاد لألفا البروتين الجنينيSIGMAA8452المضاد ل AFP ، & مرات 1/200 التخفيف
Nanodrop 8000Thermo Fisher ScientificFor RT-qPCR
Oligo dTFASMACCustom Made Oligo & nbsp ؛بالنسبة ل RT-qPCR للتسلسل هو "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
بارافورمالدهيد ، مسحوقNacalai tesque26126-54PFA ، مثبت ، مخفف في
ثلاجة DPBS الصيدلانيةSANYOMPR-514ل 4 درجات ؛ C تخزين
PIPETMAN P جيلسونماصة
مؤتلفة بشرية KGF / FGF-7R & D Systems251-KGKGF
المؤتلف البشري NogginPeproTech120-10CNOGGIN
المؤتلف الإنسان / الفأر / الفئران Activin AR & D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 وحدة | L)TOYOBOTRT-101لمجموعة DNase الخالية من RT-qPCR
RNase (50)QIAGEN79254ل RT-qPCR
RNeasy Mini KitQIAGEN74104ل RT-qPCR
RPMI 1640 مع L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
فيلم مانع للتسرب في الوقت الحقيقيTakaraNJ500للماصات المصلية RT-qPCR
10 ملCostar / Corning4488لزراعة الخلايا
الماصات المصلية 25 ملCostar / Corning4489لزراعة الخلايا
الماصات المصلية 5 ملCostar / Corning4487لزراعة الخلايا
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbإشارات الخلية3579SAnti-SOX2 ، & مرات ؛ 1/200 تخفيف
StepOnePlusالأنظمة الحيوية التطبيقية / ثيرمو فيشر ScientificFor RT-qPCR
السكروزNacalai tesque30406-25للتلطين المناعي للمجاميع
TB Green
Premix Ex Taq II   ؛		TakaraRR820Bلعداد الخلايا الآلي RT-qPCR
TC20BIO-RAD1450101J1عداد الخلايا الأوتوماتيكي
Tissue-Tek OCT مركب 4583   ؛Sakura Finetechnical4583للتلوين المناعي للمجاميع
قوالب / محولات Tissue-Tek CryomoldSakura Finetechnical4566للتلوين المناعي للمجاميع
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
فريزر فائق البرودةSANYOMDF-U33Vل -80 درجة ؛ تخزين C
UltraPure 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0Thermo Fisher Scientific15575-038تمييع مع DPBS لتحضير 0.5 ملي مولار EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems / Thermo Fisher Scientificل RT-qPCR
Y-27632واكو251-00514
زجاج عد لوحة مركزي للجسم المضاد الثانوي

المراجع

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463(2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218(2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076(2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDX1

مقالات ذات صلة