مقالة منهجية

تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

9.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57685

⸱

يونيو 7, 2018

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا يصف لنا طريقة لفصل وإثراء مكونات من ورم المكروية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة في أورام تحت الجلد الراسخة. يسمح هذا الأسلوب لتحليل منفصل من ارتشاح الورم المناعي والكسور الورم غير المتمتعين بالمناعة التي يمكن أن تسمح بتوصيف شامل لورم المكروية محصنة.

الملخص

قد اعترفت مؤخرا وورم المكروية المناعي (الوقت) كوسيط حرجة للاستجابة للمعالجة في الأورام الصلبة، وخاصة بالنسبة إيمونوثيرابيس. التطورات السريرية في العلاج المناعي تسليط الضوء على الحاجة إلى أساليب استنساخه دقة ودقة توصيف الورم وعن التغلغل المناعية المرتبطة بها. ورم الهضم الأنزيمي وتحليل تدفق سيتوميتريك السماح لتوصيف واسع النطاق للعديد من المجموعات الفرعية الخلايا المناعية وتعمل؛ ومع ذلك، هو غالباً ما تكون محدودة عمق التحليل fluorophore القيود المفروضة على تصميم الفريق والحاجة إلى الحصول على عينات الورم كبير لمراقبة السكان محصنة نادرة للفائدة. وبالتالي، قمنا بتطوير طريقة فعالة وعالية إنتاجية لفصل وإثراء ارتشاح الورم المناعي من مكونات الورم غير المتمتعين بالمناعة. وصف الورم الهضم والطرد المركزي القائم على كثافة الفصل تقنية يسمح توصيف منفصلة للورم والورم الكسور ارتشاح محصنة ويحافظ على استمرارية الخلوية، ويوفر بالتالي، وصف واسع للورم الدولة المناعية. تم استخدام هذا الأسلوب لتميز التغايرية محصنة المكانية واسعة النطاق في الأورام الصلبة، مما يدل على زيادة الحاجة إلى تقنيات التنميط المناعية الورم كله متسقة. وبوجه عام، يوفر هذا الأسلوب طريقة فعالة وقابلة للتكيف لتوصيف المناعية تحت الجلد من الأورام الصلبة مورين؛ على هذا النحو، يمكن استخدام هذه الأداة لأفضل تميز ميزات مناعية الأورام وفي التقييم السريري لاستراتيجيات إيمونوثيرابيوتيك الرواية.

المقدمة

الوقت القمعية تم الاعتراف مؤخرا باعتباره السمة مميزة للسرطان، ومن المعروف أن تلعب دوراً هاما في التنمية والتقدم، والحماية من السرطانات الصلبة الورم، فضلا عن التخفيف من تعرضها للعلاج المناعي1. الساعة تتكون من العديد من المجموعات الخلوية وتعمل، كلها توفر الحرجة من التبصر في الحالة المناعية للورم. يمكن أن تكون هذه المجموعات الفرعية المناعية طبقات كذلك في خلايا لمفاويات أو النقوي المنشأ، التي تشكل معا الغالبية من الاستجابات المناعية الفطرية وتكيفية2،3. التطورات الحديثة في مجال العلاج المناعي السرطان أظهرت أن استراتيجيات إيمونوثيرابيوتيك (أي نقطة تفتيش محصنة ضد مثبطات، مستضد تشيميريك مستقبلات الخلايا التائية، إلخ) لديها القدرة على حمل السرطان دائم التراجعات؛ ومع ذلك، تظل غير فعالة نسبيا في الأورام الصلبة السرطانات4،5. مجموعات عديدة أظهرت عقبة حاسمة أن الوقت يمكن أن تلعب على العلاج نجاحا6،7، وهكذا، تظل هناك حاجة تقييم دقيق إيمونوثيرابيس جديدة في الإعداد قبل الإكلينيكية تركز بالتحديد على ما القدرة على تعديل أو التغلب على الساعة8.

الجهود الحالية لوصف الوقت عادة ما تستخدم أما الفحص المجهري أو التدفق الخلوي جنبا إلى جنب مع جسم وسم استراتيجيات لتحديد مجموعات فرعية الخلوية المناعية وبها ميزات9،10. هاتين الاستراتيجيتين معلومات فريدة مختلفة، كما مجهرية تسمح التقدير المكاني لمجموعات فرعية الخلوية والتدفق الخلوي يوفر إنتاجية عالية والكمي الأوسع نطاقا للتغيرات الخلوية. على الرغم من التحسينات الأخيرة في فلوري immunohistochemistry متعدد تحسين نظم التصوير الطيفي، التي يمكن أن تدعم الآن المعلمات يصل إلى 7، الفريق محدودة الحجم صعوبة مستوى واسع محصنة ضد التنميط وهكذا هذا الأسلوب غالباً ما محفوظة لأكثر ركزت التحليلات. نتيجة لذلك التدفق الخلوي لا تزال واحدة من الأكثر استخداماً المناعة التنميط تقنيات. وعلى الرغم من استخدامه على نطاق واسع في توصيف الوقت، الأساليب المستخدمة لتجهيز وتلطيخ متغير تماما. استخدام البروتوكولات في أغلب الأحيان ورم الناي بإنزيم (أي، collagenases، الدناز، إلخ) وأساليب تفارق اليدوي لتحقيق تعليق خلية واحدة، تليها تلطيخ وتحليل جسم7. وعلى الرغم من مزايا كل طريقة، أظهرت العديد من الجماعات تباين واسعة النطاق التي يمكن أن يتسبب من خلال هذه التقنيات11. وهذا يجعل المقارنات عبر دراسة الأورام المكروية التنميط صعبة للغاية، حتى عند تقييم الورم مورين نفس النموذج. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب توفير إمكانات محدودة لتقييم الورم الخلوية والمناعية الورم التسلل المكونات بشكل مستقل، حيث يتخلل كل المكونات بعد الهضم. كمية العينة ثم يحد تلطيخ لوحة متعددة والتحليل الذي يصبح موضوعا رئيسيا عند محاولة لوصف مجموعات فرعية المناعية النادرة (أي الخاصة باستئصال ورم الخلايا التائية)12. تقنيات أكثر حداثة مثل الخلوي الشامل، أو الخلوي بوقت الرحلة (سيتوف)، يسمح بتحليل المظهرية عالية ثلاثي الأبعاد لمجموعات فرعية الخلوية مع بعض النظم التي تدعم تصميمات لوحة أكبر من المعلمات المستقلة 4213. على الرغم من قوة هائلة من التكنولوجيا سيتوف في التنميط المناعي، لا يزال محدودا بسبب المصروفات وتحليل الخبرات والحصول على المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتوكولات سيتوف يوصي بتنقية محصنة ضد مجموعات فرعية لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء14، وهكذا فإننا نقترح أن لدينا طريقة تخصيب اليورانيوم يمكن أن تستخدم المنبع سيتوف التحليل لتحسين نوعية البيانات.

هذه الوثيقة يصف لنا وجود ورم المكروية الهضم وتحليل الأسلوب الذي يشتمل على الورم المناعي التسلل الانفصال. والغرض من هذا الأسلوب هو السماح المستقلة الفائق التنميط المناعي ارتشاح الورم والورم كسور الخلوية لتوصيف أوسع نطاقا من ورم المكروية. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن كذلك أن تبرهن على أهمية إجراء تحليل الورم كله، كما تبين أن تغايرية مهمة المناعية المكانية لنموذج الأورام صلبة تحت الجلد. عموما، هذا الأسلوب أكثر دقة واستمرار مقارنة بين عينات لأنه يثري لمجموعات فرعية الخلوية المناعية داخل الورم ويسمح للتنميط مستقلة من خلية الورم والكسور محصنة من ورم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "كلية بايلور للطب".

1-الورم الحصاد والهضم

ملاحظة: الوقت اللازم للحصاد ~ 3-5 دقائق/الورم، والوقت اللازم لتجهيز ~ 1 ح + 2-3 دقيقة/الورم.

  1. Euthanize الفئران باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون، ورذاذ كل الماوس لأسفل مع الإيثانول 70% قبل الحصاد لمنع تلوث الشعر. جراحيا إزالة أورام تحت الجلد من الفئران والتأكد من وجود الأورام خالية من أي أنسجة ملوثة (أي، الشعر، والجلد، والصفاق، إلخ). ضع كل ورم في 1.8 مل من قاعدة الوسائط ربمي-1640 دون الجنين المصل البقري (FBS) في لوحة 24-جيدا. لحصاد أكبر، تبقى لوحات الباردة على الجليد للمحافظة على استمرارية الخلوية.
    ملاحظة: إذا كان مطلوباً العقم، سوف تحتاج كل ورم تشريح المراد تنفيذها في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع تعقيم الأدوات الجراحية (أي، مقص، ملقط، إلخ)، فضلا عن أي خطوات أخرى. الأورام مع قطر أطول بين 0.5-1 سم الأمثل، وسيتطلب أورام أكبر أو أصغر مقياس من الكواشف.
  2. استخدام مقص لقطع الأورام إلى أقل من 1 ملم3 قطعة داخل كل بئر.
  3. إعداد 10 × كوكتيل الهضم بتذويب كولاجيناز الأول في 10 ملغ/مل، كولاجيناز الرابع في 2,500 يو/مليلتر، والدناز أنا في 200 يو/مليلتر في قاعدة الوسائط RPMI 1640 (دون FBS).
    ملاحظة: هضم كوكتيل يمكن إعدادها في يوم في وقت مبكر والمخزنة في-20 درجة مئوية؛ ومع ذلك، لا ينصح بمخزن لفترات طويلة كما سوف تفقد الإنزيمات النشاط مع مرور الوقت مرة حله.
  4. إضافة 200 ميليلتر من 10 × كوكتيل الانفصال الذي يتضمن كولاجيناز الأول والرابع كولاجيناز والدناز الأول لكل بئر بالقطع3 1 مم.
  5. تسمح العينات لهضم ح 1 في 37 درجة مئوية بينما تهز طفيفة عند استخدام شاكر لوحة مدارية دورة في الدقيقة 60-100.
    ملاحظة: قد يؤدي ارتفاع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية خلال عملية الهضم الأنزيمي تنشيط الخلايا المناعية.
  6. بعد ح 1، تحييد رد فعل بإضافة 1 مل الإعلام RPMI 1640 تستكمل مع 5% يدتا FBS ومم 2 لكل بئر.
  7. "الماصة؛" هضم الورم والورم القطع المتبقية إلى مصفاة خلية 40 ميكرومتر يجلس على رأس أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
    ملاحظة: قطع طرف الخروج من طرف ماصة 1 مل لنقل أسهل لهضم الورم المصفاة.
  8. استخدام المكبس حقنه 10 مل لتصنيف القطع الورم ميكانيكيا من خلال المصفاة. شطف في المصفاة مع 2 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل دورياً (التي تحتوي على 5% FBS) وكرر حتى مصفاة خلية الواضح للورم.
    ملاحظة: حوالي 4-10 مل من مجموع وسائل الإعلام ينبغي أن تكون كافية شطف على نحو كاف المصفاة للورم.
    ملاحظة: وضع العينات في الثلج حتى يتم إكمال هذه الخطوة لجميع العينات للحفاظ على استمرارية الخلوية.
  9. ضبط كل أنبوبة الطرد المركزي 50 مل على نفس وحدة التخزين باستخدام وسائط RPMI 1640 تستكمل.
    ملاحظة: تعديل حجم حاسم بالنسبة لموازنة أجهزة الطرد المركزي. تخطي هذه الخطوة يمكن أن يؤدي تلف أجهزة الطرد المركزي أو الإصابة الشخصية.
  10. الطرد المركزي من تعليق خلية (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل سوبيرناتانتس، وإعادة تعليق في 2 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل.
    ملاحظة: مجموع خلايا يمكن أن تشكل بعد الطرد المركزي أن من الصعب على ريسوسبيند. استخدام ماصة 5 مل المصلية ومزيج سريعاً للخروج عنه قبل المتابعة.

2-الفصل بين كسور الخلوية المناعية والورم

ملاحظة: الوقت اللازم لهذه الخطوة حوالي 1 ح.

  1. أضف 3 مل من الكثافة المتوسطة الانحدار إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إعداد وتسمية أنابيب كافية لكل الورم.
  2. الطبقة 2 مل تعليق خلية ورم فوق المتوسطة الكثافة التدرج قبل بيبيتينج ببطء أسفل الجانب من أنبوب لمنع الاختلاط من الطبقتين.
  3. بعناية بوضع أنابيب الطبقات في أجهزة الطرد المركزي وتدور لمدة 20 دقيقة في 805 س ز، 20 درجة مئوية، مع لا الفرامل.
    ملاحظة: من المهم جداً للتحقق من موازنة سليمة وضمان أن يستخدم لا الفرامل أثناء الطرد المركزي. أي تعطيل لهذه العملية سيؤدي إلى خلط طبقة، وسيكون من الصعب استعادة عينة كاملة.
  4. نقل الورم تسلل الكريات البيض (سمسم) طبقة وطبقة أعلى وسائل الإعلام إلى أنبوب 15 مل جديدة استخدام ماصة نقل بعناية. تجاهل كافة المتبقية الكثافة المتوسطة التدرج وريسوسبيند بيليه ورم في الجزء السفلي من الأنبوب في 2 مل 1640 RPMI تستكمل.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي سيكون هناك أربع طبقات مرئية من الأعلى إلى أسفل التي تقابل على التوالي: تيلس والمتوسطة الكثافة المتدرجة، وسائل الإعلام والورم خلية بيليه. انظر الشكل 2A على سبيل مثال من مختلف الطبقات.
  5. الطرد المركزي سمسم حد سواء وعينات الورم في فصل أنابيب (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية.
  6. ريسوسبيند العينة سمسم في 200 ميليلتر وبيليه ورم في 2 مل من وسائل الإعلام RPMI 1640 تستكمل. الحفاظ على الجليد للمحافظة على البقاء.

3-الطلاء والتلوين

ملاحظة: الوقت اللازم للطلاء هو 30 s/الورم؛ الوقت اللازم لتلطيخ السطح ح 1؛ الوقت المطلوب لتلطيخ داخل الخلية 40 دقيقة؛ الوقت اللازم لتحليل التدفق الخلوي هو 1-4 دقيقة/الورم.

  1. إعداد وحساب التسمية 96-جيدا U-أسفل لوحة لكل المناعي تلطيخ لوحة وصفيحة إضافية للخلية.
    ملاحظة: بشكل عام، تعد ثلاث لوحات في المجموع: لوحة لوحة تركز على اللمفاويات ولوحة لوحة تركز على النقوي لوحة عد خلية.
  2. الكوة لوحة تعليق خلية واحدة في كل من تلطيخ لوحات ووحدة تخزين محددة في لوحة العد.
    ملاحظة: يتم استخدام لوحة count لحساب إجمالي عدد الخلايا إضافة إلى كل لوحة المصبوغة، مما يسمح لتعداد السكان خلية دقيقة. Cytometer تدفق مع قدرات لوحة 96-كذلك أخذ العينات والتحليل الحجمي يمكن تقديم العدد الخلايا كل ميليلتر في كل عينة، وذلك، حساب عدد الخلايا التي تضاف إلى كل لوحة المصبوغة. يمكن الحصول على لوحات العد في اليوم التالي بعد تثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، الشطف مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 2% FBS)، وريسوسبيندينج في تعيين حجم المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
  3. تغسل الخلايا مرتين مع 200 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) كل عينة من سينتريفوجينج (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية بين كل شطف لإزالة أي FBS مجاناً.
  4. إضافة 50 ميليلتر من كتلة Fc، تخلط العينات باستخدام ماصة متعدد القنوات، واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. إضافة 50 ميليلتر من 2 x يتركز خارج الخلية جسم الاستهداف وخليط وصمة عار صلاحية يمكن حلها، ماصة متعدد القنوات استخدام مزيج، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في الرايت أو 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: المصبوغة الظروف الدقيقة للأجسام المضادة تعتمد على إرشادات الشركة المصنعة. يجب أن يكون تخفيف المصبوغة جميع دببس، مع لا FBS إضافة منع تشبع صبغ صلاحية يمكن حلها. يرجى الاطلاع على الجدول للمواد والمعدات لتخفيف الأمثل للفريق المصبوغة المستخدمة في هذه المخطوطة. الأجسام المضادة ويمكن حلها صلاحية تلطيخ الحل مستعدة بتركيز 2 x لتقديم 1 نهائي x تلطيخ التركز في 100 ميليلتر من إجمالي حجم المصبوغة عند إضافة إلى كتلة Fc.
  6. تغسل العينات مرتين مع نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت سينتريفوجينج (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل supernatants بين كل الشطف.
  7. ريسوسبيند في 200 ميليلتر من 1 × حل التثبيت/بيرميبيليزيشن واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: هذه التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً بين عشية وضحاها في هذه المرحلة: الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  8. وفي اليوم التالي الطرد المركزي اللوحات (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية) وتجاهل المادة طافية.
  9. يشطف مرة واحدة مع 200 ميليلتر من 1 × permeabilization المخزن المؤقت، وأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية)، وتجاهل المادة طافية.
  10. إضافة 100 ميليلتر 1 x تركيز الأجسام المضادة داخل الخلايا المصبوغة الفريق أعد في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن س 1 واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في الرايت أو 4 درجة مئوية (وهذا يتوقف على توصيات المصبوغة من الشركة المصنعة).
  11. شطف بمجرد تجاهل المخزن المؤقت (5 دقائق، 805 س ز، 4 درجة مئوية)، مع بيرميبيليزيشن 1 x المادة طافية، وشطف لمرة ثانية مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني مع 2% FBS).
  12. ريسوسبيند العينات في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني مع 2% FBS) ونقل العينات إلى أنابيب التدفق الخلوي، والقيام بتحليل التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نتائجنا تثبت فائدة كبيرة سمسم انفصال مكونات الورم غير المناعية، كما هو موضح في البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الأسلوب وصف نظهر التغايرية مناعية هامة من الأورام الصلبة الراسخة.

مشكلة كبيرة مع العديد من تقنيات تفارق الورم هو فقدان صلاحية العينة، في أغلب الأحيان نتيجة لظروف قاسية الهضم (أي، ارتفاع درجات الحرارة، وعدم كفاية الإمداد بالمواد الغذائية، إلخ). استخدام الأسلوب وصف الهضم، مع أو دون كثافة تخصيب متوس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الوقت تتألف من المكونات الخلوية المتنوعة والمعقدة والجزيئات. تشير الدلائل الأخيرة إلى أن توصيف دقيق لهذه البيئة يمكن توفير فهم أفضل للعلاج النجاح أو الفشل، وحتى تساعد في التعرف على آليات المقاومة العلاجية. على سبيل المثال، يمكن زيادة مستويات intratumoral الخلايا المثبطة للمناعة المختلفة (أي، مدسكس، والخلايا التنظيمية تي، إلخ) التخفيف من الاستجابات المناعية المستجيب وتلغي آثار إيمونوثيرابيوتيك. من ناحية أخرى، يمكن أن تكون زيادة تواجد intratumoral المستجيب محصنة ضد السكان (مثلاً، الخاصة بالورم CD...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وتسلم جمن الدعم المالي المقدم من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (T32GM088129) والمعهد الوطني لطب الأسنان والجمجمة البحوث (F31DE026682) كل من "المعاهد الوطنية للصحة". المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة". بتأييد هذا المشروع أيضا بالخلوي والخلية الأساسية الفرز في "كلية بايلور للطب" بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (P30 AI036211 و P30 CA125123 و S10 RR024574) ومساعدة الخبراء من جويل م. سيديرستروم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
من 6 إلى 12 أسبوعا ذكر C57BL / 6 فئرانمختبر جاكسون  الفئران غير المتوفرةالمستخدمة في دراساتنا السرطانية
MEER Murine Syngeneic Cancer CellAcquisition from collaborator N / AE6 / E7 مستضد فيروس الورم الحليمي البشري يعبر عن خط الخلايا السرطانية الظهارية للوزتين الفئران   ؛
70٪ كحول الأيزوبروبيل  EMD Milipore PX1840
مجموعة الأدوات الجراحية للفأرPrecision Instrumentsفي المقام الأول فقط إلى مقص وملاقط ومشرط.
لوحة 24 بئر  شركة دينفيل العلميةT1024أو أي لوحة سفلية مسطحة 24 بئر.
RPMI-1640 وسائل الإعلامSigma-AldrichR0883
Collagenase I EMD Milipore234153
Collagenase IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNase I & nbsp ؛سيجما ألدريتش11284932001
شاكر مداري منخفض السرعةBioExpress (المورد: Genemate)  S-3200-LSأو أي شاكر مداري.
حاضنة التنظيم الحراريفيشر Scientific13-255-27أو أي حاضنة أخرى منظمة حراريا
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 مل ماصة ونصائحEppendorf13-690-032أو أي ماصة ونصائح
أخرى 40 ميكرومتر مصافي خليةفيشر 22363547
50 مل أنابيب الطرد المركزي دينفيلالعلميةC1062-P
15 مل أنابيب مخروطية دينفيلالعلميةC1012
10 مل Luer-Lok حقنة بدون إبرBD309604
كثافة Lymphoprep التدرج متوسطتقنيات STEMCELL7811
نقل ماصاتDenville Scientific Inc.P7212
96 بئر U-أسفل لوحاتDenville Scientific Inc.
DPBSSigma Aldrich D8573
FoxP3 مجموعة العازلة لعامل النسخ  ThermoFisher Scientific00-5523-00Fix / Permeabilization Buffer و Permeabilization
Eppendorf   ؛5810 R
Attune NxT مقياس التدفقالخلوي ThermoFisher Scientific N/ Aللعد الحجمي للخلايا 96 بئر   ؛
منقى الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32 (الماوس BD Fc Block)   استنساخ 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE / DEAD Fixable Blue Dead Dead Stain Kit ، لإثارة الأشعة فوق البنفسجيةThermoFisher ScientificL34962بقعة قابلة للإصلاح
CD45 الجسم المضاد أحادي النسيلة (30-F11) ، APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
TCR بيتا الجسم المضاد أحادي النسيلة (H57-597) ، APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8- & ألفا; الجسم المضاد (KT15) ، PEسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-53473   ؛
المضاد أحادي النسيلة CD4 (GK1.5) ، PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0041-81
معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية (I / I-E) الجسم المضاد أحادي النسيلة (M5 / 114.15.2) ، Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
CD11c الجسم المضاد أحادي النسيلة (N418) ، PE-Cyanine5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4 / 80 الجسم المضاد أحادي النسيلة (BM8) ، eFluor 450ThermoFisher Scientific48-4801-80
CD11b الجسم المضاد أحادي النسيلة (M1 / 70) ، APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (RB6-8C5) ، PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1 ، B7-H1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (MIH5) ، PE-Cyanine7ThermoFisher Scientific25-5982-80
CD273 (B7-DC) الجسم المضاد أحادي النسيلة (122) ، PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Ki-67 الجسم المضاد أحادي النسيلة (B56) ، BV711BD Biosciences563755
World تحتاج Buffer الجسم

المراجع

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
  5. Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106(2016).
  6. Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
  7. Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
  8. Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
  9. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  10. Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  11. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  12. Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
  13. Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
  14. Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
  15. Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD45

مقالات ذات صلة