مقالة منهجية

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

DOI:

10.3791/57646

⸱

نوفمبر 11, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, 2Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, 3Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, 4Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, 5Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, 6Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, 7Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, 8LinkoCare Life Sciences AB, 9College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 10Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يمكننا وصف بروتوكول للتحقيق في برينيليشن وجانسين-5 '-ثلاثي الفوسفات (غتب)-تحميل"جتباسي رو". يتألف هذا البروتوكول من أسلوبي مفصلة، إلا وهي وجود الغشاء والممتز GTPase مرتبطة الاعتداء. البروتوكول يمكن استخدامها لقياس برينيليشن وأنشئ تحميل مختلفة أخرى جتباسيس الصغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتمي إلى فوق عائلة رأس الأسرة GTPase رو ويضم حوالي 20 عضوا في البشر. جتباسيس رو هامة في تنظيم الوظائف الخلوية المتنوعة، بما في ذلك ديناميكية cytoskeletal، حركية الخلية، الخلية القطبية، التوجيه محواري والاتجار حويصلية ومراقبة دورة الخلية. التغييرات في إشارة "جتباسي رو" دوراً جوهريا تنظيمية في العديد من الحالات المرضية، مثل السرطان، وأمراض الجهاز العصبي المركزي، وتعتمد على نظام المناعة من الأمراض. تعديل بوستترانسلاشونال "جتباسيس رو" (أي، برينيليشن بوسيطة مسار mevalonate) وأنشئ الملزمة هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على تنشيط هذا البروتين. في هذه الورقة، يتم توفير طريقتين أساسية وبسيطة للكشف نطاق واسع من "جتباسي رو" برينيليشن وأنشئ ربط الأنشطة. شرح تفاصيل للإجراءات التقنية التي تم استخدامها خطوة بخطوة في هذه المخطوطة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جتباسيس رو هي مجموعة من البروتينات الصغيرة (21-25 كاتشين)، التي هي المصانة جيدا في جميع أنحاء تطور، وتشكل من فصيلة فريدة من نوعها في فوق رأس عائلة من جتباسيس الصغيرة. في كل فصيلة داخل هذا فوق عائلة، هناك مجال ز مشتركة أساسية التي تشارك في نشاط GTPase و تبادل النوكليوتيدات1. الفرق بين الأسرة رو وسوبفاميليس رأس الأخرى هو وجود "مجال إدراج رو" داخل حبلا βال 5 وفيال 4 α الحلزون في المجال GTPase صغيرة2.

استناداً إلى التصنيف الأخير، تعتبر "جتباسيس رو" عائلة من إشارات البروتينات التي تناسب فوق عائلة جتباسي رأس3. وقد الثدييات "رو جتباسيس" 22 عضوا على أساس وظيفة معينة والتوصيف العام4 الذي روا و Rac1، و Cdc42 من بين دراسة معظم أعضاء في هذه المجموعة. جتباسيس رو ترتبط بداخل الخلايا مما يشير إلى الممرات عبر إليه محكم تنظيم الذي يعتمد على رموز تبديل الجزيئية عن طريق البروتين التعديلات بوستترانسلاشونال5.

أنشئ تحميل والتحلل المائي الآليات الأساسية في دورة تنشيط/إلغاء تنشيط الصغيرة "رو جتباسيس" وهي تنظم عن طريق جتباسي-تفعيل البروتينات (الثغرات). هي المسؤولة عن التحلل المائي أنشئ الفجوات والعمل يدا واحدة مع جوانين النوكليوتيدات تبادل العوامل (جيفس) هي المسؤولة عن رد الفعل أنشئ في التحميل. الناتج المحلي الإجمالي رو تفارق مثبطات (جديس) تقديم المزيد من تنظيم "جتباسيس رو" الصغيرة عن طريق الربط إلى "جتباسيس رو" ربط الناتج المحلي الإجمالي. وهذا يحول دون الانفصال من الناتج المحلي الإجمالي، ويسهل عزل من "جتباسيس رو" الصغيرة بعيداً عن المواقع غشاء داخل الخلية النشطة. كما يوجد كذلك تنظيم البروتينات GTPase رو التي تنطوي برينيليشن جديس الذي ينظم كل من النوكليوتيدات التحلل المائي والصرف وعناصر الناتج المحلي الإجمالي/غتب ركوب الدراجات1،6،،من78.

أنشئ في التحميل وبرينيليشن "جتباسي رو" تشارك في حركة "جتباسي رو" بين سيتوسول وأغشية الخلايا عن طريق تغيير الخصائص الفيزيائية لهذه البروتينات1،9. الجهات التنظيمية المذكورة أعلاه التفاعل مع فوسفوليبيدات غشاء الخلية والبروتينات الأخرى تحوير ل نشاط تبادل غتب/الناتج المحلي الإجمالي10. وعلاوة على ذلك، كتلة جديس، مثبطات الانفصال، أنشئ التحلل المائي وتبادل غتب/الناتج المحلي الإجمالي. جديس تحول دون تفكك البروتينات رو غير النشطة من الناتج المحلي الإجمالي، ومن ثم تفاعلها مع المستجيبة المتلقين للمعلومات. كما تنظم جديس ركوب الدراجات من جتباسيس بين سيتوسول وغشاء في الخلية. نشاط "جتباسيس رو" يعتمد إلى حد كبير على حركتهم لغشاء الخلية؛ وهكذا، تعتبر جديس المنظمين الحرجة التي يمكن عزل جتباسيس في السيتوبلازم عن طريق الاختباء بها11،مسعور المنطقة/المجالات12.

ل GTPase رو أن يكون إشارات والدالة الأمثل في جميع مراحل دورة التنشيط، دورة الحيوي التحلل غتب-تحميل/غتب أمر حاسم. قد يؤدي إجراء تغييرات لاحقة في وظائف الخلية وينظم GTPase رو، مثل خلية قطبية، انتشار، morphogenesis، سيتوكينيسيس، والهجرة والالتصاق والبقاء على قيد الحياة13،14أي نوع من التعديلات في هذه العملية.

وينص البروتوكول الحالي القراء بطريقة مفصلة لرصد صغيرة GTPase روا التنشيط عن طريق التحقيق في برينيليشن، والناتج المحلي الإجمالي/غتب تحميل. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للكشف عن برينيليشن وربط أنشئ مجموعة واسعة من جتباسيس الصغيرة. يمكن استخدام مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي لقياس مستوى التنشيط لأنواع أخرى من جتباسيس، مثل Rac1، Rac2، Rac3، ح أو ك، أو رأس ن، والمنتدى الإقليمي للاسيان، ورو15. ويستخدم سيمفاستاتين وكيل الدوائية كمثال على ذلك، كما ذكر مؤخرا أن تشارك في تنظيم صغير "رو جتباسي" برينيليشن والنشاط8،9،،من1416.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تحديد التعريب روا باستخدام تجزئة غشاء/سيتوسول

  1. خلية العلاج الثقافة وسيمفاستاتين
    1. بذور 50,000 U251 الخلايا في 100 مم طبق والثقافة لهم في دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم) (ارتفاع الجلوكوز، 10% مصل بقرى الجنين [FBS]).
    2. عندما روافد 30 ٪، علاج الخلايا عن طريق إزالة المتوسطة وإضافة المحتوية على سيمفاستاتين المتوسطة لأنها (10 ميكرون من سيمفاستاتين حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]])، واحتضان ح 36 في8من 37 درجة مئوية. استخدام [دمس] وحدها كعنصر تحكم سيارة.
      ملاحظة: تحتاج الخلايا 10 مليون لتجزئة سيتوسول وغشاء الخلايا.
  2. مجموعة من الخلايا
    1. إزالة الخلايا من حاضنة 37 درجة مئوية. انظروا إلى الخلايا تحت مجهر للتأكد من كونفلوينسي.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا روافد 70% إلى 80%.
    2. نضح المتوسطة، وتغسل الخلايا 1 x مع المياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات (PBS). إضافة 5 مل من المخزن المؤقت لحمض (يدتا) الإيثيلين (بوكل: 400 مغ/لتر، كلوريد الصوديوم: 6800 مغ/لتر، NaHCO3: 2200 مغ/لتر، نة2ص4. H2o: 140 مغ/لتر، د-الجلوكوز: ملغ 1,000، يدتا ثنائي: 373 مغ/لتر) كل لوحة ومكان الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. وبعد 5 دقائق من الحضانة، جمع يدتا مع الخلايا في أنبوب 15 مل يحتوي على نفس الكمية من المتوسط يدتا.
      ملاحظة: وجود متوسطة في الأنبوب يحيد يدتا ويمنع أي هضم المزيد من أغشية الخلايا.
    4. ضع الأنبوبة في مربع جليد والمضي قدما الطرد المركزي.
    5. قم بإعداد أجهزة الطرد المركزي إلى س 1,500 ز في 4 درجات مئوية وتدور الخلايا لمدة 5 دقائق.
    6. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. مزيج الخلايا أيضا.
    7. نقل الخليط خلية (الحل) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة، أجهزة الطرد المركزي في س 1,500 ز في 4 درجات مئوية، وتدور الخلايا لمدة 5 دقائق.
    8. تحقق من حجم بيليه (لتقدير حجم المخزن المؤقت للخطوة التالية). وضع العينات في الثلج. تجاهل المادة طافية تماما دون إزعاج بيليه.
    9. إضافة المخزن المؤقت المثلج الأول (10 ملم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] ومم 0.1 يدتا، 0.1 مم عطا، ديثيوثريتول 1 مم ومثبط البروتياز كوكتيل)، تخلط العينات جيدا من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وثم، انتقل إلى سونيكيشن.
  3. سونيكيشن
    1. تعيين سونيكاتور لخمس دورات، 5 s كل، وتكرار x 3.
    2. تنفيذ في سونيكيشن على الجليد. الشروع أولتراسينتريفوجي.
      ملاحظة: الجليد والبرد شرط الحفاظ على البروتينات وجعل النتائج أكثر موثوقية.
  4. تنبيذ فائق
    1. استخدام ultracentrifuge لفصل هوموجيناتيس الخلية إلى هيولى والغشاء الكسور. تعيين أجهزة الطرد المركزي إلى x 100,000 ز لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية. كما هو مبين في الشكل 1، تحقق من حجم بيليه.
      ملاحظة: كسر الغشاء الذي في الجزء السفلي من الأنبوب وبقية المكونات الأخرى هيولى.
    2. جمع المادة طافية تماما مع الحرص على عدم تعكير بيليه. المادة طافية هي جزء سيتوسوليك. ضع المادة طافية في أنبوب مسمى حديثا.
    3. إضافة 300 ميليلتر من تفكك المخزن المؤقت (المخزن المؤقت الثاني) (50 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] 0.15 م كلوريد الصوديوم، ديثيوثريتول 1 مم، والحزب الديمقراطي الصربي 1%، 1 مم يدتا، 1 مم اجتا ومثبط البروتياز كوكتيل) لبيليه (يحتوي على كسر الغشاء). مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    4. أن نشرع البروتين تصميم وإعداد نموذج لطخة غربية (تحليل immunoblot).
  5. إيمونوبلوتينج
    1. إعداد البروتين خلية مقتطفات من الكسور المنفصلين عن ذويهم في تحلل المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، 0.5 مم بمسف، المنظفات غير الأيونية 0.5%-40، 100 ميكرومتر β-الجلسرين 3-الفوسفات، و 0.5% حوزتي المانع كوكتيل).
    2. قياس تركيز البروتين باستخدام أسلوب لوري8 وحساب حجم المخزن المؤقت تحلل (20 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] 0.5 مم بمسف، والمنظفات نونديناتورينج 0.5%، أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول، 100 ميكرومتر β-الجلسرين 3-الفوسفات و 0.5% كوكتيل مثبط البروتياز) لتطبيع تركيز البروتين بين العينات.
    3. حرارة العينات عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتحميل 15-20 ميليلتر من العينات في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 15% لفصل البروتينات.
      ملاحظة: تحميل 1 ميكروغرام من البروتين لكل عينة. حساب وحدة التخزين التي تحتاج إلى تشغيل تبعاً لذلك.
    4. نقل البروتينات المنفصلين إلى أغشية النايلون تحت الحد من شروط (500 جليكاين شمال البحر الأبيض المتوسط و 50 مم تريس-HCl و 20% ميثانول) ح 2، في درجة حرارة الغرفة (RT) في 100 V.
      ملاحظة: للتأكد من نقل البروتين ناجحة، استخدم بونسو وصمة عار أو تصور علامة البروتين على الغشاء.
    5. كتلة الأغشية مع الحليب المجفف الخالي 5% و 1 x تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على مواد التنظيف (TBS/0.01% المنظفات النطاق؛ تبسة) لمنع ربط جسم غير محدد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في الرايت لح 1.
    6. إضافة الأجسام المضادة الأولية لتحليل إيمونوبلوتينج واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: في هذه التجربة، Rac1/2/3، cdc42، روا، جابده، وعموم-كادهيرين قد استخدمت في إضعاف 1:1,000 في الحليب 1% في 1 x TBST. واستخدمت Pan-كادهيرين وجابده للتأكد من الغشاء ونقاء كسر سيتوسوليك، على التوالي.
    7. غسل الأغشية 3 x مع مخزن مؤقت غسيل مع 1 x TBST لمدة 20 دقيقة.
    8. احتضان الأغشية مع أرنب المضادة الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق جسم الثانوية للأجسام المضادة الأولية منها (من أجل 1 ح في RT).
    9. أغسل البقع 3 x لمدة 20 دقيقة وتطويرها مع الكشف عن تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة).

2-قياس الحمولة غتب روا مقايسة صغير البروتين ز تنشيط باستخدام

  1. 10,000 عدد خلايا/مل وثقافة الخلايا U251 في 100 مم، طبق.
  2. عندما تكون روافد 30 ٪، علاج الخلايا مع سيمفاستاتين كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.
  3. إحضار لوحات الثقافة خارج الحاضنة. انظروا إلى الخلايا تحت المجهر للتأكد من كونفلوينسي. التأكد من أن الخلايا روافد 70% إلى 80%. وضع طبق بتري على الجليد، ونضح وسائط الإعلام، وتغسل الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني المثلج (الرقم الهيدروجيني 7.2).
  4. نضح في برنامج تلفزيوني. إمالة، طبق بيتري على الجليد لدقيقة إضافية لإزالة جميع مخلفات من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني المتبقية يؤثر سلبا على هذا التحليل.
  5. الخلايا الموجودة في وحدة تخزين ميليلتر 700 تحلل المثلج المخزن المؤقت الذي يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز.
    ملاحظة: ميليلتر 700 عادة ما يكفي ل 100 مم طبق بيتري. انظر الجدول 1 العثور على وحدة التخزين السليم لكل سفينة الثقافة.
  6. حصاد الخلية ليستي مع مكشطة الخلية. انحدر لوحة الثقافة لهذا الأسلوب.
  7. نقل إلى كريوتوبي المثلج مسمى وإبقائه على الجليد.
  8. مزيج دقيق باستخدام دوامة. يبقى 10 ميليلتر من مقايسة البروتين، لقياس تركيز البروتين في العينة.
  9. الأداة الإضافية-تجميد الخلية المتبقية في نيتروجين سائل.
    ملاحظة: تحضير مختبرين متعددة الخلية قبل تجميد المفاجئة لهم، لتجنب دورات متكررة تجميد/ذوبان الجليد الذي يمكن أن يؤدي إلى الخسائر في نشاط GTPase روا.
  10. نقل كريوتوبيس مجمدة في الأداة الإضافية لثلاجة-80 درجة مئوية وتخزين العينات مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي.
    ملاحظة: لا تقم بتخزين العينات لمدة تزيد على 14 يوما. العمل بسرعة، ولا تترك العينات في الثلج لمدة أطول من 10 دقائق. ابدأ بمعالجة جميع بيتري الأطباق في وقت واحد.
  11. قياس تركيز البروتين باستخدام أسلوب لوري8 وحساب حجم المخزن المؤقت تحلل لتطبيع تركيز البروتين بين العينات.
    ملاحظة: أن تركيز أفضل عادة 1 ملغ/مل؛ ومع ذلك، 0.3-2 مغ/مل يمكن أن تكون قابلة للكشف.
  12. إعداد عنصر تحكم فارغ بإضافة 60 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل و 60 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم microtube.
    ملاحظة: عنصر تحكم فارغ الكواشف كافة باستثناء antigen ويستخدم للطرح للخلفية.
  13. إعداد عنصر تحكم إيجابية بإضافة 12 ميليلتر من البروتين التحكم رو وميليلتر 48 من المخزن المؤقت لتحلل 60 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم.
    ملاحظة: قد مراقبة إيجابية جميع الكواشف بالإضافة إلى مستضد مؤكدة رو-A-أنشئ.
  14. إخراج لوحة تقارب رو في الحقيبة ووضعه على الجليد.
  15. يحل المسحوق في الآبار مع 100 ميليلتر من الماء المقطر المثلج. تبقى لوحة على الجليد.
  16. ذوبان الجليد ليساتيس خلية مجمدة في الأداة الإضافية في حمام مائي بتعيين إلى 25 درجة مئوية.
  17. إضافة حجم المخزن المؤقت تحلل المثلج (من الخطوة 2.11) لكل عينة لتطبيع تركيز البروتين المحسوبة.
    ملاحظة: إزالة برنامج تلفزيوني بعد غسل الخلايا (باستخدام المضخة فراغ أنبوب) تجنب أحداث تغييرات في تكوين المخزن المؤقت تحلل. معادلة البروتين عينة إلى تركيز بين 0.8 و 2 ملغ/مل لإجراء مقارنة دقيقة بين العينات في فحوصات التنشيط جتباسي. ويقدم الجدول 2 تفاصيل حول المخزن المؤقت لاستخدامها لهذا التحليل.
  18. نقل 60 ميليلتر من عينات الجليد تطبيع إلى microtubes وإضافة 60 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت؛ تخلط العينات جيدا وإبقائها على الجليد.
  19. تماما إزالة المياه/الحلول من الميكروسكوبية التي يسددها قوية، تليها خمسة إلى سبعة صنابير الثابت على حصيرة مختبر.
  20. إضافة 50 ميليلتر من العينات التي تم تسويتها وعنصر تحكم فارغ، وعنصر إيجابي للآبار في التكرارات.
  21. وضع اللوحة على شاكر مدارية لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية 300 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: الخطوة تهز مهم جداً، ومن المستحسن استخدام شاكر لوحة مدارية 300 لفة في الدقيقة.
  22. مسح العينات المأخوذة من اللوحة بالتحريك وغسلها x 2 مع 200 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت في "الرايت قوة" إزالة المخزن المؤقت الغسيل من الآبار بعد كل غسل بالتحريك، متبوعاً بالتنصت، والاحتفاظ اللوحة على مقاعد البدلاء في الرايت
  23. إضافة 200 ميليلتر RT مستضد-عرض المخزن المؤقت لكل بئر واحتضان في RT لمدة 2 دقيقة.
  24. نفض الغبار على الحل من الآبار وغسل الآبار 3 x مع 200 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت في الرايت
  25. إضافة 50 ميليلتر من طازجة 1/250 روا مكافحة جسم الأولية لكل بئر.
  26. وضع اللوحة على شاكر مدارية لمدة 45 دقيقة 300 لفة في الدقيقة بتعيين إلى 25 درجة مئوية. نفض الغبار على الحل من البئر.
  27. كرر الخطوات الغسيل 2 x (الخطوة 2، 24).
  28. إضافة 50 ميليلتر من طازجة 1/250 روا مكافحة الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر.
  29. وضع اللوحة على رأس شاكر مدارية لمدة 45 دقيقة 300 لفة في الدقيقة بتعيين إلى 25 درجة مئوية.
  30. تحضير الكاشف الكشف عن برنامج الصحة الإنجابية عن طريق خلط كميات متساوية من كاشف أ وكاشف باء
  31. نفض الغبار حل من كل بئر وغسل الآبار 3 x مع 200 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت في الرايت
  32. إضافة 50 ميليلتر من الطازجة كاشف الكشف عن برنامج الصحة الإنجابية لكل بئر.
  33. قراءة إشارة الإنارة داخل 3-5 دقائق الحصول على إشارة الحد الأقصى، وتحليل النتائج باستخدام حزمة برامج مناسبة.
    ملاحظة: يجب اتخاذ القراءات خلال 3-5 دقائق للحصول على إشارة الحد الأقصى. تشغيل "لوحة اختبار" للتأكد من تحلل السليم حجم المخزن المؤقت يستخدم ليساتيس الخلية حيث يكون تركيز البروتين مرتفعة بما يكفي للكشف عن نشاط GTPase روا. (لوحة اختبار صفيحة خلايا المستخدمة لتحديد إذا كان تركيز البروتين يقع ضمن النطاق المقبول، وأيضا تحديد ما إذا كان حجم المخزن المؤقت تحلل المستخدمة ملائمة). مراقبة إيجابية ينبغي قراءة 4 إلى 10 إضعاف أعلى من الآبار فارغة إذا كان ذلك في نطاق خطي. إذا لم يكن كذلك، ثم ضبط لومينوميتير باستشارة الشركة المصنعة. إعدادات لومينوميتير ترد في الجدول 3.
  34. قم بإدخال البيانات الخام في أعمدة حيث قراءة العناوين عينة، يعني، الانحراف المعياري، rep1، rep2، rep3و rep4، لإظهار عدد replicates يجري القيام به في كل عينة.
  35. تحت يعني، أدخل الصيغة =average(Xn:Yn) حيث X = مصمم العمود ل rep1، ص = مصمم العمود ل rep4، و n = مصمم الصف صف يجري العمل على.
  36. تحت الانحراف المعياري، أدخل الصيغة = stdev (Xn:Yn) حيث X = مصمم العمود ل rep1، ص = مصمم العمود ل rep4، و n = مصمم الصف صف يجري العمل على.
  37. إدخال البيانات نسخ متماثل في rep1، rep2، و ما إلى ذلك
  38. بعد إدخال البيانات، استخدم الأسلوب انقر واسحب لتحديد العينة، يعني، و الانحراف المعياري.
  39. ثم، في برامج تحليل البيانات، حدد الدالة لصنع الذي يبدو وكأنه ساحة مع مخطط شريطي صغير داخل المخطط.
    ملاحظة: هذا إحضار مخطط عملية صنع القرار حيث أنه من الممكن لتصميم الرسوم البيانية استناداً إلى البيانات التي تم إدخالها.
  40. اختر تخطيط العمود ، وقيم الإدخال، تعيين أرقام يعني .
    ملاحظة: يتم التخطيط لأرقام يعني للمرة الأولى ومن ثم، يتم تعيين العمود الانحراف المعياري لأشرطة الخطأ المحور ص. للقيام بهذا، انقر نقراً مزدوجاً فوق الرسم البياني الحانات وحدد علامة التبويب المحور الصادي الخطأ ، انقر فوق الخيار مخصص وتحديد المنطقة في ورقة العمل لإدخال موقع البيانات الانحراف المعياري . ويمكن رؤية الفرق بين المجموعات التي تحتاج إلى أن تكون المقارنة بعد إنشاء المخططات المطلوبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غشاء تجزئة:

واستخدمت لتجزئة مكونات الغشاء وسيتوسول تنبيذ فائق. كما هو مبين في الشكل 1، المادة طافية على الكسر سيتوسوليك وبيليه تحتوي على غشاء الكسر. تم بحث وفرة روا في الكسور أندميمبراني سيتوسوليك التي تم الحصول عليها من الخلايا U251 بعد العلاج مع سيمفاستاتين باستخدام إيمونوبلوتينج. النقاء وتحميل عنصر تحكم كسر الغشاء وسيتوسول تأكدت بعموم-كادهيرين وجابده على التوالي. علاج سيمفاستاتين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا طريقة دقيقة لقياس صغيرة جتباسي برينيليشن وأنشئ ملزمة كما هو موضح الصغيرة جتباسي سوبسيلولار التعريب (غشاء مقابل سيتوسول) و "أنشئ رو" تحميل. جتباسيس الصغيرة التي أعرب عنها في الخلايا حقيقية النواة، وتلعب دوراً أساسيا في انتشار الهاتف الخلوي، وحركية، وهيكل. برينيليشن وربط غتب تشارك في تنظيم نشاط GTPase؛ ولذلك، فحوصات لتقييم برينيليشن وأنشئ ملزمة لهذه البروتينات أدوات هامة للخلية علماء الأحياء1،8.

استناداً إلى نتائج در...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد غافامي سعيد "الصحة العلوم مركز التشغيل منحة"، كريم العاملة بمنحه و "البحوث مانيتوبا المحقق الجديد يعمل بمنحه". وأيد على زاده جواد سنهم مانيتوبا البحوث. شجاعي شهلا تدعمها منحة "تعمل مؤسسة العلوم الصحية" و "تسريع ميتكس" زمالة ما بعد الدكتوراه. وأيد عادل رضائي موغادام الأموال العاملة المنح التي عقدت قبل جوزيف جورج غوردون. وأيد أمير أ زكي على جائزة K08 المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI (1K08HL114882-01A1). ماريك جيه لوس يرجى تعترف بالدعم من منحة نكن #2016/21/ب/NZ1/02812، تدعمها LE ستوديوم معهد الدراسات المتقدمة (منطقة المركز-فال دو لوار، فرنسا) من خلال "برنامج العام وادي اللوار الذكية" ويشترك في تمويله ماري إجراءات سكلودوفسكا كوري، منح #665790. وأيد أومجف سنهم سيموني دا روسا سيلفا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM عالي الجلوكوزVWR (كندا)VWRL0101-0500
مصل الأبقار الجنينيVWR (كندا)CA45001-106
البنسلين / الستربتومايسينVWR (كندا)97062-806
EDTA (حمض إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك)VWR (كندا)CA71007-118
EGTA (إيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'- حمض تتراأسيتيك) VWR(كندا)CAAAJ60767-AE
DTT (DL-Dithiothreitol)VWR (كندا)CA97061-340
بيرسولفات الأمونيومVWR (كندا)CABDH9214-500 جم
Tris-HydroxymethylaminomethaneVWR (كندا)CA71009-186
محلول أكريلاميد / مكررBiorad (كندا)1610158
TEMEDBiorad (كندا)1610801
كوكتيل مثبط للبروتيازسيجما / ألدريتش (كندا)P8340-5ML1:75
Rho-GTPase Antibody SamplerKit إشارات الخلية (كندا)99681: 1000
إشارات الخلايا بالأجسام المضادة Pan-Cadherin(كندا)40681: 1000
الأجسام المضادة GAPDHسانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (الولايات المتحدة الأمريكية)SC-697781: 3000 التخفيف
RhoA G-LISA مقايسة التنشيط (تنسيق اللمعان)Cytoskeleton Inc. (الولايات المتحدة الأمريكية)BK121الهيكل الخلوي I. الدليل الفني لمقايسات تنشيط G-Lisa. 2016.RhoA
الأجسام المضادة خلية الإشارات2117
ECLAmersham-Pharmacia BiotechRPN2209
مكافحة الأرانب IgG (جزيء كامل) الأجسام المضادة للبيروكسيدازSigmaA6154-1ML
SpectraMax iD5 متعددة الأوضاع Microplate Readerالأجهزة الجزيئية   ؛1612071Aمقياس الطيف
Nonidet P-40Sigma11332473001منظف غير مسجل ، أوكتيل فينوكسي بولي إيتوكسي إيثانول
DMSOSigmaD8418-50ML
PBSSigmaP5493-1L
كوكتيل مثبط الفوفاتازSigmaP5726-5ML1:75 التخفيف
تخفيف تخفيف تخفيف الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
  2. Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
  3. Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
  4. Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
  5. Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
  6. Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
  7. Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
  8. Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841(2017).
  9. Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523(2011).
  10. Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
  11. DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
  12. Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
  13. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  14. Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
  15. Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
  16. Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
  17. Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
  18. Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3(2008).
  19. Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
  20. Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
  21. Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
  22. Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
  23. Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
  24. Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Rho GTPase GTP Simvastatin

مقالات ذات صلة