مقالة منهجية

أسلوب إعداد نموذج فعال لتعزيز الإشارات أيون الكربوهيدرات في مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين الكتلي

6.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57660

⸱

يوليو 29, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

في هذه المقالة

ملخص

ويتجلى بروتوكولا لتعزيز الإشارات أيون الكربوهيدرات في استخدام الطيف الكتلي بإصلاح الهياكل البلورية أثناء عمليات إعداد عينة.

الملخص

إعداد عينة عملية حاسمة في تحليل الطيف الكتلي (مللي ثانية) من الكربوهيدرات. على الرغم من أن الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين (استخدام) مرض التصلب العصبي المتعدد هو الأسلوب المفضل في تحليل الكربوهيدرات، ستظل أيون الفقيرة الإشارات والبيانات إمكانية تكرار نتائج العينات الكربوهيدرات مشاكل حادة. للتحليل الكمي من الكربوهيدرات، بروتوكولا تحليلية فعالة توفر بيانات فائقة الجودة ضروري. ويوضح هذا الفيديو نموذج إعداد بروتوكولات تحسين كثافة الإشارات وتقليل التباين البيانات من الكربوهيدرات في استخدام MS. بعد التجفيف، وتبلور من قطرات العينة، يتم إصلاح مورفولوجية كريستال من الميثانول قبل التحليل الشامل والمطيافيه. هو بحث تعزيز في إشارة الكربوهيدرات باستخدام التصوير الكتلي (IMS). وتظهر النتائج التجريبية أن إصلاحهم كريستال يضبط هياكل بلورية وتوزيع تحليلها الكربوهيدرات. بالمقارنة مع طريقة إعداد الحبرية المجففة التقليدية استخدام-مللي ثانية، الكربوهيدرات إصلاح كريستال مورفولوجيس مع الميثانول يظهر كثافة إشارة أفضل بكثير، وتوزيع الصورة أيون واستقرار البيانات. منذ بروتوكولات أثبتت هذه الوثيقة لا تنطوي على تغييرات في تكوين عينة، فتنطبق عموما على مختلف الكربوهيدرات ومصفوفات.

المقدمة

تحليل الكربوهيدرات هي أحد المواضيع الهامة والصعبة. الكربوهيدرات ومشتقاتها تلعب أدواراً هامة تعيش الكائنات الحية1،،من23. قد أدى إلى تعقيد هياكل هذه الجزيئات وهي عرضه لتتحلل. لا يمكن أن توصف العديد منهم واضح بسبب صعوبات في فصل والكشف. تحليل الكربوهيدرات باستخدام MS استخدام ما زال على الرغم من أن تم تطبيق تحليل طائفة واسعة من الجزيئات الحيوية، نظراً لحساسية ونتائج مفهومة4، الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين (استخدام) الطيف الكتلي (مللي ثانية) أن يكون تحديا كبيرا بسبب كفاءة التأين المنخفضة مثل هذه الجزيئات5. Derivatization الكيميائية بطريقة مشتركة لتحسين كفاءة التأين من الكربوهيدرات6،7، ولكن هذه الإجراءات بالوقت واستهلاك العينة. وإلى جانب ذلك، كفاءة التأين الكربوهيدرات ديريفاتيزيد لا يزال أقل من البروتينات. وهكذا، ضروري استحداث طرق لتحسين إشارة الكربوهيدرات في استخدام MS دون إجراءات معقدة.

تطبيق استخدام MS للتحليل الكمي موضوع تحديا آخر. مشكلة رئيسية تتمثل في استخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد أن لها إمكانية تكرار البيانات وحساسية نتائج تعتمد حاسمة على عينة إعداد البروتوكولات والمعايير التجريبية. في كثير من الحالات، التحليل الكمي باستخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد لا يمكن الاعتماد عليها بسبب مورفولوجيس عينة غير متجانسة وتوزيع أكثر. الأمثلة معروفة جيدا عينات أعد مع مصفوفة (المجالس الصحية المحلية) استخدام حمض 2، 5-ديهيدروكسيبينزويك. مدى إدماج أكثر في مصفوفة بلورات عندما يتم تبلور المجالس الصحية المحلية ببطء تحت البيئة المحيطة، لا يمكن التنبؤ بها، نظراً لإظهار العينات الناتجة مورفولوجيس غير النظامية. وتتمثل هذه العينات عادة بلورات على شكل إبرة وغرامة كبيرة. عند إعداد المجالس الصحية المحلية باستخدام المذيبات المتطايرة و/أو لوحة عينة ساخنة، عملية تجفيف سريعة ينتج بلورات غرامة أكثر تجانساً وأفضل النتائج الكمية8،،من910. هذا الأسلوب يعرف باسم "البلورة" استخدام العينات. ويعزى التحسن إلى إدماج أفضل لتحليلها في مصفوفة غرامة بلورات أثناء عملية التبلور بسرعة. لقد أظهرنا أيضا أن التكيف مع البيئة إعداد نموذج تخفيض تباين إشارة الكربوهيدرات وتحسين النتائج الكمية11،12. النتائج في هذه الأعمال تشير إلى أن عينة مورفولوجيا عاملاً حاسما في تحديد جودة الإشارة الكربوهيدرات. لوضع استراتيجية عامة للتحليل اليومي، مطلوب أسلوب إصلاح عينة كفاءة توفير حساسية الكربوهيدرات المحسنة.

وقد درسنا بانتظام العلاقة بين حساسية عينة مورفولوجيا والكربوهيدرات في استخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد في تقرير الأخيرة13. إظهار مصفوفات استيفاء تعزيز الإشارات أفضل من ريكريستاليزينج المجففة استخدام العينات والنتائج المتحصل عليها باستخدام العديد من الكربوهيدرات الهامة. يتم إصلاح مورفولوجية عينات المعدة باستخدام الطريقة التقليدية الحبرية المجففة (دد) من البلورة بسرعة مع الميثانول (ميوه). وأظهرت البروتوكولات إعداد نماذج مفصلة هنا. البروتوكول يتكون من ثلاث خطوات رئيسية، بما في ذلك نموذج لوحة preconditioning وترسب العينة والبلورة، وتحليل الطيف الكتلي. وتشمل الكربوهيدرات استخداماً سياليل-لويس (SLeA) ومالتوهيبتاوسي (MH). المجالس الصحية المحلية كمصفوفة نموذج. وتبين النتائج أن كثافة إشارة الكربوهيدرات والتوزيع المكاني تحسنت بشكل ملحوظ بعد البلورة. يمكن تطبيق هذه طريقة للعينات مع المصفوفات شعبية أخرى، بما في ذلك 2,4,6-تريهيدروكسياسيتوفينوني (تاب) وحمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك. يعمل هذا الأسلوب كنهج عام التي يمكن أن تدمج بسهولة في روتين مختبر لتحليل الكربوهيدرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-نموذج لوحة Preconditioning

  1. تنظيف لوحة عينة
    1. ارتداء القفازات النتريل تجنب تلوث لوحة عينة أثناء التنظيف.
    2. غسل اليد لوحة عينة مع 100.0 مل من محلول التنظيف (1.0 ملغ/مل).
    3. غسل اليد لوحة عينة مع الماء المقطر-منزوع (دو).
    4. أشطف السطح لوحة عينة مع مل 30.0 من ميوه.
    5. وضع لوحة عينة في الكأس 600 مل والتعبئة مع دو حتى لوحة عينة هي مغمورة تماما في الماء.
    6. وضع في الكأس الموجات فوق الصوتية حمام (انظر الجدول المواد) و sonicate لوحة عينة لمدة 15 دقيقة (200 W، 40 كيلو هرتز).
    7. إخراج لوحة عينة وينفخون قطرات الماء باستخدام النتروجين المضغوط.
    8. إيداع ميليلتر 0.2 من ميوه على لوحة عينة للتحقق ما إذا كان ميوه ينتشر إلى مناطق أخرى.
      ملاحظة: إذا ميوه يدمج مع بقع أخرى، كرر الخطوات 1.1.3-1.1.5؛ إذا لم يكن كذلك، انتقل إلى الخطوة التالية.
  2. تنظيم درجة حرارة غرفة التجفيف
    1. استخدام غرفة تجفيف تحت ظروف ثابتة لتجف قطرات، كما هو موضح سابقا11،،من1213. على وجه الخصوص، استخدام الإجراءات المفصلة المبينة في الخطوات 2.1-2.5 من Ou، ي. م. et al. 12بحلول عام 2016. باختصار:
      1. تطهير غرفة التجفيف بالنيتروجين في درجة حرارة الغرفة بمعدل تدفق مستمر للحفاظ على بيئة منخفضة رطوبة النسبية.
      2. الاحتفاظ بعينه لوحة درجة الحرارة الثابتة العادية-(25 درجة مئوية) أو ظروف سريعة الجفاف (50 درجة مئوية)، ينظمها كتلة نحاس التحكم في درجة الحرارة في غرفة التجفيف.
  3. إعداد مصفوفة وأكثر الحلول
    1. إعداد مصفوفة الحلول
      1. حل المجالس الصحية المحلية في 50% الاسيتو الانيتريل (ACN): 50% دو لإعداد حل م 0.1.
    2. إعداد التحاليل الكربوهيدرات
      1. حل SLeA في دو لإعداد حل م 10-4 .
      2. حل MH في دو لإعداد حل م 10-4 .

2-عينة من ترسب والبلورة

ملاحظة: ويرد وصف الإجراءات المحسنة لتحليل كميات صغيرة ومنتظمة من العينات هنا. التأكد من أن درجة الحرارة لوحة عينة استقرت في درجة الحرارة المطلوبة قبل إيداع الحلول. إذا كانت العينة ينتشر على مساحة كبيرة لتغطية البقع عينة أخرى خلال البلورة، إعداد نموذج جديد أو كرر الخطوة 1، 1.

  1. لتحليل كمية صغيرة (0.1 ميليلتر) من عينة
    ملاحظة:     ووضعت الخطوات التالية للتقليل من استهلاك العينة والوقت. ومناسبة للتحليل الكمي لعينات حقيقية مع كمية محدودة أو الرصد السريع للتحليل الكمي.
    1. بريمكس ميليلتر 0.25 حل المجالس الصحية المحلية و 0.25 ميليلتر من SLeA أو حل MH في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    2. دوامة الحل المختلط باستخدام خلاط دوامة 3 s.
    3. تدور أسفل الحل المختلط في أجهزة الطرد مركزي ميني 2 s (2000 x غ).
    4. استخدام ماصة لاستخلاص ميليلتر 0.1 من الحل خلط وإيداعها فورا على لوحة عينة.
      ملاحظة: عند إيداع مبلغ صغير من العينة، لا يبقى الحل خلط في غيض ماصة لأكثر من 10 ق.
    5. الانتظار للحصول على نموذج لتجف. الأوقات التجفيف نموذجي مدرجة في الجدول 1.
    6. استخدام ماصة إيداع ميليلتر 0.2 من ميوه الحق على الفور العينة المجففة. سوف تحصل على العينة الرطب والجاف الفور.
      ملاحظة: ضمان أن يتم إنهاء الإجراء ترسب في 3 s لتجنب خسارة كبيرة التبخر من ميوه.
    7. فحص العينة باستخدام مجهر. إذا لم تكن مورفولوجيس كريستال كالمتوقعة (انظر الشكل 1 على سبيل المثال من النتائج المرجوة)، كرر الخطوات 2.1.1-2.1.6 لإعداد نموذج جديد.
    8. ارتداء القفازات النتريل وعناية تأخذ بها لوحة عينة من غرفة التجفيف.
  2. لتحليل كمية العادية (1 ميليلتر) من عينة
    ملاحظة: الخطوات التالية التي توضع لتحقيق الحد الأقصى من تجانس العينات الكربوهيدرات مع كمية العينة استخدام المستخدمة عادة. هذه العملية مناسبة للروتين والتحليلات الكمية. عملية البلورة توزيع العينات ومصفوفات بالتساوي إلى مناطق أوسع.
    1. بريمكس ميليلتر 2.5 من حل المجالس الصحية المحلية و 2.5 ميليلتر SLeA أو حل MH في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    2. دوامة الحل خلط مع خلاط دوامة ل 5 ق.
    3. تدور أسفل الحل المختلط في أجهزة الطرد مركزي ميني 2 s (2000 x غ).
    4. استخدام ماصة لاستخلاص ميليلتر 1.0 لحل خلط وإيداعها فورا على لوحة عينة.
      ملاحظة: لا استخدام الباقية ممزوجة مسبقاً الحل مرة أخرى بعد إيداع العينات.
    5. الانتظار للحصول على نموذج لتجف. الأوقات التجفيف نموذجي مدرجة في الجدول 1.
    6. استخدام ماصة إيداع 1.5 ميليلتر من ميوه الحق على الفور العينة المجففة. سوف تحصل على العينة الرطب والجاف الفور.
      ملاحظة: الحالات مع درجة حرارة صفيحة العينة عالية (50 درجة مئوية)، ينبغي القيام بالخطوة البلورة داخل 5 s لتقليل تبخر ميوه في تلميح ماصة.
    7. فحص العينة باستخدام مجهر. إذا لم تكن مورفولوجيس كريستال كالمتوقعة (انظر الشكل 1 على سبيل المثال من النتائج المرجوة)، كرر الخطوات 2.2.1-2.2.6 لإعداد نموذج جديد.
    8. ارتداء القفازات النتريل وعناية تأخذ بها لوحة عينة من غرفة التجفيف.

3-كتلة بيانات قياس الطيف الكتلي اقتناء وتحليل

ملاحظة: يتم تنفيذ التحليل استخدام تجارية وقت الطيران جماعي مطياف (جدول المواد) مجهزة باستخدام مصدر أيون. تشغيل برنامج حاسوبي لمراقبة محددة (جدول المواد) الصك مع الأمثل قبل استخراج الطاقة من التأخير والليزر. وتسجل الأطياف في النمط الخطي مع نطاق شامل من m/z = 0 – 1500. لوحة عينة المحتملة هو ±25 كيلو وكل طائفة في المتوسط 10 طلقات الليزر. ينبغي إجراء التحسين الصك وتحليل العينات باستخدام برنامج متوافق مع المستخدمين واتبع إرشادات الشركة المصنعة للصك.

  1. فتح برنامج التحكم الصك (انظر الجدول للمواد).
  2. إدراج لوحة عينة في مطياف كتلة.
  3. حدد أسلوب الحصول على البيانات الأمثل مسبقاً في البرنامج.
  4. سجل منطقة نموذج كامل لبرامج التصوير باستخدام نظام الرصد الدولي (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا لم يفعل نظام الرصد الدولي.
  5. بدء الحصول على البيانات في الوضع الدفعي من برنامج التحكم.
  6. ارسم الصور أيون باستخدام برامج التصوير بعد الانتهاء من الحصول على البيانات.
  7. تحليل الأطياف الشامل باستخدام برمجيات التحليل (انظر الجدول للمواد) إذا كان يتم تسجيل البيانات دون صورة أيون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ممثل وزارة شؤون المرأة صور SLeA مختلطة مع المجالس الصحية المحلية المعدة باستخدام دد وأساليب البلورة تظهر في الشكل 1. مورفولوجيا المجالس الصحية المحلية نموذجية كما أعدت بواسطة الأسلوب DD بلورات كبيرة على شكل إبرة في بريم والهياكل البلورية الجميلة في مركز البقع عينة. هي أطوال النموذجية لمثل هذه البلورات على شكل إبرة ~ 100 ميكرومتر. بعد البلورة من ميوه، قد العينة مساحة أكبر تغطية بالتساوي مع غرامة مثل تقشر بلورات. أطوال بلورات "فليك" تقريبا 20-50 ميكر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عدم تجانس العينة مشكلة حاسمة في استخدام--السيدة DD هو الأكثر استخداماً طريقة إعداد نموذج، ولكن البلورات الناتجة عالية غير متجانسة. وتظهر هذه العينات إمكانية تكرار نتائج ضعف الإشارة تسديده لإطلاق النار وعينه بعينه. ولذلك، البحث عن "الحلو البقع" في مناطق العينة أثناء الحصول على البيانات إجراء مشترك في تجارب استخدام. هذه العينات غير المتجانسة غير صالحة للقياس الكمي في التحاليل الروتينية.

في الدراسة الحالية، وهو الأمثل استخدام عينة مورفولوجيا بالبلورة. تحسن كثافة إشارة الكربوهيدرات واستقرار البيان...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

المؤلفين قد لا شكر وتقدير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >كاشف < / قوي >
مسحوق منظفألكونوكس242985
ميثانولميرك106009
أسيتونيتريلميرك100003
2،5-حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك (DHB) ألفاإيسارA11459
سياليل لويس أ (SLeA< / sup>)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
نصائح الماصةMettler Toledo17005091
أنبوب الطرد المركزيالدقيق AxygenMCT-150-C
Equipment< / Strong>
Milli-Q نظام تنقية المياهMilliporeZMQS6VFT1
قفازات النتريل الخالية من المسحوقMicroflexSU-690
600 مل دورقDuran2110648
منظف بالموجات فوق الصوتيةDeltaDC300H
مقياس الرطوبةWisewind5330
مقياس تدفق غاز النيتروجينDwyerRMA-6-SSV
مزدوجات حرارية من النوعK Digitron311-1670
خلاط دوامةالصناعات العلمية  SI-0236
جهاز طرد مركزي صغيرحدد BioProductsForce Mini   ؛
ماصةRaininpipet-lite XLS
مجهر مجسمأوليمبوسSZX16
غرفة تجفيف يمكن التحكم في درجة حرارتهاهذا المختبر
مطياف الكتلة Ultraflex II TOF / TOFبروكر دالتونيكس
MTP 384 لوحة الهدف من الصلب المصقول BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol الإصدار 3.4Bruker DaltonicsControl
Fleximaging الإصدار 2.1Bruker DaltonicsImaging
Flexanalysis الإصدار 3.4برنامج BrukerDaltonics
برنامج برنامج Analysis

المراجع

  1. Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).
  2. Costello, C. E. Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
  3. Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
  4. Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
  5. Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
  6. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
  7. Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
  8. Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
  9. Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
  10. Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
  11. Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
  12. Ou, Y. -M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).
  13. Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
  14. Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
  15. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MALDI

مقالات ذات صلة