يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اختبار الإصابة بالنبات: الرش والجرح بوساطة التلقيح بمسببات الأمراض النباتية رمادية ماجنابورثي

12.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57675

⸱

أغسطس 4, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application, National Demonstration Center for Experimental Plant Production Education, Beijing University of Agriculture, 2College of Plant Protection, State Key Laboratory of Agrobiotechnology, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Pest Monitoring and Green Management, China Agricultural University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، وضع بروتوكول لاختبار الفوعة النباتية مع مسببات الأمراض النباتية رمادية ماجنابورثي. هذا التقرير سوف تسهم في فحص السلالات من الفطريات المعزولة على نطاق واسع وتكون بمثابة نقطة انطلاق ممتازة لفهم آليات مقاومة النباتات أثناء التربية الجزيئية.

الملخص

نباتات تمتلك نظاما قويا للدفاع عن نفسها ضد التهديدات المحتملة من الفطريات المسببة للأمراض. للنباتات زراعياً هاما، بيد التدابير الحالية لمكافحة مثل هذه الكائنات الممرضة أثبتت متحفظة جداً و، وبالتالي، لا بما فيه الكفاية فعالة، وأنها يمكن أن يحتمل أن تشكل المخاطر البيئية. ولذلك، من الضروري جداً تحديد العوامل المضيفة-مقاومة للمساعدة في مراقبة الأمراض النباتية بطبيعة الحال من خلال تحديد الجبلة الجرثومية مقاومة والعزل وتوصيف جينات مقاومة والتربية الجزيئية من أصناف مقاومة. وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى إنشاء أسلوب تطعيم دقيقة وسريعة وعلى نطاق واسع تولد وتطوير جينات مقاومة النبات. الأرز مسببات الأمراض الفطرية رمادية ماجنابورثي أسباب أعراض المرض شديدة الانفجار، وتسفر عن خسائر. في الآونة الأخيرة، برز رمادية م. ككائن نموذج لدراسة آليات التفاعلات مسببات الأمراض النباتية الفطرية. ومن ثم فنحن تقرير تطوير أسلوب اختبار الفوعة النباتية التي محددة رمادية م. يوفر هذا الأسلوب لتلقيح رذاذ مع تعليق كونديل وجرح التطعيم مع مكعبات الميسليوم أو قطرات من تعليق كونديل. الخطوة الرئيسية من طريقة التطعيم مما أدى إلى جرح يترك الأرز فصل جعل الجروح على أوراق النبات، الذي يتجنب أي التداخل الناجم عن مقاومة الاختراق المضيف. هذا الرش/إصابة البروتوكول يساهم فحص سريعة ودقيقة وواسعة النطاق السلالات المعزولة رمادية م . وهذا متكاملة وأسلوب الإصابة النبات المنتظمة سيكون بمثابة نقطة انطلاق ممتازة للحصول على منظور واسع من القضايا في أمراض النبات.

المقدمة

انفجار الأرز، نجم عن رمادية م.، واحد من أخطر الأمراض لأصناف الأرز في العالم1،2. تتضمن عملية الذي يصيب رمادية م. النباتات المضيفة إنتاج كونيديا ومرفق السطحية، إنبات كونيديا وتشكيل أبريسوريوم، وتشكيل من اختراق الوتد والتمايز هيفا المعدية، وانتشار مرض 3-جميع هذه المراحل شائعة في العديد من سائر النباتات الفطريات المسببة للأمراض، وفي الواقع، فرض حصار أي مرحلة واحدة يمنع عدوى النباتات المضيفة. نظراً لأهميتها الاقتصادية والصوبه الوراثية، برز رمادية م. ككائن نموذج لدراسة الآليات من مسببات الأمراض النباتية الفطرية التفاعلات1،4. ولذلك، دراسة الأساس الجزيئي لهذه المراحل الإنمائية في رمادية م. سيساعد على توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء القدرة الإمراضية الفطرية، وتحديد الجينات المستهدفة المرشحة للفحص وتصميم الرواية 5من مبيدات الفطريات.

وركزت التقارير الأخيرة بشأن الإصابة رمادية م. على الآليات الجزيئية لمراحل ما قبل الإيلاج، خاصة في كونيدييشن وتشكيل أبريسوريوم وأوتاد تغلغل و نمو المعدية3، 6-ولذلك، من الضروري وضع بروتوكول مفصلة لاختبار الإصابة رمادية م . وهنا، نقدم طريقة مفصلة لاختبار إصابة التي تستخدم فحوصات الإصابة بالرش بوساطة مع تعليق كونديل وتلقيح الجروح مع المقابس mycelial من م. رمادية. في هذا التقرير، يركز البروتوكول على ثقافة سلالات، إعداد الحل كونيدياتيون للرش، وتلقيح النباتات مع رمادية M.mycelial التوصيل بوساطة. يتم وصف هذه الخطوات بالتفصيل أدناه، وطريقة عرض تخطيطي عرض سير العمل الكامل للأسلوب وتظهر آفة نموذجية في الأرقام 1 و 2، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-الرش التطعيم مع تعليق كونيديا رمادية م.

  1. الثقافة الفطرية ل M.grisea
    1. إعداد دقيق الشوفان الطماطم أجار (OTA) في مستنبت للسلالات الفطرية.
    2. وزن 30-50 غرام من دقيق الشوفان، هذا إضافة إلى 800 مل من الماء المقطر/منزوع (ddH2س) ويغلي الخليط لمدة 30 دقيقة في وعاء كهربائي.
    3. تصفية عصير الشوفان المغلي في كوب من خلال قطعة من الشاش.
    4. إضافة 150 مل من عصير الطماطم و 20 غراما من أجار إلى فيلتراتي في الكأس وإضافة ddH2س يصل إلى 1,000 مل.
  2. تحضير المواد التجريبية
    1. نقع البذور حوالي 50 من الصنف الأرز (أرز) ليشيانجكسينتوان-هيجو (LTH) في ddH2س د 3 أو نقع بذور الشعير حوالي 50 (السيرة الذاتيةفولغاري شعير وعد الذهبي) في ddH2س لحوالي 1 د.
    2. التفاف بذور الأرز أو الشعير في شاش رطبة وتنبت لهم على ورق الترشيح رطبة في أطباق بتري حوالي 30 التي يبلغ قطرها 10 سم × 10 سم في 28 درجة مئوية. وقت إنبات بذور الأرز حوالي 2-3 د، ووقت إنبات بذور الشعير حوالي 2 د. الرطوبة النسبية في الدفيئة هو حوالي 70%.
    3. زرع شتلات الأرز أو الشعير في الأواني استخدام يعقم بوتينغ التربة والري وثم تغطيتها بطبقة من الفيرميكوليت.
    4. وضع النباتات في glasshouse مناسبة أو نمو مجلس الوزراء في 25 درجة مئوية لحوالي 1 ~ 2 أسابيع.
    5. قص 3 طبقات من ورق الترشيح في الدوائر مع مقص الجراحية المعقمة (يجب أن يكون كل دائرة قطرها 8 سم) ووضعها على لوحات بلاستيكية معقمة 100 مم.
    6. إضافة ddH2س لكل طبق نقع ورق الترشيح.
    7. تأكد من ورق الترشيح تماما الرطب ولكن إضافة لا مياه إضافية.
    8. إزالة أي فائض المياه مع مضخة فراغ.
    9. 2 مكان المسواك العقيمة إلى الطبق الثقافة لدعم الأرز/الشعير يترك؛ الفضاء المسواك ~ 2-3 سم عن بعضها البعض.
    10. جمع أوراق الأرز 2 أسابيع بعد بذر البذور أو أخذ أوراق الشعير د 7 بعد بذر البذور.
    11. استخدام 4-6 أوراق شتلات الأرز/الشعير، قص الجزء السفلي من الساق في ~ 5 سم من الأعلى وجمع الأوراق.
  3. بروتوكول التطعيم رذاذ
    1. الثقافة السلالة الفطرية في لوحات أوتا في حاضنة ترموستاتي (25 درجة مئوية) عن د ~ 4.
    2. إضافة ~ 2 مل من ddH2س استخدام من 0.5-5 مل الماصة لكل لوح عمره 4 أيام.
    3. مع حلقة تطعيم، كشط mycelia سلالة البرية من نوع م. رمادية وسلالة متحولة إلى الحطام mycelia.
    4. جمع الحطام mycelia ونقلها إلى لوحة أوتا جديدة. أخذ الحطام mycelia وضربه الجافة في مقاعد البدلاء نظيفة.
    5. وتغطي اللوحة مع 3 طبقات من الشاش تأمين الرطوبة اللازمة لنمو كونيديا في دفيئة عند 25 درجة مئوية في اليوم (ح 14) و 23 درجة مئوية في الليل (ح 10) ح 24-48.
    6. إضافة 2 مل ddH2س لكل طبق وكشط في كونيديا برفق مع مسحات القطن المعقمة متبوعاً بترشيح من خلال طبقات 2 ورقة العدسة. احرص على عدم خدش سطح المتوسطة الثقافة.
    7. نقل تعليق كونيديا في أنبوب 50 مل جديدة مع 100 1,000 ميليلتر ماصة.
    8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على الأقل من 5,000 ز x عند 25 درجة مئوية.
    9. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه لإعطاء 2 × 104 كونيديا كل مل في نسبة 0.025% (v/v) الحل توين-20. الحل توين-20 عادة حوالي 10-20 مل.
    10. من أجل تعليق بوغ في بخاخ باليد.
    11. التعقيم حوالي 10 مل تعليق كونديل على أوراق الأرز شتلات الأرز منذ 2 أسابيع أو الشعير يترك شتلات الشعير عمره 7 أيام واحتضانها لهم عند 25 درجة مئوية في غرفة مظلمة، والرطبة ل ~ 24 h. رذاذ محطات التحكم مع 0.025% (v/v) الحل توين-20.
    12. نقل الأوراق إلى غرفة رطبة أخرى تحت ضوء الفلورسنت عند 25 درجة مئوية كبيرة ح 12.
    13. تسجيل أعراض المرض في 5 د بعد التلقيح. فحص ريش المريضة الأرز/الشعير ~ 6 سم في الطول. التقييم القياسية وفقا لنظام التسجيل لمقاومة الانفجار من الدولي بحوث المعهد (الأرز). وترد تفاصيل نظام التهديف لمقاومة الانفجار في الجدول 1.
    14. تصوير أوراق لتقييم عدوى السلالات المختبرة. وقيمت العدوى بالعدد الآفات الواحدة 3.6 سم2.

2-إصابة التطعيم مع مكعبات الميسليوم أو قطرات من كونديل تعليق رمادية م.

  1. استخدام إبرة تشريحية، كشط ثلاثة الجروح طويلة 2-3 سم في الأوردة الرئيسية من أوراق منفصلة الأرز/الشعير؛ الحرص على عدم اختراق الأوراق.
  2. وضع أوراق كشط على المسواك والرش 0.02% (v/v) الحل توين-20 على يترك تشكل طبقة من قطرات.
  3. قطع المكونات mycelial 0.5 × 0.5 سم لكل سلالة رمادية م. (السلالات البرية من نوع، متحولة، تكملة، أو غيرها من سلالات الاختبار) من صفيحة أوتا.
  4. وضع المقابس mycelial أو يترك 25 ميليلتر قطرات من تعليق كونيديال على الجرحى واحتضان أوراق عند 25 درجة مئوية في دائرة رطبة د 3-8.
  5. دراسة الآفات في د 5-7 بعد التطعيم. طريقة الفحص هو نفسه كما كان في طريقة التطعيم رذاذ (راجع الخطوة 1.3.13).
  6. فحص ريش المريضة الأرز/الشعير ~ 6 سم في الطول وصورة فوتوغرافية لهم لتقييم عدوى السلالات المختبرة. وقيمت العدوى بالعدد الآفات الواحدة 3.6 سم2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

العمل كله للأسلوب الذي يظهر في الشكل 1. وأجريت فحوصات الإصابة بالنبات على شتلات الأرز عرضه عمرها 14 يوم (cvساتيفا O. CO-39) أو يترك عرضه عمره 7 أيام الشعير (السيرة الذاتيةفولغاري حاء وعد الذهبي)7،،من89. لاختبار لعدوى على أوراق الأرز، وأعدت تعليق كونديل (1.0 × 105 جراثيم مليلتر) من سلالة البرية من نوع رمادية م. P131 وسلالة متحولة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

جينات مقاومة الأمراض النباتية دوراً أساسيا في منع العدوى بمسببات الأمراض، بما فيها مسببات الأمراض الفطرية1،12. انفجار الأرز قد استخدمت كنموذج لفهم طبيعة الهياكل السكانية الممرض وتحديد جينات مقاومة النبات4. ولذلك، من الضروري دراسة مقاومة المرض الوراثي والأنماط الجينية أفيرولينسي من الأصناف الرئيسية من النباتات الزراعية على نطاق واسع تحديد النباتات المقاومة للأمراض التي يمكن أن تزرع باستمرار. وعلاوة على ذلك، تتطلب مزايا الأنماط الجينية أفيرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

أيد هذا العمل مشروع البحث العلمي الخاص لجامعة بكين للزراعة (YQ201603) والمشروع العلمي "اللجنة بكين التعليمية" (KM201610020005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ورق الترشيحالتجارية GE Healthcare (السويد)    10311387
أنبوب 50 ملCORNING (Amercia)430290
جهاز طرد مركزيEppendorf (Amercia)5804R
طبق ثقافةThermofisher (Amercia)150326
0.5-5 مل ماصةEppendorf  ؛ 4920000105
100-1000uL ماصةEppendorf4920000083
مضخة فراغLeyboldD25B
إبرة تشريحFST26000-35
حاضنةMEMMERTPYX313
حلقة التلقيحGreiner Bio One731175
العلامة

المراجع

  1. Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
  2. Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401(2009).
  3. Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
  4. Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
  5. Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
  6. Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
  7. Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
  8. Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
  9. Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
  10. Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
  11. Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430(2016).
  12. Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
  13. Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
  14. Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
  15. Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
  16. Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
  17. Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
  18. Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التلقيح بالرشالمعلق الكونيديالسدادة الميسيليةأوراق الأرز المنفصلةفحص النمط المرضيمرض لفحة الأرزالتفاعل بين الممرض والنبات
اختبار الإصابة بالنبات: الرش والجرح بوساطة التلقيح بمسببات الأمراض النباتية رمادية ماجنابورثي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.