Method Article

تقسيم نظام البروتينات الفلورية الخضراء لتصور المستجيبة التي سلمت من البكتيريا أثناء الإصابة

DOI:

10.3791/57719

⸱

May 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science, Plant Genomics and Breeding Institute, College of Agriculture and Life Science, Seoul National University, 2Department of Bioindustry and Bioresource Engineering, Sejong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفلورسنت النهج القائم على البروتين لرصد المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلايا المضيفة صعبة. وهذا بسبب عدم التوافق بين نظام إفراز النوع الثالث والبروتينات الفلورية. وهنا، يستخدم نظام تقسيم أمثل للتجارة والنقل سوبيرفولدير للتصور المستجيبة التي تفرزها البكتيريا داخل الخلية النباتية المضيف.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز البكتيريا، واحدة من أهم وكلاء المسببة للأمراض النباتية المختلفة، مجموعة من البروتينات المستجيب في الخلية النباتية المضيف لتخريب مصنع الجهاز المناعي. أثناء الإصابة بتسليم هيولى المستجيبة إلى سيتوسول المضيف عن طريق نوع نظام إفراز الثالث (T3SS). بعد الولادة في الخلية النباتية، يستهدف effector(s) compartment(s) محددة لتعديل عمليات الخلية المضيفة للبقاء على قيد الحياة والنسخ المتماثل لمسببات المرض. على الرغم من أن هناك بعض الأبحاث في التعريب سوبسيلولار المستجيب البروتينات في الخلايا المضيفة لفهم وظيفتها في القدرة الإمراضية باستخدام البروتينات الفلورية، التحقيق في ديناميات المستجيبة حقن مباشرة من البكتيريا وقد تم الطعن نظراً لعدم التوافق بين T3SS والبروتينات الفلورية.

هنا، يمكننا وصف أسلوبنا الأخيرة سوبيرفولدير الأمثل تقسيم نظام البروتينات الفلورية الخضراء (سفجفبالأراضي الفلسطينية المحتلة) لتصور توطين المستجيبة تسليمها عبر T3SS البكتيرية في الخلية المضيفة. SfGFP11 (11th β-حبلا من سفجفب)-يمكن تجميع كلمات المستجيب ويفرز عن طريق T3SS مع بادئة (1-10ال β-حبلا من سفجفب) عضية محددة تستهدفالأراضي الفلسطينية المحتلة sfGFP1-10 للانبعاثات fluorescence في الموقع. يوفر هذا البروتوكول إجراء لتصور إشارة الأسفار المعاد تشكيلها سفجفب مع بروتين المستجيب من Pseudomonas syringae في عضية خاصة في النباتات نبات و بينثاميانا نيكوتيانا .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النباتات هي الكائنات الحية لاطئة التي تواجهها العديد من مسببات الأمراض الغازية بما في ذلك البكتيريا، والفطريات، والفيروسات والحشرات والديدان الخيطية طوال دورة حياتها. بين فيتوباثوجينس، تصيب الغرام مسببات الأمراض البكتيرية مثل Pseudomonas spp. ورالستونيا spp.، مصانعها المضيف عن طريق إدخال عن طريق الجروح أو الفتحات الطبيعية، مثل الثغور وهيداثودي1. لاستعمار النباتات المضيفة بنجاح، وقد تطورت مسببات الأمراض البكتيرية تطوير مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة2. عندما تغزو البكتيريا نبات مضيف، أنها تضخ سلسلة من البروتينات الفوعة – المعروفة باسم المستجيبة — مباشرة في الخلايا النباتية لتعزيز تلك القدرة الإمراضية. قمع ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك.

1-إعداد المواد النباتية (4 أسابيع)

  1. إعداد للنباتات بينثاميانا أ.
    1. بذر بذور بينثاميانا أ 2 على سطح التربة من كل وعاء وتغطي صينية بقبة بلاستيكية وتسمح للبذور على الإنبات في 25 درجة مئوية ورطوبة 60% نمو الدائرة مع دورة 16/8-ح الضوء/الظلام كبيرة.
    2. وبعد أسبوعين، اقتطاف وتجاهل الشتلات الأصغر في كل وعاء والاستمرار في زراعة النباتات تحت نفس ظروف النمو كما يطبق على الإنبات في خطوة 1.1.1. إضافة 1 لتر مياه كل علبة كل يومين.
      ملاحظة: قد تختلف ظروف نمو النباتات عبر مختبرات. ولذلك، يتبع البروتوكول سقي العادية تنمو النباتات في حالة صح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتألف من أحد عشر بيتا خيوط بنية بيتا للبرميل للتجارة والنقل ويمكن تقسيمها إلى أجزاء اثنين وحبلاال 1-10 (GFP1-10الأراضي الفلسطينية المحتلة) وحبلاال (GFP11) 11. على الرغم من أن أيا من الشظايا اثنين الفلورسنت بأنفسهم، سفجفب الذاتي تجميعها يمكن أن تنبعث منها في الأسفار عند وجود شظايا اثنين بالقرب من (الشكل 1A). في هذا النظام، sfGFP1-10الأرض الفلسطينية المحتلة-الإعراب عن نبات أو بينثاميانا أ. يتم تلقيح .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم بروتوكول الموصوفة هنا لرصد الترجمة دقيقة من البروتينات المستجيب حقن الخلايا النباتية المضيف عند الإصابة بواسطة T3SS البكتيرية. سابقا، استخدم نظام التجارة والنقل الانقسام كأداة لدراسة الترجمة سوبسيلولار للبروتينات الثدييات23،36، والتعريب T3E السالمونيلا ، والتسليم VirE2 المتبعة عن طريق T4SS إلى الخلايا النباتية37. لتطبيق هذا النظام في الخلايا النباتية، استخدمت الدراسات السابقة المعدلة وراثيا ذرة نبات مؤثرا يعبر عن 1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البحث كان يدعمها "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تمول وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (جبهة الخلاص الوطني-2018R1A2A1A05019892) إلى العاصمة ومن منحة مقدمة من مركز تربية الجزيئية النباتية ( بمبك) للبرنامج 21 Biogreen الجيل القادم من "إدارة التنمية الريفية" (PJ013201) إلى الجيش الشعبي. ونشكر مركز التصوير من المركز الوطني للقياس "الإدارة البيئية" لتوفير مجهر [كنفوكل] لتصوير فيلم.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<خطوط معدلة وراثيا > أرابيدوبسيس قوية < / قوية >بارك ، إي ، لي ، إتش واي ، وو ، جيه ، تشوي ، د. وأمبير دينيش كومار ، إس بي المراقبة الزمانية المكانية لمؤثرات Pseudomonas syringae عبر إفراز النوع الثالث باستخدام شظايا البروتين الفلوري المنقسم. الخلية النباتية. 29 (7) ، 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
sfGFP1-10OPT المستهدفة للعضيات البلازميد< / strong>Park ، E. ، Lee ، H. Y. ، Woo ، J. ، Choi ، D. & amp دينيش كومار ، إس بي المراقبة الزمانية المكانية لمؤثرات Pseudomonas syringae عبر إفراز النوع الثالث باستخدام شظايا البروتين الفلوري المنقسم. الخلية النباتية. 29 (7) ، 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-tagged متجه متوافق مع البوابة لنظام توصيل المستجيب المستند إلى T3SSبارك ، إي ، لي ، إتش واي ، وو ، جيه ، تشوي ، دي وأمبير دينيش كومار ، إس بي المراقبة الزمانية المكانية لمؤثرات Pseudomonas syringae عبر إفراز النوع الثالث باستخدام شظايا البروتين الفلوري المنقسم. الخلية النباتية. 29 (7) ، 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة الكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة الكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة الكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة الكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاوم للجنتاميسين (25 ميكروغرام / مل)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة للجنتاميسين (25 ميكروغرام / مل)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاوم للجنتاميسين (25 ميكروغرام / مل)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة للجنتاميسين (25 ميكروغرام / مل)
<قوية >سلالات بكتيرية < / قوية >
< م > Agrobacterium tumefaciens < / em >GV3101Csaba Koncz و Jeff Schell ، يتحكم محفز جين TL-DNA 5 في التعبير الخاص بالأنسجة للجينات الخيمرية التي يحملها نوع جديد من ناقل Agrobacterium الثنائي. مول جنرال جينيت. 204,383-396 (1986); مقاومة للجنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) وريفامبيسين (50 ميكروغرام / مل)
Pseudomonas syringae< / em> pv. طماطم< em> CUCPB5500Kvitko، B. H. وآخرون. تكشف عمليات الحذف في ذخيرة Pseudomonas syringae pv. تكشف جينات مستجيب إفراز الطماطم DC3000 من النوع الثالث عن التداخل الوظيفي بين المؤثرات. بلوس باثوج. 5 (4) (2009).; مقاومة للريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل)
<قوية >مكونات الوسائط < / قوية >
< قوية > وسائط إنبات النبات < / قوية > أضف2.165 جم / لتر Murashige & مسحوق سكوج ، 10 جم / لتر سكروز إلى الماء. اضبط على درجة الحموضة 5.8 وأضف 2.2 جم / لتر نباتي. أوتوكلف.
Murashige & وسط Skoog بما في ذلك الفيتاميناتDuchefa BiochemieM0222يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
السكروزدوشيفا بيوكيميS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169<
strong>LB mediaأضف 10 جم/لتر من التربتون، 5 جم/لتر من مستخلص الخميرة، 10 جم/لتر كلوريد الصوديوم إلى الماء. بالنسبة للوسائط الصلبة ، أضف 15 جم / لتر من أجار صغير. الأوتوكلاف.  اترك المحلول يبرد إلى 55 درجة ؛ C ، وإضافة المضادات الحيوية إذا لزم الأمر.
TryptoneBD Bioscience211705
مستخلص الخميرةBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
Micro agarDuchefa BiochemieM1002
King's B media< / strong>10 جم / لتر ببتون البروتياز # 2 ، 1.5 جم / لتر اللامائي K2< / sub>HPO4< / sub> ، 15 جم / لتر من أجار إلى الماء. الأوتوكلاف. تهدئة إلى 55 درجة ؛ C وإضافة معقم 15 مل / لتر من الجلسرين ، 5 مل / لتر MgSO4< / sub> إلى الوسط. أضف المضادات الحيوية إذا لزم الأمر.
البروتيوز الببتونBD Bioscience212120
اللامائي K2< / sub>HPO4< / sub>Sigma-Aldrich1551128 USP
GlycerolDuchefa BiochemieG1345
MgSO4< / sub>Sigma-AldrichM7506
باكتو أجارBD Bioscience214010
<قوي > مانيتول غلوتامات (MG) الوسائط السائلة < / قوي>أضف 10 جم / لتر من المانيتول ، و 2 جم / لتر من حمض L-glutamic ، و 0.5 جم / لتر من KH2< / sub>PO4< / sub> ، و 0.2 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 0.2 جم / لتر من MgSO4< / sub> إلى الماء. ضبط على درجة الحموضة 7
MannitolDuchefa BiochemieM0803
L-glutamic acidDuchefa BiochemieG0707
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichNIST200B
مخزن مؤقت للتسلل10 ملي مولار MES (2- (N-مورفولينو) - حمض السلفونيك الإيثاني) ، 10 ملي مولار MgCl2 ، 150 & micro ؛ م أسيتوسيرينجون. درجة الحموضة 5.6 ؛ قم بإعداد مخزن مؤقت جديد قبل الاستخدام.
MESDuchefa BiochemieM1503قم بإعداد مخزون 100 ملي مولار (درجة الحموضة 5.6) في الماء. تعقيم الفلتر.
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266تحضير مخزون 100 ملي مولار في الماء. الأوتوكلاف.
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406تحضير مخزون 150 ملي في DMSO.
معدات / مواد
710 نظام متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزركارل زايس
أكسيو المراقب Z1 المجهر المقلوبكارل زايس
بروبيديوم يوديدThermoFisherP1304MP
المجهر متحد البؤر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Split GFP SystemEffector Protein DeliveryType III Secretion SystemConfocal MicroscopyPseudomonas SyringaeArabidopsis ThalianaNicotiana BenthamianasfGFP11 TagOrganelle TargetingFluorescence Reconstitution

Related Articles