يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر

11K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57699

⸱

يوليو 4, 2018

 ,  , 
1Center for Microbial Ecology and Technology (CMET), Ghent University

في هذه المقالة

ملخص

التفاعلات بين الميكروبات واستضافة القناة الهضمية قيمت استخدام نهجاً جديداً يجمع بين مجتمع شفوي اصطناعية و في المختبر الهضم المعدية المعوية، ونموذجا ظهارة الأمعاء. نحن نقدم طريقة التي يمكن تكييفها لتقييم غزو الخلية من مسببات الأمراض والأغشية الحيوية المتعددة الأنواع، أو حتى لاختبار قابلية بروبيوتيك الصيغ.

الملخص

وقد اعترف منذ زمن بعيد التفاعل بين المضيف والحجمية وعلى نطاق واسع ووصف. الفم مماثل إلى فروع أخرى من الجهاز الهضمي، كما يحدث الحجمية المقيمين ويمنع الاستعمار بالبكتيريا الخارجية. وفي الواقع، تم العثور على أكثر من 600 نوع من البكتيريا في تجويف الفم، وفرد واحد قد تحمل حوالي 100 مختلفة في أي وقت. بكتيريا الفم تمتلك القدرة على التمسك بالمنافذ المختلفة في النظام الإيكولوجي عن طريق الفم، وهكذا تصبح متكاملة داخل المجتمعات الميكروبية المقيمة، وتفضيل النمو والبقاء على قيد الحياة. ومع ذلك، اقترح تدفق البكتيريا إلى الأمعاء خلال البلع إلى الإخلال بتوازن الحجمية القناة الهضمية. في الواقع، تحولت الإدارة عن طريق الفم من جينجيفاليس P. تكوين البكتيرية في النبت لفائفي. أننا كمجتمع اصطناعية تمثيل مبسط للنظام الإيكولوجي الطبيعي عن طريق الفم، توضيح بالبقاء على قيد الحياة وبقاء البكتيريا عن طريق الفم يتعرضن لظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. الأنواع الأربعة عشر المحددة، تعرض في المختبر اللعابية، والمعدة، وعمليات الهضم المعوية، وقدم إلى طراز مولتيكومبارتمينت خلية التي تحتوي على خلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX لمحاكاة ظهارة مخاطية الأمعاء. وعمل هذا النموذج لكشف تأثير البكتيريا ابتلع على الخلايا المعنية بتداول enterohepatic. يسمح استخدام المجتمعات الاصطناعية للتحكم وإمكانية تكرار نتائج. وهكذا، هذه المنهجية يمكن تكييفها لتقييم جدوى الممرض والتغيرات المرتبطة بالتهاب اللاحقة، قدرة الاستعمار من خلائط بروبيوتيك، وفي نهاية المطاف، البكتيرية المحتملة تؤثر على التداول بريسيستيميك.

المقدمة

البشر التعايش مع البكتيريا، التي موجودة في نفس عدد الخلايا البشرية1. ومن ثم فمن المهم من أهمية حاسمة للحصول على فهم شامل ميكروبيومي البشرية. تجويف الفم بيئة فريدة من نوعها في ذلك ومقسمة إلى عدة الموائل أصغر، وبالتالي الذي يحتوي على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البكتيريا والأغشية الحيوية في تلك المواقع المختلفة. ويجري فتح النظام إيكولوجي، قد تكون بعض الأنواع في الفم زائر عابر. ومع ذلك، بعض الكائنات المجهرية استعمار قريبا بعد الولادة وشكل تنظيم الأغشية الحيوية2. وتوجد هذه في سطح الأسنان أعلاه شق اللثة وشق سوبجينجيفال، واللسان، والأسطح المخاطية والأسنان الاصطناعية وحشوات3. يمكن أن تكون البكتيريا موجودة أيضا فلكس وخلايا العوالق في التجويف قناة الأسنان، أما ممزوج داخليا مع أنسجة اللب نخرية أو علقت في مرحلة السائل.

وهناك نشطة ومستمرة عبر الحديث بين الخلايا المضيفة و الحجمية المقيمين4. البكتيريا التواصل داخل وفيما بين الأنواع، وفقط نسبة صغيرة من المستعمرين الطبيعية يمكن أن تنضم إلى الأنسجة، بينما الأخرى البكتيريا إرفاق هذه المستعمرين الأولية. على سبيل المثال، خلية خلية الربط بين الكائنات الدقيقة هو المفتاح لدمج الثانوي المستعمرين في الأغشية الحيوية عن طريق الفم، وبناء شبكات معقدة من التفاعل الخلايا الجرثومية4. حوالي 70% مجاميع البكتيرية في عينة لعاب يتم تشكيلها من قبل بورفيروموناس sp. و العقدية sp.، بريفوتيلا sp.، فيلونيلا sp. ومجهولون باكتيرويديتيس. ف. نوكليتوم ، مستعمر وسيطة في بيوفيلم سوبجينجيفال والمجاميع مع المستعمرين أواخر P. جينجيفاليس، ت. دينتيكولا، و فورسيثيا تانيرلا، التي هي متورطة في التهاب اللثة5. وبالإضافة إلى ذلك، تحتل ميتس العقدية الموائل المخاطي والأسنان على حد سواء، بينما يفضل الدم س. وس. جوردو لاستعمار الأسنان3. وهكذا، والدم س. موجودة في أقل من القواطع والانياب، بينما تم العثور على نايسلوندي الحارش في أنتيريورس العلوي6.

وبالإضافة إلى ذلك، ميكروبيومي الأصلية يلعب دوراً في الحفاظ على صحة الإنسان2. وتشارك الحجمية المقيم في التعليم محصنة والحيلولة دون توسيع الممرض. مقاومة الاستعمار هذا يحدث بسبب البكتيريا الأصلية قد تكون أفضل تكييف في إرفاق للأسطح، وأكثر كفاءة في ميتابوليسينج المواد الغذائية المتاحة للنمو. لا وصف تماما على الرغم من أن سلالات الكائنات الحية المجهرية البقاء على قيد الحياة بمرور الجهاز الهضمي، ولا تزال نشطة، استمرار وجود البكتيريا أصلي ابتلع من موقع العلوي من الجهاز الهضمي. وهكذا، نتعرض جماعة اصطناعي، ممثل النظام الإيكولوجي عن طريق الفم، إلى ظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. تم تقييم جدوى خلايا البكتيرية باستخدام نموذج مولتيكومبارتمينت تشبه ظهارة الأمعاء. الحالي القناة الهضمية المحاكاة توفر إمكانية تكرار نتائج مناسبة من حيث تحليل المجتمع الميكروبي لومينال7. ومع ذلك، التصاق البكتيريا والميكروبات والمضيف التفاعل كل على حدة تعالج، كالجمع بين خطوط الخلايا مع المجتمعات الميكروبية يتحدى8. وفي المقابل، نقدم إطارا يقدم شرحاً الميكانيكية المحتملة لإحداث الاستعمار الناجحة عن واجهة القناة الهضمية. في الواقع، استخدام هذا النموذج يمكن الاشتراك مع نموذج القناة الهضمية ثابتة لتقييم الأثر للمجتمعات الميكروبية على المضيف الإنذار سطحية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-سلالات والثقافة الشروط

ملاحظة: كان يتألف المجتمع الشفوي الاصطناعية بسلالات موجودة عادة في الفم ميكروبيومي3.

  1. الحصول على سلالات التالية من جمع الثقافة نوع الأمريكية (ATCC): أكتينوميسيتيمكوميتانس أجريجاتيباكتير (ATCC 43718)، Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953)، (ATCC بورفيروموناس جينجيفاليس 33277)، الحارش نايسلوندي (ATCC 51655)، بكتيريا سوبرينوس (ATCC 33478)، ، بريفوتيلا انترميديا (ATCC 25611)، العقدية mutans (ATCC 25175) بكتيريا جوردو (ATCC 49818)، الحارش فيسكوسوس (ATCC 15987) و العقدية ميتس (ATCC 49456).
  2. الحصول على فيلونيلا بارفولا من لايبنتز المعهد الألماني دسمز مجموعة الكائنات الدقيقة والثقافات الخلية (DSM 2007)، بكتيريا الدم من "مجموعة البكتيريا" بككم/مجموعة المتشابهين في الآراء (مجموعة المتشابهين في الآراء 14657) واستخدام عقدية ساليفاريوس سلالة توف-ص9، و عقدية فموية10.

2-التنمية المنصبة المجتمع ممثل ميكروبيومي عن طريق الفم

ملاحظة: إنشاء مجتمع اصطناعية لمحاكاة قدرة التصاق المحتملة من البكتيريا عن طريق الفم ظهارة الأمعاء في المختبر . تنمو البكتيريا في لوحات أجار الدم وتستكمل مع 5 هيمن ميكروغرام/مل و 1 ميكروغرام/مل menadione الدم الحصان ديفيبريناتيد العقيمة 5%، كما هو موضح في هرنانديز-سانابريا et al. (2017) 11-باختصار:

  1. يذوب 100 مغ هيمن في 2 مل من هيدروكسيد الصوديوم م 1، وإضافة 100 مل ماء المقطر يعقم. تخزين في حاوية الظلام. تعقيم من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر قبل إضافة إلى متوسط.
  2. حل 100 مغ menadione في 20 مل إيثانول 96%. تعقيم من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر قبل إضافة إلى متوسط.
  3. تحضير 1 لتر متوسطة أجار الدم (انظر الجدول للمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة والاوتوكلاف. السماح لتبرد قبل إضافة دم الحصان والملاحق. خلط وصب اللوحات.
  4. إعداد مرق ضخ القلب الدماغ المعدلة (بهي) كما ذكر سابقا12. إضافة 5 ميكروغرام/مل من هيمن و 1 ميكروغرام/مل من menadione بعد التعقيم.
  5. الاستغناء عن 9 مل المتوسط في أنابيب هونجاتي، وأغلق مع سداده مطاطية وغطاء ألومنيوم. تدفق الأنابيب مع/CO ن22 (10%/90%).
  6. استرجاع 1 مل من اللاهوائية المتوسطة مع المحاقن ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. اختيار المستعمرات واحدة لكل نوع من الأنواع البكتيرية وريسوسبيند في الأجل المتوسط ونقل مرة أخرى إلى بهي معدلة اللاهوائية. احتضانها ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، باستثناء س. ساليفاريوس، الذي يجب أن يكون المحتضنة ح 24.
  7. إذا لزم الأمر، تؤكد نقاء الثقافات قبل تجميع المجتمع الاصطناعية. باختصار:
    1. استخراج الحمض النووي من ثقافات السائل كما هو الحال في هرنانديز-سانابريا et al. (2010) 13 وتضخيم الجين الرنا الريباسي 16S في كبسولة تفجير باستخدام 27 واو (أجاجتتجاتيمتجكتكاج) و 1492R (تاكجيتاككتجتاكجاكت)، والبرنامج التالي: 5 دقائق في 95 درجة مئوية، دورات 30 من 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة 1.5، تليها خطوة تمديد نهائي لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    2. تنقية المنتج بكر مع تجاري كيت (انظر الجدول للمواد)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    3. القيام برد فعل التسلسل من المنتجات النقية في حجم إجمالي 10 ميكروليتر المحتوية على 0.5 ميكروليتر من صبغ (انظر الجدول للمواد)، بمول 3.2 من التمهيدي M13f (كجككاججتتتكككاجتكاكجاك)، ميكروليتر 2.0 من 5 × التسلسل المخزن المؤقت، و 20 نانوغرام قالب، باستخدام نظام التسلسل التجاري مع مجموعة (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: كان لدينا هذا الإجراء إجراء تجارياً.
    4. إجراء بحث انفجار في كل تسلسل (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) لتحديد الأصناف المعروفة الأقرب ومقارنة مع تسلسل سلالة الأصلي باستخدام أداة "المصنف برنامج التعمير والتنمية" على شبكة الإنترنت (http://rdp.cme.msu.edu/) وسينا خدمة المحاذاة (https://www.arb-silva.de/aligner/).
  8. قياس عدد الخلايا في نهاية الحضانة، باستخدام التدفق الخلوي ووصمة عار "سيبر يوديد" Propidium الأخضر/كما هو موضح في هرنانديز-سانابريا et al. (2017) 11-تمييع الثقافات إلى 10 مل الخلايا5 -1، واستخدام تعديل بهي.
  9. أضف 1 مل من س. ميتس في 75 مل بهي اللاهوائية واحتضان حتى مرحلة ثابتة (ح 6). عقب، جمع 0.75 مل من كل سلالة المخفف والمزيج تحت الظروف اللاهوائية.
  10. متى كانت مختلطة جميع الثقافات، أخذ 1 مل من مصغر، وإضافة إلى 75 مل بهي. احتضان المجتمع الاصطناعية تحت 10% CO2، 10 ٪ ح2، 80% N2 ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة (انظر الجدول للمواد).
  11. قياس كثافة الخلية كما هو الحال في 2.8. قبل أن يعرض المجتمع إلى نموذج الخلية. ويمكن تقييم تركيبة المجتمع مع الكمي PCR الوقت الحقيقي، استخدام كبسولة تفجير والصلب في درجات الحرارة في الجدول 1 من سلومكا et al. (2017) 10-وبالإضافة إلى ذلك، استخدم 16S الرنا الريباسي amplicon التسلسل الجيني لتقديم معلومات عن أعضاء الأولية الحالية13،14. أما بروتوكول تأكيد الهوية، استخدم كدنا كقالب للإشارة إلى البكتيريا تدوين بنشاط البروتينات، واستخدام الحمض النووي كقالب لتكشف عن وجود/عدم وجود السلالات.

3-الممارسات العامة خلية ثقافة

ملاحظة: للجوانب العامة لثقافة الخلية، المؤلفين الرجوع إلى الأصول الرأسمالية وستايسي (2007)15. الحصول على خطوط الخلايا المستخدمة من "جمع من مصادقة خلية الثقافات الأوروبية" (كربونات الكالسيوم-2 اكاكك 86010202 و 12040401 اكاكك HT29-MTX-E12، إنكلترا الصحة العمومية، المملكة المتحدة). ويمكن شراء الكواشف لزراعة الخلايا (انظر الجدول للمواد)، ما لم يحدد خلاف ذلك.

  1. الصيانة وباساجينج من خطوط الخلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29-MTX
    ملاحظة: تزرع الخلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX بشكل روتيني في 25 سم2 زراعة الأنسجة قوارير تحتوي على تستكمل دميم المتوسطة (الجدول 1). يتم تريبسينيزيد الخلايا عندما يتم التوصل إلى التقاء 60 – 70%.
    1. إزالة مستنبت الخلية من قوارير. تغسل مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني دون/Mg Ca++++.
    2. إضافة 2 مل محلول 0.5 ملغ/لتر من التربسين و 0.22 غرام/لتر الإثيلين diamine حمض tetraacetic (أدتا). توزيع الحل التربسين التي تتحرك بلطف قارورة. إزالة 1.5 مل الحل التربسين واحتضان قارورة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. الاختيار تحت المجهر إذا يتم فصل الخلايا من سطح قارورة. احتضان لمدة 5 دقائق إضافية، إذا لزم الأمر.
    4. إضافة 5 مل وسائط الثقافة الخلية المكملة لقارورة لإلغاء تنشيط التربسين. بيبيت صعودا وهبوطاً للحصول على تعليق خلية واحدة متجانسة.
    5. فورا، تأخذ من 50 ميليلتر الكوة من تعليق خلية وخلط مع العقيمة الحل تريبان الأزرق 0.4 في المائة في نسبة 1:1 (v/v) للخلايا كربونات الكالسيوم-2 أو 1:5 v/v HT29-MTX. مزيج من بيبيتينج والتحميل إلى غرفة الفرز (انظر الجدول للمواد).
    6. عد الخلايا (خلايا بيضاء مشرقة) قابلة للبقاء تحت المجهر (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
    7. البذور في قارورة جديدة في كثافة من 4 × 105 خلايا/سم2 و 1 × 104 خلايا/سم2، 2 كربونات الكالسيوم و HT29-MTX، على التوالي.
      ملاحظة: (1) كربونات الكالسيوم-2 الخلايا تفرق وتشكل تقاطعات ضيق مرة التوصل إلى كونفلوينسي. من المهم جداً لتفادي كونفلوينسي أكثر من قبل تريبسينيزيشن. يمكن أن يسبب فرط نمو الخلايا في قارورة الفشل في الخلية المفرزة بعد كتل تريبسينيزيشن و/أو الخلية. (2) HT29-MTX الخلايا المنتجة للمخاط الخلايا ذات النشاط الأيضي عالية16. هذه الميزات قد يتسبب تحميض سريع وسائل الإعلام ثقافة الخلية، لا سيما إذا كانت الخلايا في كثافة عالية. يمكن إضافة حبيس المخزن المؤقت إلى مستنبت الخلية (الجدول 1) للحفاظ على درجة الحموضة بين 7 و 7.2. إذا كان الرقم الهيدروجيني قطرات، يمكن أن تكون وسيطة تبادل عند كونفلوينسي هو أقل من 50%. ومع ذلك، إذا كونفلوينسي > 50%، يجب تقسيم خلية ثقافة.

4-جمعية مولتيكومبارتمينت خلية نموذج محاكاة واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية

ملاحظة: اكتمال ثقافة المشارك في الآبار غرفة مزدوجة (قطرها 24 ملم، المسامية حجم 0.4 ميكرومتر؛ انظر الجدول للمواد).

  1. إضافة 1.5 مل من خلية كاملة ثقافة وسائل الإعلام إلى حجرة قمي و 2 مل القاعدية. قبل احتضانها لمدة 20 – 30 دقيقة للحصول على توزيع متساو لتعليق خلية عند البذر.
  2. تريبسينيزي خلية ثقافة من كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX كما هو موضح في القسم 3. يجب أن يتبع هذا الإجراء تريبسينيزيشن بدقة لتحقيق توزيع متجانس لكل خطوط الخلية، في تعليق خلية مفردة، دون كتل.
  3. عد الخلايا قابلة للحياة كما هو موضح في 3.1.8.
  4. ضبط كثافة الخلية إلى 6.5 × 104 خلايا/سم2 في نسبة 90/10 من كربونات الكالسيوم-2/HT29-MTX الخلايا.
  5. مجانسة تعليق خلية وإضافة حجم الخلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX المقابلة لحاوية معقمة معبأ مسبقاً مع الخلية تستكمل ثقافة وسائل الإعلام. إزالة الوسائط المحتضنة مسبقاً من جانب الدائرة قمي بتطلع.
  6. بلطف مزيج تعليق خلية من بيبيتينج، ونقل 1.5 مل إلى حجرة قمي من إدراج الدائرة. يتطلب الإجراء البذر تجانس مستمر من تعليق خلية، كما تميل الخلايا للرواسب. اعتماداً على خبرة المستخدم وسرعة العمل، يجب أن تكون مختلطة تعليق خلية بعد الاستغناء عن الآبار 1 – 3.
  7. نقل لوحات بلطف إلى الخلف وإلى الأمام واليمين ثم من اليسار إلى اليمين (5 – 10 مرات) للحصول على حتى انتشار الخلايا في البئر. نقل إلى حاضنة وكرر حركة الصفائح.
  8. الحفاظ على ثقافة المشارك من كربونات الكالسيوم-2/HT29-MTX الخلايا لمدة 15 يوما، تحديث مقصورات قمي والقاعدية كل يومين مع دميم المكملة. بعد هذا الوقت، يمكن تغيير وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى دميم المكملة دون حل المضادات الحيوية/فطري.
  9. الإبقاء على النظام حتى 20 – 21 يوما بعد البذر بتحديث المتوسط كل يومين.
  10. قياس سلامة الحاجز الظهارية قبل البدء التحليل، باستخدام "نظام المقاومة الكهربائية" (انظر الجدول للمواد)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    1. التأكد من أن المعدات طير مشحونة بالكامل (> ح 24) قبل البدء في القياسات.
    2. قطع المعدات طير من إمدادات الطاقة وتغطية بكيس من بلاستيك اﻷوتوكﻻف. جعل ثقب في كيس لإدخال مسرى وقم بتوصيل منفذ الإدخال على العداد. رش مع 70% الإيثانول والمياه (v/v) قبل إدخال معدات طير في مجلس الوزراء التدفق.
    3. لتطهير مسرى، تزج نصائح القطب في الحل الإيثانول والمياه (v/v) 70% عن 15 دقيقة السماح للهواء الجاف شطف س. 15 مسرى في الخلية قبل حرارة الثقافة الإعلامية.
    4. تأخذ الخلايا خارج الحاضنة والسماح بالتوصل إلى درجة حرارة الغرفة داخل مجلس الوزراء التدفق الخلايا.
    5. تأكد من أن العداد مفصول من الشاحن. تعيين رمز التبديل وضع أوم وتشغيل تبديل الطاقة على.
    6. قياس مقاومة الخلية بغمر مسرى مع نصيحة أقصر في الإدراج وتلميح أطول من البئر. يبقى مسرى بزاوية 90 درجة لإدراج لوحة.

5-البكتيريا البقاء على قيد الحياة في المختبر العبور الجهاز الهضمي الشروط التالية

ملاحظة: تعد الهضم محاكاة السوائل بعد بروتوكول مينيكس et al. (2014) 17، مع إدخال التعديلات المبينة أدناه. إعداد جميع تخفيف الماء عالي النقاوة. فلتر تعقيم جميع الحلول من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتنفيذ الإجراء الهضم تحت ظروف معقمة.

  1. الهضم عن طريق الفم:
    1. ضع 3 مل المجتمع البكتيري في أنبوب 50 مل عقيمة، وتخلط مع 3 مل من اللعاب محاكاة السوائل (صندوق الضمان الاجتماعي)، الذي يتضمن (في ملمول لتر-1): بوكل، 15.1؛ خ2ص4، 3، 7؛ ناكو3، 6.8؛ مجكل2(ح2س)6، 0.5، (NH4) CO3، 0.06؛ HCl، 1.1؛ كاكل2(ح2س)2، 0.75. إضافة 75 يو/مليلتر من α-الأميليز من اللعاب البشرية نوع أ التاسع والميوسين 2 غرام/لتر من نوع المعدة الخنزير الثاني إلى صندوق الضمان الاجتماعي.
    2. احتضان هذا الخليط لمدة 2 دقيقة، في 37 درجة مئوية، و 100 لفة في الدقيقة. جمع عينة 2 مل لاستخراج الحمض النووي والتدفق الخلوي الكمي (S1).
  2. المعدة من الهضم:
    1. إضافة 4 مل سائل المعدة محاكاة (سجف)، الذي يتضمن (في ملمول لتر-1): بوكل، 6.9؛ خ2ص4، 0.9؛ ناكو3، 25؛ كلوريد الصوديوم، 47.2؛ مجكل2(ح2س)6, 0، 1، (NH4) CO3، 0.5؛ HCl، 15.6؛ كاكل2(ح2س)2، 0.075. وباﻹضافة إلى ذلك، الواردة سجف 2 غرام/لتر الميوسين من الخنزير المعدة من النوع الثاني.
    2. قياس درجة الحموضة وضبط على درجة الحموضة 3 مع 1 م HCl، إذا لزم الأمر. احتضان في 37 درجة مئوية و 100 لفة في الدقيقة. جمع عينة 2 مل (S2).
  3. الهضم في الأمعاء الدقيقة:
    1. إضافة 4 مل من محاكاة السوائل المعوية (SIF) التي تحتوي على (في ملمول لتر-1): بوكل، 6.8؛ خ2ص4، 0.8؛ ناكو3، 85؛ كلوريد الصوديوم، 38.4؛ مجكل2(ح2س)6، 0.33؛ HCl، 8.4؛ كاكل2(ح2س)2، 0.3؛ إلى أنبوب الهضم.
    2. ضبط على درجة الحموضة 7 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم، إذا لزم الأمر. احتضان في 37 درجة مئوية و 100 لفة في الدقيقة. جمع عينة 2 مل (S3).

6-قدرة الاستعمار البكتيرية في المختبر العبور الجهاز الهضمي الشروط التالية

  1. الطرد المركزي 2 مل هضم الأمعاء، لمدة 10 دقائق في س 2,650 ز.
  2. إزالة المادة طافية ومزيج بيليه البكتيرية مع 5 مل دميم المكملة دون المضادات الحيوية وفطري.
  3. وصمة عار وقياس سليمة أو تلف الخلايا باستخدام سيتوميتير تدفق (انظر الجدول للمواد)، كما وصفها هرنانديز-سانابريا et al. (2017) 11.
  4. ضبط كثافة الخلية إلى 105 صالحة خلايا/مل بتمييع في دميم المكملة دون المضادات الحيوية وفطري.
  5. إزالة المتوسطة قمي للنظام ترانسويل وإضافة 1.5 مل تعليق البكتيرية. شارك ثقافة نظام ح 2 تحت ظروف الثقافة العامة الخلية (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO2).
    ملاحظة: يمكن توسيع هذا الوقت تصل إلى 48 ساعة، اعتماداً على بروتوكول تجريبي المطلوب. يمكن الحفاظ على ثقافة المشارك في حاضنة مختلفة عن اللغة المستخدمة للصيانة الروتينية الخلية، لتجنب التلوث.
  6. قياس القيم طير بعد الحضانة، لتقييم سلامة الحاجز الظهارية كما هو موضح في 4.11.
  7. فور الانتهاء من وقت الحضانة، قم بإزالة الوسائط قمي، وجمع 0.5 مل لمزيد من التحليلات (S4). عينة فرعية من وسائل الإعلام يمكن أن تستخدمها لتقييم سلامة خلية التحليل "نازعة لاكتات" (رابطة حقوق الإنسان) (انظر الجدول للمواد)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  8. إضافة 0.5 مل من 10 مم ن-أسيتيل في حبس (NAC-المخزن المؤقت) لجعل المخاط التي تنتجها HT29-MTX واستعادة البكتيريا التقيد بها. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 1، تحت التحريض (135 لفة في الدقيقة، انظر الجدول للمواد).
  9. استرداد NAC-حبس في أنبوب ميكروسينتريفوجي (S5) وتغسل مرتين الخلايا مع 1 مل دببس.
  10. إضافة 0.5 مل من 0.5% X-100 تريتون (w/v) على رأس مونولاييرس، تعطيل الخلايا عن طريق بيبيتينج، واسترداد السائل ودوامه للحد الأدنى 1 السرعة أمر حاسم لتجنب إتلاف الخلايا البكتيرية مع مواد التنظيف.
  11. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 2,650 س ز، وفصل المادة طافية (S6) وبيليه (S7).

7-عينة التحليل

ملاحظة: تحليل العينات التي تم جمعها (S1-S7) لتقييم جدوى البكتيرية والالتصاق المحتملة للخلايا المعوية، عقب محاكاة هضم المعدية معوية.

  1. بقاء البكتيرية: تمرير العينات S1-S5 مرتين عن طريق 0.45 ميكرومتر والتحديد الكمي للخلايا البكتيرية باستخدام خلية يعيش الميت تلطيخ والتدفق الخلوي، كما هو مبين في الخطوة 2.811.
  2. التصاق المحتملة: إعداد تخفيف المسلسل (-1 إلى-8) ل S1-S6 ومتتالية 10 ميليلتر في أجار الدم وتعديل لوحات بهي. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية ل h. 24 – 48 لوحة نفس الحجم من S7 غير مخفف.
    1. تحديد تصنيفية للبكتيريا التقيد بها:
      1. اختيار المستعمرات الفردية مع حلقة ثقافة وريسوسبيند كل منها على 10 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. جمع 4 ميليلتر من هذا التعليق واستخدامه كقالب للتضخيم PCR الجينات الرنا الريباسي 16S باستخدام أجهزة الإشعال والشروط الموضحة في 2.7.1.
      2. إجراء تسلسل البروتوكول في 2.7.3 بعد، والتحقق من صحة تسلسل استخدام الإجراء المدرجة في 2.7.4.
  3. القيام بمزيد من التحليل المصب مثل مجموع استخراج الحمض النووي، قبكر القياس الكمي و/أو 16S الرنا الريباسي أمبليكون تسلسل واستخراج الحمض النووي الريبي وترانسكريبتوميك التنميط حسب الرغبة.
    ملاحظة: أنجز التدفق الخلوي الكمي فورا بعد أخذ العينات. واستخدمت كعنصر تحكم لخلايا غشاء بيرميبيليزيد، عينة يتعرض إلى 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تم تقييم الضوضاء الخلفية بقياس التدفق الخلوي مع سوائل الهضم أو العينات التي تم الحصول عليها من نموذج ثقافة الخلية دون البكتيريا. وتم قياس كل عينة في ثلاث نسخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هذا البروتوكول يؤدي إلى توليد نموذج مناسب لتوضيح بالبقاء على قيد الحياة وبقاء البكتيريا عن طريق الفم يتعرضن لظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. تهم خلايا سليمة من السلالات الفردية هو ما يقرب من 108 خلايا مل-1 قبل قيام المجتمع الاصطناعية، بينما مصغراً المنصبة الواردة أعلاه 90% خلايا قابلة للحياة أثناء إنشاء (المجتمع الشكل 1A و 1B). استناداً إلى التقدير الكمي لايف/الميت، يقلل بقاء البكتيرية بعد كل خطوة من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ميكروبيومي عن طريق الفم عنصر أساسي في صحة الإنسان عنها مؤخرا في عدة المؤلفين20،21. تشير النتائج السابقة إلى أن ابتلاع اللعاب التي تحتوي على كميات كبيرة من البكتيريا يمكن أن تؤثر على النظام الإيكولوجي للميكروبات من الأمعاء الدقيقة، وواحد من المواقع الرئيسية فتيلة محصنة. تركيبة نموذج ثابت الهضم الجهاز الهضمي العلوي مع واجهة المضيف ممثلة بالخلايا الظهارية وإفراز مخاط الأمعاء، خدم لكشف تأثير العنصر الميكروبية على المضيف.

نماذج في المخت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

شكر وتقدير

الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي من "مؤسسة البحوث فلاندرز" إلى مارتا كاﻻتايود أرويو (فو بعد الدكتوراه زمالة-12N2815N). وأيما هرنانديز-سانابريا زميل ما بعد الدكتوراه تدعمها فلاندرز الابتكار وروح المبادرة (أجينتشاب voor إينوفاتي الباب ويتينشاب en تكنولوجي، IWT).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans < / em>American Type Culture CollectionATCC 43718
Fusobacterium nucleatum < / em>Type Culture CollectionATCC 10953
Porphyromonas gingivalis < / em>American Type Culture مجموعةATCC 33277
Prevotella intermedia < / em>American Type Culture CollectionATCC 25611
Streptococcus mutans < / em>American Type Culture CollectionATCC 25175<
em>Streptococcus sobrinus < / em>American Type Culture CollectionATCC 33478
Actinomyces لزجة < / em>American Type Culture CollectionATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R< / em>
Streptococcus mitis < / em>American Type Culture CollectionATCC 49456
Streptococcus sanguinis < / em>BCCM / LMG Bacteria CollectionLMG 14657
Veillonella parvula < / em>Leibniz Institute DSMZ - المجموعة الألمانية للكائنات الحية الدقيقة ومزارع الخلاياDSM 2007
Streptococcus gordonii < / em>American Type Culture CollectionATCC 49818
CELL LINES< / strong>
Caco-2Cells المجموعة الأوروبية لمزارع الخلايا المصادق86010202
خلايا HT29-MTXالمجموعة الأوروبية لمزارع الخلايا المصادقعليها 12040401
<قوي > الكواشف والمواد الاستهلاكية < / قوي >
مرق تسريب القلب للدماغ (BHI)OxoidCM1135
Blood Agar 2OxoidCM0055Blood Agar medium
MenadioneSigmaM9429
HeminSigmaH9039
5٪ دم الحصان المعقم منزوع الرجفانE & O LaboratoriesLtd,P030
InnuPREP PCRpure KitAnalytik Jena845-KS-5010250PCR طقم تنقية
كبيرةللأنظمة الحيوية التطبيقية4337454صبغة لتسلسل
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 مجموعة تسلسل الدورةAppliedBiosystems 4337456
SYBR   Green IInvitrogenS7585
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
T25 قوارير ثقافة غير مطلية ، معالجة بزراعة الخلايا ، تنفيس ، معقمةVWR734-2311
محلول Trypsin-EDTASigma-AldrichT3924-100ML
محلول تريبان الأزرق
0.4٪ ، سائل ، معقم مفلتر		Sigma-AldrichT8154   ؛
PBSGibco14190250
وسائط زراعة الخلايا DMEM ، مع تقنيات GlutaMAX و PyruvateLife31966-047
إدراج ثقافة خلايا غشاء البوليستر Corning TranswellSigma-AldrichCLS3450-24EA
Mucin من معدة الخنازير من النوع الثاني & nbsp ؛  سيجما ألدريتشM2378
مصل الأبقار الجنينيالمعطل Greiner BioOne 758093
المضادات الحيوية ومضادات الفطريات (100X)Gibco15240062
Triton X 100 للبيولوجيا الجزيئيةSigma-AldrichT8787  
DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيومGibco14190-250
Pierce LDH Cellular Assay KitThermo Fisher Scientific88953
Corning HTS Transwell-24 well well ، حجم المسام 0.4 & micro ؛ mCorning Costar Corp3450
المياه الخالية من النوكليازServa Electrophoresis28539010
EQUIPMENT< / strong>Neubauer
غرفة العد المحسنةCarl RothT729.1
BD Accuri C6 مقياس التدفقالخلوي BD Biosciences653118
PowerLyzer 24 HomogenizerMoBio13155
T100 Thermal CyclerBioRad186-1096
نظام دافقمخصصصنع InnOva
4080 حاضنة شاكرنيو برونزويك Scientific8261-30-1007شاكر ل 2.10
Memmert CO2< / sub> حاضنةMemmert GmbH & Co.ICO150med
Millicell ERS (نظام المقاومة الكهربائية) EMDMillipore ، Merck KGaAMERS00002
Millipore Milli-Q الأكاديمي ، نظام المياه النقيةللغاية Millipore ، Merck KGaA-Shaker
(ROCKER 3D الأساسية)IKA4000000شاكر ل 6.10
American عليها صبغة

المراجع

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533(2016).
  2. Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
  3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
  4. Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
  5. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
  6. Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
  7. Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
  8. Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133(2014).
  9. Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
  10. Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
  11. Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235(2017).
  12. Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
  13. Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340(2018).
  14. Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
  15. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
  16. Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
  17. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
  18. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
  19. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
  20. Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
  21. Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
  22. Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307(2015).
  23. Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
  24. Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
  25. Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
  26. Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
  27. Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
  28. Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Caco 2 HT29 MTX
تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.