مقالة منهجية

كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية

7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57724

⸱

مايو 31, 2018

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Louisville, 2Department of Chemistry, Ball State University

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا البروتوكول كالوريسبيروميتري، والقياس المباشر والمتزامن لتبديد الحرارة والتنفس، والتي تنص على اتباع نهج موسع لتقييم الطاقة الأيض. يتم استخدام هذا الأسلوب لتقييم مساهمة الممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء لاستخدام الطاقة عن طريق رصد تدفق إجمالي الطاقة الخلوية.

الملخص

العديد من خطوط الخلايا المستخدمة في الأبحاث البيولوجية والطبية الأساسية الحفاظ على التوازن الطاقة من خلال مزيج من التنفس الهوائي واللاهوائي على السواء. ومع ذلك، مدى إسهام كل المسارات في المناظر الطبيعية لإنتاج الطاقة الخلوية التغاضي عن استمرار. تحول الخلايا المستزرعة في تشبع مستويات الجلوكوز في كثير من الأحيان إظهار تبعية انخفاض في الفسفرة لإنتاج ATP، والتي عوضت زيادة في مستوى الركازة الفسفرة. ويسمح هذا التحول في الأيض اتزان الخلايا تنتشر على الرغم من وجود السموم المتقدرية. في إهمال اتزان الأيضية تغيير الخلايا المحولة، قد يساء تفسير نتائج فحص الأدوية منذ يحتمل أن تكون الآثار ميتوتوكسيك قد لا يمكن الكشف عنها باستخدام خطوط الخلايا نموذج مثقف حضور الجلوكوز عالية تركيزات. ويصف هذا البروتوكول الاقتران من اثنين من التقنيات القوية، ريسبيروميتري، والقياس، مما يسمح للتقييم الكمي وموسع للمساهمات سواء الهوائية أو اللاهوائية لإنتاج ATP الخلوي. ريسبيريشنز الهوائية واللاهوائية على حد سواء توليد الحرارة، التي يمكن رصدها عن طريق القياس. ومن ناحية أخرى، يمكن قياس معدل استهلاك الأوكسجين إلى تقييم مدى التنفس الهوائي. عندما يتم قياس الفقد الحراري واستهلاك الأكسجين في نفس الوقت، يمكن تحديد نسبة كالوريسبيروميتريك. يمكن بعد ذلك مقارنة القيمة التي تم الحصول عليها تجريبيا إلى أوكسيكالوريك نظرية تعادل ويمكن الحكم على مدى التنفس اللاهوائي. وهكذا، كالوريسبيروميتري يوفر طريقة فريدة لتحليل طائفة واسعة من المسائل البيولوجية، بما في ذلك تطوير العقاقير والنمو الميكروبي والاستقلاب الأساسية تحت نورموكسيك وظروف التاكسج.

المقدمة

في الأنظمة البيولوجية، تغير الحرارة-الإصدار أو محتوى حراري أثناء التمثيل الغذائي عادة رصد أما مباشرة (عن طريق القياس المباشر) أو غير مباشر عن طريق استهلاك2 س و/أو إنتاج2 CO (عبر ريسبيروميتري). لسوء الحظ، عندما تستخدم هذه التقنيات بمعزل عن غيرها، المعلومات الهامة المفقودة، مثل مساهمة مسارات اللاهوائية الأيض الخلوية. كالوريسبيروميتري هي تقنية قوية تعتمد على قياس المتزامنة لتبديد الحرارة والتنفس. كالوريسبيروميتريك أعمال رائدة التحقيق الأيض اللاهوائي في خلايا الثدييات اﻷوكسيجين تماما وأظهرت المساهمات المتزامنة للممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء إلى التوازن الطاقة على الرغم من الخلايا المحولة يجري في 1من البيئة اﻷوكسيجين تماما. منذ ذلك الحين طبق كالوريسبيروميتري على طائفة واسعة من المسائل البيولوجية. وتشمل بعض الأمثلة على دراسة علم الطاقة الحيوانية في مستويات منخفضة الأكسجين، وآثار مبيدات الأعشاب والاستروجين في الخياشيم ذات الصدفتين والتمثيل الغذائي للكائنات الأرضية والتحلل الميكروبي للتربة العضوية هذه المسألة2، 3 , 4 , 5 , 6-وعلاوة على ذلك، قد كالوريسبيروميتري preconditioning الأيضية كيف كشفت قبل تجميد يحسن نعد الثدييات خلايا7. كل نهج، القياس وريسبيروميتري، وقد ازداد بشكل مستقل معرفتنا بالاستقلاب الخلوي والعضوي. ومع ذلك، تظل الأسئلة البيولوجية الأساسية التي يمكن الإجابة عن طريق استخدام كالوريسبيروميتري غير مستكشفة نسبيا.

القانون في هيس تنص على أن تغيير إجمالي محتوى حراري رد فعل مستقل عن المسار بين الدول الأولية والنهائية. على سبيل المثال، تغيير مجموع المحتوى الحراري لمسار الكيمياء الحيوية هو مجموع التغير في انثالبيس لجميع ردود الفعل داخل المسار. القياس يقدم نهجاً في الوقت الحقيقي لقياس إنتاج الحرارة الخلوية، مما يكشف الممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء دون تمييز. ويستند هذا على أساس أن يتم تبادل لا الطاقة في النظام إلا من خلال الجدران ampule التجريبية8. تغيير في تبديد الحرارة من مساوياً للتغيير في محتوى حراري صدر من جميع التفاعلات الأيضية في أمبولي. وهكذا، يرتبط محتوى حراري سلبي إلى فقدان الحرارة من النظام. أبحاث مستفيضة على مدى العقود الأربعة الماضية اتسم المشهد دينامي حراري الانتقاض وابتناء. ويمثل هذا ارتفاع مطرد في المقالات والبحوث الموجودة تحت مصطلحات البحث "البيولوجية" و "القياس" كما فهرستها بالولايات المتحدة الوطنية مكتبة للطب (NLM) في "المعاهد الوطنية للصحة" (PubMed). البحث يكشف عن أنه قبل عام 1970، ما مجموعة 27 المنشورات المرجعية القياس البيولوجي؛ وفي الوقت نفسه، استخدمت المنشورات 546 في عام 2016 وحدها، التقنية.

أساليب المسعريه راسخة لتحديد إنتاج الحرارة. ومع ذلك، يمنح قدرا أكبر من المرونة لحسم قيمة ريسبيروميتريك. يمكن أن تتكون بقياس ريسبيروميتريك من س2،2من أول أكسيد الكربون، أو كل من س2 و CO2. علاوة على ذلك، يمكن به قياس س2 أو CO2 تقنيات مختلفة، بما في ذلك أوبتروديس وكهربائي من نوع كلارك والانضباطي صمام ثنائي ليزر الامتصاص الطيفي7،9،10 ،11. المتوسطة للخلايا المستزرعة أثناء إنتاج2 CO مقياس قيمة في كثير من الدراسات ريسبيروميتريك، كثيرا ما يستخدم نظام المخزن مؤقت بيكاربونيك لدرجة الحموضة التحكم12،13. لتجنب المضاعفات الناجمة عن قياس2 CO في النظام بيكربونات، يستخدم البروتوكول التالي كالوريسبيروميتري الخلايا في ثقافة س2 كمعلمة ريسبيروميتريك الوحيد.

وبالتزامن مع قياس تدفق الأكسجين، ريسبيروميتيرس معينة (انظر الجدول للمواد) مصممة لتقييمات مفصلة للوظيفة المتقدرية. بروتوكولات (كوي) الركيزة-أونكوبلير-مثبط-معايرات هي راسخة ومتوافقة مع تجارب مصممة لقياس غشاء الأكسجين المحتملة أو رد الفعل الأنواع (روس) تشكيل14. البروتوكول المقدم من أجل كالوريسبيروميتري خلايا سليمة متوافق مع مقدمة أونكوبليرس الكيميائية مثل الكربونيل السيانيد-فتريفلوروميثوكسيفينيلهيدرازوني (فككب) وأوليجوميسين و0و1-ATP synthase المانع. عن طريق إضافة فككب، يمكن أن يكون استهلاك الأكسجين أونكوبليد من إنتاج ATP، ومفيدة تقييم أثر العلاجات المحتملة على أداء المتقدرية15. وعلاوة على ذلك، إضافة أوليجوميسين ينير مدى تسرب للتنفس. وهكذا، ريسبيروميتريك القياسات التي يتم إجراؤها أثناء كالوريسبيروميتري متوافقة مع البروتوكولات واسعة النطاق تهدف إلى توضيح فسيولوجيا المتقدرية.

يسمح قياس المتزامن لتبديد الحرارة وتدفق الأكسجين لحساب نسبة كالوريسبيروميتريك (الجمهورية التشيكية). ثم تتم مقارنة هذه النسبة ثورنتون الثابت أو أوكسيكالوريك نظرية تعادل، التي تتراوح بين-430 إلى-480 kJ mol-1 استناداً إلى خط الخلية أو النسيج لمصلحة و ركائز الكربون المكملة1، 16. وهكذا، يكشف نسبة CR أكثر سلبية زيادة المساهمات من مسارات اللاهوائية للنشاط الأيضي عموما. على سبيل المثال، تتراوح نسبة CR تنفس أنسجة العضلات الروتينية دون أداء العمل النشط-448-468 kJ mol-1 التي تدخل في نطاق ما يعادل17،أوكسيكالوريك النظري18. وفي الوقت نفسه، الخلايا السرطانية الثديية مثقف في المتوسط هو ارتفاع في مستوى السكر في عرض تخمير حمض الالكتيك المعزز عقب تحلل والمنخفضة نسبيا لمشاركة المتقدرية19. نتائج هذا النمط الظاهري في نسب CR في النطاق من-490 إلى-800 كيلو جول مول-1، مما يدل على تزايد مشاركة مسارات اللاهوائية في الأيض الخلوية كما أشار إلى ذلك أكثر سلبية CR نسب1،7، ،من 1620.

الموزعين على حد سواء تجارية وغير هادفة للربح الخلايا والأنسجة حاليا خطوط الخلايا العرض من أكثر من 150 نوعا، مع ما يقرب من 4,000 من خطوط الخلايا المستمدة من البشر. خطوط خلية مخلدة هي أدوات ملائمة لتقييم سمية المداواة المحتملين، كثير منها قد مباشر أو غير مباشر تتداخل مع مهام المتقدرية بسرعة. باستخدام الخلايا المحولة خلال فحص المخدرات قد تكون محدودة القيمة التنبؤية جزئيا بسبب تأثير واربورغ، سمة مميزة لكثير من أنواع السرطان. في كثير من الأحيان، سرطانات توليد ATP من الركازة المستوى الفسفرة والحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال من خلال إنتاج لاكتات دون الانخراط الكامل في ميتوكندريا تحت الظروف الهوائية19. تطوير المستحضرات الصيدلانية المعروف مكلفة وغير فعالة، مع ما يقرب من 8 من أصل 9 مركبات اختبارها في التجارب السريرية البشرية عاجزة عن تحقيق السوق الموافقة على21. بينما العلاجات المحتملة قد تمر الفحص الأولى بسبب انخفاض سيتوتوكسيسيتي في خطوط الخلايا، فمن الممكن أن بعض هذه المركبات ميتوتوكسيك. دون وسيلة مناسبة للكشف عن كيف يمكن أن يعوق هذه السموم ميزان الطاقة في الخلايا الأولية التي لا يتم عرض تأثير واربورغ، المعلومات الهامة غالباً ما بدأ الإفراط، bottlenecking التنمية العلاجية في المراحل المبكرة.

كالوريسبيروميتري نهج عملي موسع لتحليل النشاط الأيضي في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك الخلايا والأنسجة. جوهر البروتوكول عرض متوافق مع مجموعة من التطبيقات. ومع ذلك، حددت واحدة من المضاعفات،. وكثيراً ما تستزرع خلايا مخلدة في متوسط خالية من السكر وتستكمل مع اللبن لزيادة مساهمة الفسفرة (أوكسفوس) لإنتاج الطاقة، من أجل توعية الخلايا المحتملة ميتوتوكسينس22، 23. هذا إعادة برمجة الأيضية ويبدو أن يحجب التحليل عند وضع العينات في امبولات الفولاذ المقاوم للصدأ تستخدم قبل مسعر15. الخلايا المزروعة في متوسط جلوكوز مواصلة الانخراط في النشاط الأيضي عالية لعدة ساعات. وفي الوقت نفسه، الخلايا المستزرعة في المتوسط اللبن انخفاض إنتاج الحرارة داخل 30 دقيقة من وضعهم في أمبولي، مما يجعل قياسات تقتصر على النقاط الزمنية التجريبية المبكرة. ويعوق هذا السلوك، لسوء الحظ، الفرصة لتقييم انتشارها الخلوية. وعلى الرغم من هذا القيد محددة، معظم تطبيقات متوافقة مع التحليل كالوريسبيروميتريك ويمكن الحصول على معلومات مفصلة الأيضية عن طريق هذا النهج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-خلية ثقافة

  1. الحفاظ على البشرية سرطانه الخلية الكبدية (HepG2) الخلايا في المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) وركائز إضافية (الجلوكوز 10 ملم والجلوتامين 2 مم وبيروفات 1 مم) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة خلية (5% CO2 ، 95% من الهواء، والرطوبة 100 ٪).
    ملاحظة: استخدام صياغة دميم أعلاه عند الرجوع إلى دميم في خطوات لاحقة ريسبيروميتري والقياس.
  2. لوحة الخلايا في 1 × 106 خلايا الواحدة 100 مم لوحة الثقافة وثقافة فرعية لها كل 7 أيام أو قبل أن تصل إلى 90% كونفلوينسي وتجديد في المتوسط كل 3-4 أيام.
  3. إجراء التجارب عندما تكون روافد 60-80% من الخلايا.

2-إعداد ريسبيروميتير ومسعر

  1. بيبيت مل 2.2 من دميم في قاعة ريسبيروميتير، إدراج السدادة كاملا، وضبطه باستخدام أداة مباعدة سداده للسماح بنشر الأوكسجين المثلى من الجو إلى متوسط.
  2. يقلب باستمرار في 37 درجة مئوية حتى تركيز الأكسجين (تتبع الأزرق) وتدفق الأوكسجين (تتبع الأحمر) مستقرة. ضمان البرامج ريسبيروميتير مبرمجة لحساب للذوبان الأوكسجين من الوسيلة المستخدمة في التجربة.
    ملاحظة: وسائل الإعلام المختلفة لديها معاملات الذوبان الأوكسجين مختلفة (مثلاً، دميم = 0.92).
  3. بعد استقرار تركيز الأكسجين في دميم مع فتح الدائرة، حدد جزء ثابت من تتبع تركيز الأكسجين ومعايرة تشبع الهواء 100%.
  4. معايرة للأكسجين 0% تحديد جزء ثابت من تتبع تركيز الأوكسجين عند لا الأكسجين موجود في الدائرة. القيام بهذه الخطوة بعد 20 ميليلتر المعايرة من 230 ملم ديثيونيتي الصوديوم أو بعد تستهلك الأوكسجين جميع العينات البيولوجية في نهاية التجربة.
  5. بعد إغلاق السدادة معايرة الهواء 100% من ريسبيروميتير، والتأكد من أن لا فقاعات موجودة في الدائرة.
    ملاحظة: زيادة طفيفة في تدفق الأكسجين سوف يتم الكشف عن في قاعة مغلقة كأجهزة الاستشعار الأوكسجين بولاروجرافيك (POS) يستهلك الأوكسجين من أجل قياس ضغط الأكسجين الجزئي.
  6. بعد ~ 10 دقيقة من سداده إغلاق، تأكيد أن ريسبيروميتير جاهز للخلايا HepG2 بمراقبة تدفق الأوكسجين مستقرة.
    ملاحظة: مسعر المستخدمة هنا يستخدم امبولات الفولاذ المقاوم للصدأ، ويتطلب ampule واحدة لاستخدامها كمرجع.
  7. إضافة 2.5 مل ح2س (dH2س) [حجم متساوية العينات (الخطوة 4)] إلى أمبولي مرجع مسعر وتشديد عملية النداءات الموحدة، باستخدام كماشة إذا لزم الأمر. تنظيف ampule مختومة مع تدفق الهواء وانخفاض أمبولي لوضع 1 في قناة الإشارة مسعر ببطء. تبقى في الموضع 1 حتى يتم إعداد العينات البيولوجية.

3-إعداد الخلايا HepG2 ريسبيروميتري والقياس

  1. وتؤكد أن ريسبيروميتير ومسعر هي إعداد ومعايرة. حارة دميم والتربسين إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. إضافة دميم طازجة 100 ملم اللوحة والمكان في الحاضنة للسماح للموازنة المتوسط لكل من أول أكسيد الكربون2 ودرجة الحرارة.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذه الوسيلة للتجربة القياس، وبحجم مناسب يعتمد على عدد امبولات التي سيتم استخدامها.
  3. تأكيد مع مجهر مقلوب خفيفة أن الخلايا في روافد 60-80%، ثم أغسل 2 x لوحة 100 ملم مع 10 مل من درجة حرارة الغرفة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
  4. أضف 3 مل التربسين ج 37 ° لوحة 100 ملم من الخلايا واحتضانها لهم لمدة 7-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية. تحييد التربسين مع 3 مل من 37 ° "ج دميم" وتعليق بلطف بيبيتينج من 20 مرات ~ مع بيبيت 5 مل.
  5. نقل مل 6 خلايا حراكه في دميم والتربسين في أنبوب مخروطي 15 مل عقيمة والطرد المركزي أنه لمدة 5 دقائق في 175 س زاي إزالة السائل دون إزعاج بيليه الخلية.
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في ~ 5 مل من دميم وبيبيت من دقة للتأكد من الخلايا هي بما فيه الكفاية فصلها عن بعضها البعض.
  7. إزالة ~ 100 ميكروليتر من عينة مختلطة جيدا وأداء عدد خلايا شامل الاستفادة من جميع الميادين 8 في هيموسيتوميتير لتحديد العدد الإجمالي للخلايا. ثم حساب الحجم لاستثارة الخلايا من أجل توليد ~ 2 × 106 خلايا للواحد 50 ميليلتر.
    ملاحظة: هذا يضمن أن تتم إضافة 2 × 106 خلايا لكل دائرة من ريسبيروميتير مع التشرد متوسط الحد الأدنى.
  8. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 175 س زاي ريسوسبيند بيليه في حجم دميم المحسوبة من الخطوة 3، 7.
  9. نفذ عدد خلايا لتحديد الحجم المطلوب لحقن الخلايا 2 × 106 كل دائرة في ريسبيروميتير (وينبغي أن يكون هذا ~ 50 ميليلتر). تخزين الخلايا لقياس ريسبيروميتريك على الجليد حتى جاهزة.
  10. بينما تكون العينة خلية تتركز على الجليد، تحديد التخفيف اللازم لإنتاج بتركيز 1 × 105 خلايا/مليلتر بالنسبة القياس.
  11. تخلط العينة جيدا وإعداد ~ 3 مل الخلايا في 1 × 105 خلايا/مل في دميم لكل أمبولي.
    ملاحظة: يجب أن يكون دميم المستخدمة لتمييع عينة المتوسطة متوازن إعدادها في الخطوة 3، 3.

4-القياس

  1. ضمان أن مسعر متصل بالكمبيوتر وإشارة المسعريه في µW يمكن ملاحظتها ومستقرة.
  2. إضافة إلى كل ampule 2.5 مل الخلايا في 1 × 105 خلايا/مل (~2.5 x 105 خلايا)، ضمان الهواء كافية بين غطاء أمبولي والمتوسطة للسماح بنشر الغاز.
  3. فورا تشديد عملية النداءات الموحدة، باستخدام كماشة إذا لزم الأمر. تنظيف ampule مختومة، باستخدام تدفق الهواء لإزالة أي حطام الخارجية، وانخفاض أمبولي لوضع 1 مسعر ببطء. سجل الوقت خفضت أمبولي موقف 1.
  4. السماح أمبولي على الجلوس في الموضع 1 لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: الخلايا خلال هذه الفترة 15 دقيقة، أن حقن ريسبيروميتير (الخطوة 5). وهذا ما يضمن أن يتم استخدام نفس الفاصل الزمني لإنتاج الحرارة واستهلاك الأوكسجين عندما يتم تحديد نسبة CR.
  5. وبعد 15 دقيقة في موقف 1، انخفاض ببطء امبولات كل مرجع وعينه لموقف 2. تسجيل الوقت خفضت امبولات والتدبير لمدة 30 دقيقة على الأقل.

5-ريسبيروميتري

  1. خلال الذي أمبولي في الموضع 1 في مسعر الفاصل الزمني 15 دقيقة، تبدأ الدراسات ريسبيروميتريك.
  2. دقة مزج العينة الخلية بيبيتينج لضمان حل متجانسة وحقن < 50 ميكروليتر من عينة خلية في كل دائرة من ريسبيروميتير لتركيز نهائي من ~ 2 × 106 خلايا/الدائرة. سجل الوقت يتم حقن الخلايا ريسبيروميتير.
  3. بعد الحقن، أثارت الخلايا HepG2 هي باستمرار عند 37 درجة مئوية. الانتظار على الأقل 20-30 دقيقة لكل استقرار تدفق الأوكسجين وانخفاض مطرد في تركيز الأكسجين.
  4. حدد علامة التبويب س2 التمويه الواحدة الخامس على يمين الشاشة وتسليط الضوء على جزء ثابت من تدفق الأوكسجين. حدد علامات، ثم من إحصاءات وبيانات السجل للتمويه2 س كل ت. سيتم استخدام هذا التسجيل في حساب نسبة CR.
    ملاحظة: الخطوات 5.5 و 5.6 اختيارية. وسيتم الكشف عن تسرب في التنفس والتنفس أونكوبليد القصوى بالمعايرة أوليجوميسين وفككب.
  5. حقن 1 ميليلتر من أوليجوميسين 4 مغ/مل في كل دائرة وتسمح ~ 10 دقيقة لاستقرار تدفق الأوكسجين. تسرب مستقرة سجل معدل التنفس باتباع الخطوات التي يؤديها في 5.4 تسليط الضوء على جزء ثابت من تتبع تدفق الأوكسجين بعد إضافة أوليجوميسين.
  6. تيتراتي حقن 2-ميليلتر من 0.2 مم فككب في كل دائرة، مما يسمح للأكسجين التمويه الاستقرار بعد كل حقن. مواصلة المعايرة حتى يتم التوصل إلى تدفق القصوى، كما هو مبين بانخفاض طفيف في المعايرة فككب اللاحقة. سجل معدل التنفس مستقرة خلال الجريان القصوى.

6-حساب النسبة كالوريسبيروميتريك

  1. إجراء عد نهائي خلية من العينات التي أعدت في ~ 1 × 105 خلايا/مل تستخدم جميع ميادين 8 هيموسيتوميتير لتحديد العدد الإجمالي للخلايا إضافة إلى أمبولي (2.5 مل).
  2. تحديد وقت لتسجيل القياسات من مسعر وريسبيروميتير فيه إشارات ثابتة موجودة في أوقات مماثلة. مرجع تسجيل الوقت عندما خفضت في أمبولي إلى موقف 2 والوقت من حقن الخلايا في ريسبيروميتير.
  3. سجل إنتاج الحرارة عن طريق وضع المؤشر فوق تتبع عرض الإخراج الحرارة ل ampule محترمة في الوقت الذي تحدد في الخطوة وصريح كخلايا µW/مليون. جمع بيانات استهلاك الأكسجين، وضمان أن يتم التعبير عنه ك pmol س2 x s-1 × ملايين الخلايا.
  4. لحساب نسبة CR، أولاً تحويل µW كيلوجول/s، ومن ثم تقسيم كيلوجول/s خلال mol/س2ق للحصول على نسبة CR معبراً كيلوجول/مول س2. ملاحظة: يتضمن نسبة CR كيلوجول/مول س2.
    (انظر 1 ملف تكميلي)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إمكانية تكرار نتائج القياسات كالوريسبيروميتريك يعتمد على تحضير عينة سليمة ومتسقة. عينات أعد من خلية ثقافة ينبغي إلا إذا هي متضخمة اللوحات، كما يمكن أن يصبح عدد خلايا غير دقيقة بسبب التثاقل. كذلك، قد تحدث تدفقات الحرارة المخفضة بسبب نشر الركازة محدودة في الخلايا تحبب خفيف. لذلك، عند استخدام خلايا ملتصقة، من الأهمية بمكان لتحديد لوحة مع كونفلوينسي بين 60-80% وتغيير متوسطة 24 ساعة قبل التجربة.

معايرة الآلي السليم والصيانة أيضا حاسمة بالنسبة لقياسات كالوريسبيروميتريك الزاخر بالمعلومات واستنساخه. أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كالوريسبيروميتري يهدف إلى تقييم كمي مساهمات الممرات الهوائية واللاهوائية للنشاط الأيضي والحصول على صورة مركبة لتدفق الطاقة الخلوية. يتم ذلك عن طريق قياس متزامن لتبديد الحرارة وتدفق الأوكسجين تليها مقارنة مع أوكسيكالوريك نظرية تعادل نسبة CR المحسوبة. يجب النظر في عدة خطوات حاسمة لبيانات موثوق بها واستنساخه. المحافظة على ثقافة الخلية معقمة وصحية أمر بالغ الأهمية. قد يؤدي التلوث بالبكتريا أو الفطريات في استهلاك الحرارة المختلسة الإنتاج أو الأكسجين، مما يجعل نسبة CR لا معنى لها. خلية غير لائق، وكذلك التهم، عينة الفقراء الاخت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنحه "مؤسسة العلوم الوطنية" تشي-160944 كونكلي هاء ماري ومايكل ألف منز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا HepG2مجموعة الثقافة من النوع الأمريكيHB-8065الخلايا المستخدمة في قياس السعرات الحرارية
O2k-RespirometerOroboros Instruments10022-02مقياس التنفس
LKB 2277 مراقب النشاط الحراري (TAM)الحرارة ABبواسطة TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM)Thermofisher Scientific11360070تمت إضافة محلول 100x إلى
مصل الأبقار الجنيني المتوسط DMEM - Premiuim SelectAtlanta BiologicalsS11550تمت إضافته إلى 10٪ في DMEM المتوسطة
Trypsn-EDTA (0.25٪)كاشف تفككالخلايا ThermofisherScientific
25200072 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes< / em>Sigma Aldrich  O4876مثبط الميتوكوندريا
كاربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازونسيجما ألدريتشC2920الميتوكوندريا Uncoupler
Corning 100 مم طبق ثقافة TCCorning Corporation430167طبق زراعة الأنسجة
الجلوكوز ، مسحوقThermofisher Scientific15023021Glucose ل DMEM
متوسط Galactose ، مسحوقفيشرBP656500العلمي جالاكتوز لوسط DMEM
L-Glutamine (200 ملم)Thermofisher Scientific25030081الجلوتامين لوسط
DMEM DMEM ، بدون جلوكوزThermofisher Scientific11966025 وسيط زراعة الخلايا
تم شراء مقياس معالج

المراجع

  1. Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
  2. Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
  3. Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
  4. Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
  5. Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
  6. Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
  7. Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
  8. Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
  9. Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
  10. Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
  11. Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
  12. Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
  13. Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
  14. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
  15. Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
  16. Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
  17. Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
  18. Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
  19. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  20. Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
  21. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
  22. Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
  23. Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
  24. Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HepG2

مقالات ذات صلة