مقالة منهجية

أسلوب بسيط واستنساخه تحضير عينات الغشاء من الفئران المعزولة حديثا ميكروفيسيلس الدماغ

DOI:

10.3791/57698

⸱

مايو 7, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد هنا، وسيلة لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء. هذا البروتوكول له ميزة واضحة لإنتاج ميكروفيسيل المخصب العائد مع البروتين مقبول عينات من الحيوانات الفردية. ثم يمكن استخدام عينات لتحليل البروتين قوية في البطانة ميكروفاسكولار الدماغ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) من أنسجة حيوية حاجز الذي يستجيب لمختلف المثيرات الفيزيولوجية المرضية والدوائية. هذه التغييرات الناتجة عن هذه المحفزات يمكن إلى حد كبير تعدل إيصال المخدرات إلى الدماغ، واستطراداً، يسبب تحديات كبيرة في علاج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض. التغيرات BBB الكثيرة التي تؤثر على العلاج الصيدلاني، تنطوي على البروتينات التي هي مترجمة وأعرب على مستوى الخلايا البطانية. في الواقع، هذه المعرفة في علم وظائف الأعضاء BBB في الصحة والمرض أثارت اهتماما كبيرا في دراسة هذه البروتينات الغشاء. من وجهة نظر بحوث علوم أساسية، وهذا يعني الحاجة إلى طريقة بسيطة ولكنها قوية واستنساخه لعزل ميكروفيسيلس من أنسجة المخ حصادها من الحيوانات التجريبية. بغية إعداد عينات غشاء من ميكروفيسيلس طازجة معزولة، من الضروري أن الاستعدادات عينة أثري في خلايا بطانية لكن يقتصر حضور أنواع الخلايا الأخرى لوحدة نيوروفاسكولار (أي، أستروسيتيس، ميكروجليا، والخلايا العصبية، بيريسيتيس). ميزة إضافية هي القدرة على إعداد عينات من الحيوانات الفردية من أجل التقاط التغير الحقيقي التعبير البروتين في حالة سكان تجريبية. في هذه المخطوطة، ترد تفاصيل فيما يتعلق بطريقة التي تستخدم لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء. تخصيب ميكروفيسيل، ومن العينات المستمدة، يتحقق باستخدام أربع خطوات استخدام الطرد المركزي حيث يتم تضمين ديكستران في المخزن المؤقت للعينة. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة بمختبرات أخرى للتطبيقات الخاصة بهم. وقد أظهرت العينات التي تم إنشاؤها من هذا البروتوكول أن تسفر عن بيانات تجريبية قوية من البروتين تحليل التجارب التي يمكن أن تساعد إلى حد كبير فهم الاستجابات BBB للمنبهات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية والدوائية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاجز الدم في الدماغ (BBB) موجود في مجال التفاعل بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) والدوران الجهازي وتلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على التوازن في الدماغ. على وجه التحديد، مهام BBB دقة التحكم ذائبة التركيزات في الدماغ السائل خارج الخلية وكفاءة توفير تلك العناصر الغذائية المطلوبة بواسطة أنسجة المخ للوفاء بمطالب الأيضية كبيرة الجهاز العصبي المركزي1. هذه الأدوار يعني أن بي بي بي، القائم أساسا على مستوى الخلية البطانية microvascular، يجب أن تمتلك الآليات المنفصلة التي تمكن بعض المواد للوصول حمة الدماغ مع ضمان أن لا يمكن أن تكون ضارة xenobiotics تتراكم. في الواقع، خلايا الدماغ بطانية ميكروفاسكولار ليست فينيستراتيد ويحمل pinocytosis محدودة، مما يضمن عدم نفاذية غير انتقائية2. بالإضافة إلى ذلك، أعرب خلايا المخ ميكروفيسيل بطانية البروتينات مفرق ضيق مفرق وأدهيرينس أن تتصرف بشكل مادية "ختم" بين الخلايا المتجاورة بطانية وتقيد إلى حد كبير باراسيلولار نشر المواد المنقولة بالدم في الدماغ حمة. في الواقع، يتطلب انتقائية نفاذية المواد الداخلية والخارجية للتعبير الوظيفي من الناقلين الإقبال وافلوكس3. تقاطعات عموما، ضيق، والوصلات أدهيرينس والناقلين العمل يدا واحدة للحفاظ على خصائص فريدة من نوعها الحاجز بي بي بي.

BBB هو حاجز حيوي الذي يستجيب للمنبهات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية والدوائية. على سبيل المثال، الإجهاد نقص/ريوكسيجينيشن قد ثبت أن تعدل تعبير البروتينات مفرق ضيق الحرجة (أي، أوككلودين، زونولاي أوككلودين-1 (زوي-1))، الذي يرتبط مع باراسيلولار زيادة نفاذية لعلامات الأوعية الدموية مثل كما السكروز4،،من56. ملاحظات مماثلة بذلت في بي بي بي في الإعداد للدماغ إصابة7 و8،الألم التهابات الطرفية9. يمكن أيضا أن تعدل هذه الأمراض نفس آليات النقل في BBB10،11،12،،من1314. والواقع أن يعزز إصابة نقص/ريوكسيجينيشن التعبير الوظيفي للعضوية شاردة نقل 1a4 ببتيد (Oatp1a4) في بي بي بي، الذي يمكن أن يؤدي إلى زيادات كبيرة في نقل الدم إلى الدماغ من ركائز النقل أواتب محددة مثل توروتشولاتي واتورفاستاتين13. ويمكن أيضا تغيير خصائص BBB بالعلاج الصيدلاني نفسه، إليه التي يمكن أن تشكل أساسا لكل التغيرات العميقة في فعالية العقاقير في الدماغ والتفاعلات المخدرات-المخدرات. على سبيل المثال، أسيتامينوفين أهداف مستقبلات النووية آليات إرسال الإشارات في خلايا الدماغ بطانية microvascular، يزيد التعبير الوظيفي للناقل efflux الحرجة فبروتين سكري (ف-gp)، ويعدل التسكين تعتمد على الوقت يمنحها المورفين، المخدرات مسكن افيوني والمنشأة فسباق الجائزة الكبرى والنقل الركازة15. فهم دقيق للتغيرات BBB، الذي يمكن أن يتسبب بالأمراض أو بالمخدرات، كما يتطلب تحديد وتوصيف الآليات التنظيمية المحددة التي تتحكم في هذه التعديلات. وفي الواقع، قد حددت مسارات الإشارات المنفصلة في خلايا بطانية microvascular الدماغ التي تتحكم في التعبير الجزيئي من مفرق ضيق البروتينات16،17 ومتعهدي النقل15، 18،19. وتشير هذه الملاحظات مجتمعة إلى أن مسارات جزيئية معقدة تشارك في تنظيم تقاطعات ضيق BBB والناقلين في الصحة والمرض.

تحديا كبيرا في دراسة BBB هو الشرط المطلق لطريقة بسيطة وفعالة لعزل ميكروفيسيلس من أنسجة المخ المستمدة من الحيوانات التجريبية وإعداد عينات الغشاء اللاحقة. يجب أن يكون مستعدا هذه العينات حيث أن هي على حد سواء أثرت في خلايا الدماغ بطانية ميكروفاسكولار ومحدودة في وجود أنواع الخلايا الأخرى. على مدى السنوات العديدة الماضية، أبلغ عن منهجيات متعددة لعزل ميكروفاسكولاتوري من الدماغ القوارض في المؤلفات العلمية13،20،،من2122. توضح هذه المقالة بسيطة، قوية، وأسلوب استنساخه لعزل ميكروفيسيلس من الدماغ الفئران وإعداد عينات غشائي غشاء عالي التخصيب التي يمكن استخدامها لتحليل التعبير البروتين. ميزة هذا البروتوكول العزلة ميكروفيسيل هو القدرة على الحصول على عينة الاستعدادات ذات جودة عالية ومع كافية البروتين العائد من الحيوانات تجريبية فردية. وهذا يتيح النظر في التفاوت بين الحيوانات في التعبير البروتين. مثل سلفه في هذا البروتوكول قد تحسنت كثيرا على متانة الدراسات بي بي بي لأنه يمكن الآن تجنب الإفراط في تقدير (أو بخس التقدير) من الحجم الحقيقي للتغييرات البروتين في بي بي بي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إدراج عدة خطوات استخدام الطرد المركزي مع ديكستران تخصيب محسنة من ميكروفيسيلس في العينات التجريبية بينما يسهل إزالة المكونات الخلوية غير المرغوب فيها مثل الخلايا العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات المذكورة أدناه عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) وتتفق مع المعاهد الوطنية للصحة (NIH) و "البحوث الحيوانية": فيفو في تجارب (سيصلون) المبادئ التوجيهية للإبلاغ. تدفق الإجرائية للبروتوكول هو مبين في الشكل 1.

1-الإعداد لإجراء

  1. إعداد المخزن المؤقت ميكروفيسيل الدماغ (BMB). ابدأ بوزنها 54.66 ز د-المانيتول، ز 1.90 عطا، وقاعدة 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (أي تريس) ز 1.46 في كوب نظيف. إضافة 1.0 لتر مياه. خلط مكونات BMB المخزن المؤقت باستخدام محرض مغناطيسية. بمجرد الحل قد تم خلطها بشكل تام، ضبط ال pH إلى 7.4 استخدام 1.0 M HCl.
  2. تحضير محلول ديكستران (75,000 ميغاواط) 26% (w/v) قبل أنيسثيتيزينج الحيوانات. إعداد الحل ديكستران كما هو موضح في الخطوات التالية.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يعد هذا الحل قبل الموعد المحدد لأنه يمكن أن يستغرق ديكستران حوالي 1.5-2 ح تذوب في المخزن المؤقت مائي.
    1. تزن من ديكستران مسحوق (26 غرام لكل 100 مل المخزن المؤقت) في كوب نظيف.
    2. قياس حجم المناسبة BMB والاستغناء عن داخل دورق منفصلة، ونظيفة.
    3. صب ببطء BMB في الكأس التي تحتوي على مسحوق ديكستران. مزيج ديكستران المجفف يدوياً أثناء صب BMB استخدام قضيب تحريك زجاج.
    4. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع 1.0 M HCl السابقة مباشرة لاستخدام.
      ملاحظة: عزل نموذجية من ميكروفيسيلس الدماغ من 12 من الفئران سبراغ داولي الفردية (ذكرا كان أو أنثى؛ 3 أشهر عمر؛ 200-250 غم) يتطلب 200 مل من محلول ديكستران (أي، ديكستران ز 52 في 200 مل BMB).

2-استخراج أنسجة المخ من الفئران سبراغ داولي

  1. بعد العلاج التجريبي المرجوة، تخدير الفئران سبراغ داولي استخدام الكيتامين (50 مغ/كغ؛ القائمة 2.5 مل/كغ) وإكسيلازيني (10 ملغ/مل؛ 2.5 مل/كغ الأول، ف.). تضعف من الكيتامين وإكسيلازيني في المحلول الملحي 0.9 في المائة إلى تركيزات النهائي من 20 ملغ/مل و 4.0 ملغ/مل على التوالي. Euthanize الحيوانات بقطع الرأس باستخدام مقصلة شحذ وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك. استخدام نفس الإجراء لكل من الذكور والإناث من الفئران سبراغ داولي.
  2. يرسخ الجلد من الجمجمة الفئران بصنع قطع عرضية واحدة باستخدام مقص جراحي.
  3. باستخدام رونجيورس، بعناية إزالة لوحة الجمجمة وكشف الدماغ.
  4. إزالة الدماغ باستخدام ملعقة. فصل في المخ وأنسجة المخ معزولة في أنبوب 50 مل مخروطية التي تحتوي على 5 مل BMB. إضافة ميكروليتر 1.0 من مثبطات البروتياز كوكتيل كل مل 1.0 BMB المخزن المؤقت فورا قبل الاستخدام.

3-تجهيز الدماغ

  1. نقل أنسجة المخ من أنبوب مخروطي 50 مل إلى طبق بتري نظيفة.
  2. استخدام الملقط، لفة بلطف الدماغ على ورق الترشيح قطرها 12.5 سم لإزالة السحايا الخارجي، الذي فضفاضة التقيد بقشرة الدماغ. اضغط أنسجة المخ ضد تصفية الورق برفق ودحر الأنسجة مرة أخرى. تحويل ورقة تصفية كثيرا أثناء هذه الخطوة.
  3. فصل الضفيرة شرويد من نصفي الكرة الدماغي استخدام الملقط.
    ملاحظة: يظهر الضفيرة شرويد كنسيج غشائي واضحة مترجمة إلى سطح البطينين الدماغي.
  4. بلطف تسطيح أنسجة المخ وإزالة السحايا والمصابيح شمي استخدام الملقط المتبقية.
  5. وضع أنسجة المخ القشرية في هاون زجاج مبردة. إضافة مل 5.0 من BMB مثبط البروتياز المحتوية على الكوكتيل بقذائف الهاون.
  6. باستخدام الخالطون الكهربائية علوية، مجانسة أنسجة المخ باستخدام 15 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية 3,700 لفة في الدقيقة. إجراء تجانس استخدام طاحونة أنسجة مل 10 قذائف هاون ومدقة. بين تجانس كل عينة فردية، قم بتنظيف مدقة استخدام الإيثانول 70%.
    ملاحظة: التجانس السكتات الدماغية ينبغي أن تكون متسقة من حيث وتيرة وحجم.
  7. من أجل هوموجيناتي في أنابيب الطرد المركزي المسمى.

4-الطرد المركزي الخطوات

  1. إضافة 8.0 مل محلول ديكستران 26% لكل أنبوبة الطرد المركزي المسماة التي تحتوي على هوموجيناتي الدماغ.
  2. عكس الأنبوب مرتين ومن ثم دقة دوامة العينة. إجراء فورتيكسينج لكل عينة باستخدام زوايا متعددة لضمان خلط دقيق للدماغ هوموجيناتي الحل مع الحل ديكستران 26%.
  3. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لبعض التحليلات، أنه مفيد لمقارنة ميكروفيسيلس الدماغ مع حمة الدماغ. ينبغي أن يكون تقييم التعبير البروتين في الدماغ حمة المطلوبة، المادة طافية من هذه الخطوة الطرد المركزي (أي المخ متني الكسر) يمكن جمعها وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  4. إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ والزجاج ماصة باستور.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر لعدم الإزعاج بيليه. خلاف ذلك، سيتم تخفيض كمية ميكروفيسيلس الدماغ التي تم جمعها، التي ستنخفض إلى حد كبير إنتاج البروتين من هذا الإجراء.
  5. ريسوسبيند بيليه في مل 5.0 من BMB المحتوية على مبطلات المانع كوكتيل (أي، ميكروليتر 1.0 حوزتي المانع كوكتيل كل مل 1.0 BMB المخزن المؤقت). دوامة بيليه لضمان خلط دقيق.
  6. إضافة مل 8.0 من ديكستران 26% لكل أنبوب الطرد المركزي ودوامه كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.2 من هذا البروتوكول.
  7. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. استخدام قارورة فراغ وماصة زجاجية، نضح المادة طافية وضمان عدم توقف بيليه أن تحتوي على ميكروفيسيل الدماغ.
    ملاحظة: المواد الزائدة التي تمسكت بجدار الأنبوبة لا تحتوي على ميكروفيسيلس وينبغي بعناية تنظيفها وإزالتها.
  9. كرر الخطوات من 4، 5 إلى 4.8 آخرين مرتين.
  10. خطوات استخدام الطرد المركزي ديكستران 4 مرة واحدة قد اكتملت، إضافة مل 5.0 من BMB كل بيليه ودوامه ريسوسبيند العينة.
    ملاحظة: بعد انتهاء خطوة 4، 10، يمكن جمعها كلها ميكروفيسيلس لتحليل البروتين التعريب. يمكن أن يتحقق هذا بأخذه 50 ميكروليتر الكوة ميكروفيسيل تعليق إعادة بيليه وتلطيخ على شريحة الميكروسكوب زجاجية. ثم يتم ميكروفيسيلس الحرارة ثابتة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على كتلة تدفئة متبوعاً بالتثبيت في الإيثانول المثلج ليمكن تخزينها شرائح إضافية كحد أدنى 10 ثم في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة للتصوير الدراسات.

5-تنبيذ فائق تحضير عينات أغشية الدماغ مجموع Microvascular

  1. نقل العينات إلى الخالطون الزجاج المثلجة.
  2. باستخدام الخالطون الكهربائية علوية، مجانسة أنسجة المخ باستخدام 8-10 صعودا وهبوطاً السكتات الدماغية على 3000 دورة في الدقيقة. ويجري تجانس استخدام طاحونة أنسجة مل 10 قذائف هاون ومدقة. تنظيف مدقة استخدام الإيثانول 70% بعد تجانس كل عينة الفردية.
  3. نقل عينات لتنظيف أنابيب أولتراسينتريفوجي. عدد ووزن كل أنبوبة الفردية. التوازن وزوج الأنابيب قبل التحميل إلى الدوار أولتراسينتريفوجي.
    ملاحظة: جميع وزنها والاقتران من أنابيب أولتراسينتريفوجي يجب أن تجري مع القبعات على لضمان القياس الدقيق لأنبوب الأوزان.
  4. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 150,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية.
  5. استخدام قارورة فراغ والزجاج ماصة باستور، نضح المادة طافية استخدام الحرص على عدم عرقلة بيليه الأغشية الشعرية.
  6. استناداً إلى حجم بيليه، إضافة وحدة تخزين مناسبة لتخزين المخزن المؤقت، التي تتألف من المياه و BMB في نسبة 1:1 (v/v). عادة، يتم حراكه الكريات في 400-500 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتخزين. إضافة كوكتيل مثبط البروتياز إلى المخزن المؤقت التخزين بنسبة 1.0 ميكروليتر كل مل 1.0 من المخزن المؤقت لتخزين.
  7. دوامة عينات ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لتخزين.
  8. استخدام زجاج ماصة باستور، نقل عينات الأغشية الشعرية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى 1.5 مل.
  9. تمرير نموذج عن طريق إبرة المحاقن x 5 لضمان العينة يتم خلطها بشكل تام، ووجود لا المجاميع الخلوية.
  10. تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى اللازمة للتحليل.
    ملاحظة: يتم قياس محتوى البروتين من كل عينة غشاء ميكروفيسيل استخدام الأسلوب برادفورد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 1تدفق التجريبية لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء ميكروفيسيل. استخدام الإجراء المعروضة هنا، يتجلى نجاح عزل ميكروفيسيلس سليمة من الدماغ الفئران (الشكل 2A). وتم الحصول على هذه السفن بعد الانتهاء من استخدام الطرد المركزي مع ديكستران وفورا قبل البدء تنبيذ فائق تحضير عينات الغشاء (أي، بعد إتمام الخطوة 4.10). في هذه الصورة، وهو الملون ميكروفيسيل استخدام جسم مضاد ضد Oatp1a4، الناقل التي أظهرت أن يعبر جيدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، هو وصف طريقة بسيطة وفعالة لإعداد عينات البروتين غشاء من ميكروفيسيلس طازجة المعزولة من أنسجة المخ الفئران. وأبلغ عدة نهج لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران و/أو جيل من الاستعدادات غشاء من ميكروفاسكولاتوري معزولة في الأدب13،20،،من2122 , 24-على الرغم من أن البروتوكول العزلة ميكروفيسيل الموصوفة أعلاه مشابهة من حيث المبدأ، تم تحسين هذا النهج لتمكين إعد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01-NS084941) ولجنة البحوث الطبية الحيوية أريزونا (ADHS16-162406) إلى PTR. وقد تلقت وا في الماضي دعم من تعيينا قبل دكتوراه على "المعاهد الوطنية لمنحه التدريب الصحي" (T32-HL007249).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كوكتيل مثبط البروتيازسيجما ألدريتش#P8340مكون من عازلة الأوعية الدقيقة للدماغ
D-mannitolSigma-Aldrich#M4125مكون عازلة الأوعية الدقيقة للدماغ
EGTASigma-Aldrich#E3889مكون عازلة الأوعية الدقيقة للدماغ
Trizma BaseSigma-Aldrich#T1503مكون عازلة الأوعية الدقيقة في الدماغ
ديكستران (ميغاواط 75,000)Spectrum Chemical Mftg Corp#DE125Dextern المستخدمة في خطوات الطرد المركزي لفصل الأوعية الدقيقة عن حمة الدماغ
زيتامينMWI صحة#501072التخدير العام
زيلازينالإمدادات الطبية الغربية# 5530التخدير العام
0.9٪ محلول ملحيالإمداد الطبي الغربيN / Aالتخدير العام ورق ترشيح مخفف
(قطر 12.5 سم)VWR# 28320-100يستخدم لإزالة السحايا من أنسجة المخ
أنابيب الطرد المركزيSarstedt# 60.540.386الأنابيب التي يمكن التخلص منها المستخدمة في خطوات الطرد المركزي ديكستران
بيرس & تجارة ؛ Coomassie Plus (برادفورد) الفحصThermoFisher Scientific# 23236قياس تركيز البروتين في مستحضرات الغشاء
Wheaton Overhead Power HomogenizerDWK Life Sciences# 903475مطلوب لتجانس العينات
10.0 مل من الملاط الزجاجي وطاحونة مناديل المدقةDWK Life Sciences# 358039مطلوب لتجانس العينات
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش#H1758مطلوب لتعديل الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة
ألبومين مصل الأبقارThermoFisher Scientific# 23210معيار البروتين لفحص برادفورد
الملقطالقياسي أدوات العلوم الدقيقة# 91100-12تستخدم لتشريح أنسجة المخ
Friedman-Pearson Rongeursأدوات العلوم الدقيقة# 16020-14تستخدم لفتح الجمجمة لعزل الدماغ
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةThermoFisher Scientific# 352070تستخدم لجمع أنسجة المخ بعد العزل
زجاج باستور بيبيتسثيرموفيشر العلمي# 13-678-20Cتستخدم لشفط الحطام الخلوي بعد ديكستران يدور
الإيثانول ، اللامائيسيجما ألدريتش# 459836يستخدم لتنظيف طاحونة الأنسجة ؛ مخفف إلى 70٪ بالماء
المقطرأنابيب الطرد المركزي الفائقBeckman-Coulter# 41121703تستخدم للطرد المركزي الفائق للعينات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802(2017).
  3. Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
  4. Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
  5. McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
  6. Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
  7. Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
  8. Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
  9. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  10. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  11. Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
  12. Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
  13. Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
  14. Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
  15. Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
  16. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  17. Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
  18. Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
  19. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  20. Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
  21. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
  22. McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
  23. Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
  24. Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
  25. Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
  26. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  27. Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة