ويصف هذا البروتوكول كالوريسبيروميتري، والقياس المباشر والمتزامن لتبديد الحرارة والتنفس، والتي تنص على اتباع نهج موسع لتقييم الطاقة الأيض. يتم استخدام هذا الأسلوب لتقييم مساهمة الممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء لاستخدام الطاقة عن طريق رصد تدفق إجمالي الطاقة الخلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العديد من خطوط الخلايا المستخدمة في الأبحاث البيولوجية والطبية الأساسية الحفاظ على التوازن الطاقة من خلال مزيج من التنفس الهوائي واللاهوائي على السواء. ومع ذلك، مدى إسهام كل المسارات في المناظر الطبيعية لإنتاج الطاقة الخلوية التغاضي عن استمرار. تحول الخلايا المستزرعة في تشبع مستويات الجلوكوز في كثير من الأحيان إظهار تبعية انخفاض في الفسفرة لإنتاج ATP، والتي عوضت زيادة في مستوى الركازة الفسفرة. ويسمح هذا التحول في الأيض اتزان الخلايا تنتشر على الرغم من وجود السموم المتقدرية. في إهمال اتزان الأيضية تغيير الخلايا المحولة، قد يساء تفسير نتائج فحص الأدوية منذ يحتمل أن تكون الآثار ميتوتوكسيك قد لا يمكن الكشف عنها باستخدام خطوط الخلايا نموذج مثقف حضور الجلوكوز عالية تركيزات. ويصف هذا البروتوكول الاقتران من اثنين من التقنيات القوية، ريسبيروميتري، والقياس، مما يسمح للتقييم الكمي وموسع للمساهمات سواء الهوائية أو اللاهوائية لإنتاج ATP الخلوي. ريسبيريشنز الهوائية واللاهوائية على حد سواء توليد الحرارة، التي يمكن رصدها عن طريق القياس. ومن ناحية أخرى، يمكن قياس معدل استهلاك الأوكسجين إلى تقييم مدى التنفس الهوائي. عندما يتم قياس الفقد الحراري واستهلاك الأكسجين في نفس الوقت، يمكن تحديد نسبة كالوريسبيروميتريك. يمكن بعد ذلك مقارنة القيمة التي تم الحصول عليها تجريبيا إلى أوكسيكالوريك نظرية تعادل ويمكن الحكم على مدى التنفس اللاهوائي. وهكذا، كالوريسبيروميتري يوفر طريقة فريدة لتحليل طائفة واسعة من المسائل البيولوجية، بما في ذلك تطوير العقاقير والنمو الميكروبي والاستقلاب الأساسية تحت نورموكسيك وظروف التاكسج.
المقدمة
في الأنظمة البيولوجية، تغير الحرارة-الإصدار أو محتوى حراري أثناء التمثيل الغذائي عادة رصد أما مباشرة (عن طريق القياس المباشر) أو غير مباشر عن طريق استهلاك2 س و/أو إنتاج2 CO (عبر ريسبيروميتري). لسوء الحظ، عندما تستخدم هذه التقنيات بمعزل عن غيرها، المعلومات الهامة المفقودة، مثل مساهمة مسارات اللاهوائية الأيض الخلوية. كالوريسبيروميتري هي تقنية قوية تعتمد على قياس المتزامنة لتبديد الحرارة والتنفس. كالوريسبيروميتريك أعمال رائدة التحقيق الأيض اللاهوائي في خلايا الثدييات اﻷوكسيجين تماما وأظهرت المساهمات المتزامنة للممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء إلى التوازن الطاقة على الرغم من الخلايا المحولة يجري في 1من البيئة ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-خلية ثقافة
- الحفاظ على البشرية سرطانه الخلية الكبدية (HepG2) الخلايا في المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) وركائز إضافية (الجلوكوز 10 ملم والجلوتامين 2 مم وبيروفات 1 مم) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة خلية (5% CO2 ، 95% من الهواء، والرطوبة 100 ٪).
ملاحظة: استخدام صياغة دميم أعلاه عند الرجوع إلى دميم في خطوات لاحقة ريسبيروميتري والقياس. - لوحة الخلايا في 1 × 106 خلايا الواحدة 100 مم لوحة الثقافة وثقافة فرعية لها كل 7 أيام أو قبل أن تصل إلى 90% كونفلوينسي وتجديد في المتوسط كل 3-4 أيام.
- إجراء التجارب عندما تكون روافد 60-80% من الخلايا.
2-إعد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إمكانية تكرار نتائج القياسات كالوريسبيروميتريك يعتمد على تحضير عينة سليمة ومتسقة. عينات أعد من خلية ثقافة ينبغي إلا إذا هي متضخمة اللوحات، كما يمكن أن يصبح عدد خلايا غير دقيقة بسبب التثاقل. كذلك، قد تحدث تدفقات الحرارة المخفضة بسبب نشر الركازة محدودة في الخلايا تحبب خفيف. لذلك، عند استخدام خلايا ملتصقة، من الأهمية بمكان لتحديد لوحة مع كونفلوينسي بين 60-80% وتغيير متوسطة 24 ساعة قبل التجربة.
معايرة الآلي السليم والصيانة أيضا حاسمة بالنسبة لقياسات كالوريسبيروميتريك الزاخر بالمعلومات واستنساخه. أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كالوريسبيروميتري يهدف إلى تقييم كمي مساهمات الممرات الهوائية واللاهوائية للنشاط الأيضي والحصول على صورة مركبة لتدفق الطاقة الخلوية. يتم ذلك عن طريق قياس متزامن لتبديد الحرارة وتدفق الأوكسجين تليها مقارنة مع أوكسيكالوريك نظرية تعادل نسبة CR المحسوبة. يجب النظر في عدة خطوات حاسمة لبيانات موثوق بها واستنساخه. المحافظة على ثقافة الخلية معقمة وصحية أمر بالغ الأهمية. قد يؤدي التلوث بالبكتريا أو الفطريات في استهلاك الحرارة المختلسة الإنتاج أو الأكسجين، مما يجعل نسبة CR لا معنى لها. خلية غير لائق، وكذلك التهم، عينة الفقراء الاخت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنحه "مؤسسة العلوم الوطنية" تشي-160944 كونكلي هاء ماري ومايكل ألف منز.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خلايا HepG2 | مجموعة الثقافة من النوع الأمريكي | HB-8065 | الخلايا المستخدمة في قياس السعرات الحرارية |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | مقياس التنفس |
| LKB 2277 مراقب النشاط الحراري (TAM) | الحرارة AB | بواسطة TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | تمت إضافة محلول 100x إلى |
| مصل الأبقار الجنيني المتوسط DMEM - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | تمت إضافته إلى 10٪ في DMEM المتوسطة |
| Trypsn-EDTA (0.25٪) | كاشف تفكك | الخلايا Thermofisher | Scientific |
| 25200072 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes< / em> | Sigma Aldrich | O4876 | مثبط الميتوكوندريا |
| كاربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون | سيجما ألدريتش | C2920 | الميتوكوندريا Uncoupler |
| Corning 100 مم طبق ثقافة TC | Corning Corporation | 430167 | طبق زراعة الأنسجة |
| الجلوكوز ، مسحوق | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose ل DMEM |
| متوسط Galactose ، مسحوق | فيشر | BP656500 | العلمي جالاكتوز لوسط DMEM |
| L-Glutamine (200 ملم) | Thermofisher Scientific | 25030081 | الجلوتامين لوسط |
| DMEM DMEM ، بدون جلوكوز | Thermofisher Scientific | 11966025 وسيط زراعة الخلايا |
المراجع
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
