Method Article

إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

DOI:

10.3791/57739

⸱

May 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤتلف الهلاميات المائية هندسة البروتين مفيدة للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد كما أنها تسمح لألواح كاملة للعمود الفقري البوليمر، ومن ثم المكروية الخلية. هنا، نحن تصف عملية تنقية المؤتلف الايلاستين مثل البروتين وتطبيقه في تغليف خلية 3D المائية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات زراعة الأنسجة (2D) ثنائي الأبعاد كانت أساسية لفهمنا لبيولوجيا الخلية الأساسية. ومع ذلك، جمعت الافتقار إلى نظم زراعة الأنسجة 2D التقليدية مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D)، أسفر عن كبير افصل بين النتائج في المختبر و في فيفو. لمعالجة هذا القيد، وقد هندسيا الباحثين منصات زراعة الأنسجة 3D المائية التي يمكن أن تحاكي خصائص المكروية الخلية في فيفو البيوكيميائية والفيزيائية. هذا البحث قد دافع الحاجة إلى تطوير منصات المادية التي تدعم التغليف خلية ثلاثية الأبعاد وفحوصات الكيمياء الحيوية المتلقين للمعلومات. هندسة البروتينات المؤتلف يقدم مجموعة أدوات فريدة من نوعها لتصميم المواد 3D المائية والتنمية عن طريق السماح لعنصر التحكم محددة لتسلسل البروتين، وبالتالي، استطرادا، خصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية المحتملة الناتجة عن ذلك مصفوفة. نقدم هنا، على بروتوكول للتعبير عن مثل الايلاستين المستمدة من ريكومبينانتلي البروتين (ELP)، التي يمكن استخدامها للنموذج الهلاميات المائية مع الخصائص الميكانيكية بشكل مستقل الانضباطي وتركيز يجند خلية لاصقة. كذلك نقدم منهجية لتغليف الخلايا ضمن برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت اللاحقة لتضمين الخلايا لتحليل المتلقين للمعلومات والقياس الكمي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى القرن الماضي، تطورت زراعة الأنسجة (2D) ثنائي الأبعاد إلى مجموعة أدوات متكاملة لدراسة الخلية الأساسية البيولوجيا في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، أدت إلى اعتماده البروتوكولات نسبيا منخفضة التكلفة وبسيطة لثقافة الخلية 2D عبر العديد من التخصصات الطبية والبيولوجية. غير أن البحوث أظهرت السابقة أن منصات 2D التقليدية يمكن أن يؤدي إلى نتائج أن تنحرف كثيرا عن تلك التي تم جمعها في فيفو، مما تسبب في وقت ثمين والتمويل إهدار للبحوث سريرياً المنحى1،2، 3. نحن وآخرون افترض أن هذا التناقض يمكن أن يعزى إلى عدم وجود منبهات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية الأصلية المقدمة للخلايا المزروعة في 2D السطوح، التي يمكن أن تكون ضرورية للانتشار الأمثل ونضوج مختلف أنواع الخلايا.

لمعالجة هذه القيود والتعليمات الجسر الفجوة بين 2D بالدراسات في المختبر و في فيفو ، الباحثين المنصات المتقدمة المائية (3D) ثلاثي الأبعاد لتغليف خلية1،4،5 ،6. الهلاميات المائية هي مواد مثالية الخص المكروية الذاتية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) في فيفو نظراً للخصائص الميكانيكية مثل الأنسجة وهيكل منتفخة المياه التي تمكن النقل السريع للمواد الغذائية و مما يشير إلى عوامل7،8. وعلاوة على ذلك، يمكن تصميم 3D الهلاميات المائية على السيطرة المستقلة على الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية من السقالة. مصفوفة ميكانيكا9،10،،من1112 وخلية لاصقة يغاندس13،،من1415 معروفة جيدا للتأثير على الخلية السلوك في المختبر و في المجراة. وهكذا، الهلاميات المائية 3D مع خصائص الانضباطي منهاجا لدراسة العلاقات السببية بين الخلايا وبهم المكروية. تشمل معايير لمصفوفة مثالية 3D المائية تغليف خلية بسيطة وغير-السامة للخلايا، فضلا عن ألواح مستقلة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة الخصائص الميكانيكية ويقلد من زخارف لاصقة الخلية الأصلية.

كلا الاصطناعية (مثلاً.، البولي إيثيلين جليكول، حمض اللبنيك، بولي (حمض الجليكوليك)) والمستمدة من الطبيعي (مثلاً.، الجينات، الكولاجين، ماتريجيل) الهلاميات المائية بمزايا على 2D في المختبر منابر الثقافة؛ ومع ذلك، لديهم أيضا أوجه القصور الهامة التي تحد من تطبيقها. الأولى، العديد من منصات الاصطناعية والمستمدة من طبيعة الحال تتطلب الظروف القاسية كروسلينكينج التي يمكن أن تكون محتملة السمية لخلايا الثدييات، مما يؤدي إلى تناقص خلية بقاء7. بالإضافة إلى ذلك، العديد من منصات الاصطناعية تفتقر إلى بيواكتيفيتي الأصلية وتحتاج إلى أن فونكتيوناليزيد عن طريق التفاعلات الكيميائية الثانوية، التي يمكن أن تضيف زيادة تكلفة وتعقيد16. وأخيراً، بينما المواد المستمدة من طبيعة الحال تحتوي عادة على المجالات الحيوية النشطة الجوهرية، أنهم غالباً ما تعاني من ارتفاع دفعة لدفعة تقلب وغالباً ما تقتصر على تشكيل الهلام ضعيفة نسبيا7،17.

هندسة البروتينات المؤتلف ويعرض مجموعة أدوات فريدة من نوعها لتصميم مواد بالسماح بسيطرة واضحة على تسلسل البروتين، واستطراداً، سقالة الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية المحتملة للمائية النهائية18. بالإضافة إلى ذلك، بالاستفادة من الآلية البيولوجية المعروفة من الإشريكيّة القولونية (كولاي) للتعبير عن البروتينات، المواد يمكن أن تنتج فعالية من حيث التكلفة واستمرار مع تقلب محدودة في جملة-وداخل-دفعة. إيلاستين-مثل البروتين (ELP) المقدمة هنا بثلاثة مجالات الهندسة: (1) علامة T7 و His6 التي تسمح لوضع العلامات عن طريق فلوريسسينتلي معلم الأجسام المضادة، (2) في منطقة 'الايلاستين مثل' أن يمنح مرونة الخواص الميكانيكية ويسمح للمواد الكيميائية كروسلينكينج، و (3) منطقة 'الحيوية النشطة' ترميز لزخارف لاصقة الخلية.

يستند منطقتنا مثل الايلاستين المتعارف عليه (فال-برو-الغليسين-إكسا-الغليسين)5 الايلاستين تسلسل فيها أربعة من 'إكسا' مواقع من الأحماض الأمينية آيسولوسين (إيل)، ولكن يمكن أن تكون مصممة لتكون الأحماض الأمينية أي استثناء برولين. يمنح هذا التسلسل ELPs المؤتلف مع سلوك أقل درجة الحرارة (لكست) الحل الحاسمة التي يمكن استغلالها للتعبير بعد تنقية بسيطة عبر الحرارية الدراجات19،20. هذه الخاصية لكست يمكن ضبطها لتجميع حرارياً في درجات حرارة مختلفة عن طريق تعديل ضيف 'إكسا' بقايا21،22.

هنا، تم استبدال موقف 'إكسا' في واحدة من يكرر إيلاستين-مثل خمسة مع الأحماض الأمينية يسين (Lys)-عرض أمين، الذي يستخدم ل crosslinking المائية. وقد أظهرت عملنا السابق crosslinking غير-السامة للخلايا وقوية عن طريق التفاعل مع رد الفعل أمين crosslinker تيتراكيس (هيدروكسيميثيل) فوسفونيوم كلوريد (تهبك)23. متفاوتة عموما البروتين محتوى و crosslinker تركيز، نحن قادرون على إنتاج الهلاميات المائية التي يمكن ضبطها لمدى صلابة صلة فسيولوجيا نطاق (~0.5-50 الجيش الشعبي الكوري)9،23،24. بالإضافة إلى ضبط الخصائص الميكانيكية، خلية التصاق ضمن نتائج المائية من إدماج المتعارف عليه مجالات لاصقة خلية ضمن العمود الفقري للبروتين برنامج القانون البيئي. على سبيل المثال، إدراج تسلسل الأحماض الأمينية 'رجدس' فيبرونيكتين-مشتقة موسعة تسمح بالتصاق الخلايا وكونفورماشونال من المرونة، بينما سارعت، المتغير 'ردجس' غير ملزم يقيد التصاق الخلية-مصفوفة24. بتحوير نسبة لاصقة الخلية البروتينات غير لاصقة، فضلا عن تركيز البروتين الكلي، نحن قادرون على إنتاج فعالية الهلاميات المائية التي تغطي مجموعة واسعة من تركيز يجند. ريسولتانتلي، قمنا بتطوير منصة المائية مع decoupled الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية، والتي يمكن ضبطها بشكل مستقل للثقافة 3D الأمثل لمختلف أنواع الخلايا.

بالإضافة إلى تصلب مصفوفة وألواح يجند لاصقة، المؤتلف الهلاميات المائية توفر القدرة على تصميم التدهور المادي محددة الملامح، وهو أمر ضروري لنشر خلية والانتشار والهجرة ضمن سياق 3D4 , 9-هذا التدهور هو توفرها إفراز الخلية من البروتياز التي تستهدف على وجه التحديد الموسع 'رجدس'9 أو تسلسل الايلاستين مثل25. الهلاميات المائية ELP أظهرت أيضا دعم فحوصات الكيمياء الحيوية اللاحقة التي ضرورية لدراسة الجدوى الخلية ووظيفة بما في ذلك إيمونوسيتوتشيميستري، فضلا عن استخراج الحمض النووي/رنا/البروتين لعكس الكمية النسخ-البلمرة المتسلسل (قرت-PCR) والغربية لطخة9. كما استخدمت في عدد من النماذج في فيفو متغيرات برنامج القانون البيئي ومعروفة جيدا يسمح ب الجهاز المناعي26.

أخذت معا، تبدأ كمنهاج الدراسات الخلية-تغليف مواد يضم مجموعة واسعة من المزايا مقارنة بمنصات المواد الاصطناعية أو المستمدة من طبيعة الحال، غالباً ما تفتقر إلى نفس الدرجة من ألواح البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية و إمكانية تكرار نتائج. بالإضافة إلى ذلك، بسيطة وغير-السامة للخلايا استخدامها في برنامج القانون البيئي مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا (على سبيل المثال-، خلايا الفرخ الجذرية الظهرية ganglia14،24، السلف العصبية موريني9، والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية27، الأبقار تشوندروسيتيس حديثي الولادة28، الإنسان غشائي الخلايا29،30) يسمح لنموذج ذات صلة أكثر من الناحية الفسيولوجية للمحتوى 3D الذاتية مقارنة بثقافة الخلية 2D. هنا، نقدم بروتوكولا للتعبير عن المشتقة من ريكومبينانتلي، ELPs لاستخدامها كمنصة المائية الانضباطي ل 3D الخلية التغليف. كذلك نقدم منهجية تيار أسفل العلامات الفلورية والفحص المجهري [كنفوكل] من الخلايا مغلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-برنامج القانون البيئي التعبير البروتوكول

  1. يوم 1: تزايد مستعمرة كاتب
    1. إعداد لوحات أجار الأمبيسلّين والكلورامفينيكول بالتعقيم 25 غ لوريا مرق و 15 غرام من أجار الواحدة 1 لتر الماء عالي النقاوة. بمجرد قد بردت الحل إلى ~ 60 درجة مئوية، إضافة 1 مل الأمبيسلّين المخزون (100 ملغ/مل في الماء عالي النقاوة) و 1 مل من الأسهم كلورامفينيكول (34 ملغ/مل في الإيثانول 70%) 1 لتر حل أجار للتركيزات النهائية من 100 ميكروغرام/مل و 34 ميكروغرام/مل ، على التوالي. نقل 20 مل حل النهائي لاطباق بيتري 10 سم مع ماصة مصلية والسماح لاجار ترسيخ. التفاف أطباق بيتري مع بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين أطباق بيتري عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    2. خط عينة صغيرة من BL21 (DE3) بليس كولاي من مخزون بكتيرية مسبقة صنع التي تحتوي على ناقل pET15b ترميز برنامج القانون البيئي للفائدة على صفيحة أجار الأمبيسلّين والكلورامفينيكول.
      ملاحظة: حدد الأمبيسلّين والكلورامفينيكول للبكتيريا التي تحتوي على نواقل بليس و pET15b، على التوالي.
    3. ضع لوحة ستريكيد رأسا في حاضنة في 37 درجة مئوية. السماح للمستعمرات البكتيرية في النمو بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: لا احتضان لوحات لمدة أطول من ح 16 كما سوف تتحلل الأمبيسلّين ويمكن أن تشكل المستعمرات التي لا تحمل المقاومة الأمبيسلّين.
  2. يوم 2: إعداد وسائل الإعلام الثقافة والتعبير كاتب
    1. إزالة ثقافة كولاي من الحاضنة. بارافيلم اللوحة ومخزن لمدة أقصاها 4 أيام في 4 درجات مئوية.
    2. تعد قارورة ثقافة كاتب (250 مل) وقوارير ثقافة التعبير (12 × 1 لتر) والاوتوكلاف. 1 لتر وسائط التعبير، إضافة ز 47.6 من مرق رائع ومل 4 من الجلسرين إلى 1 لتر الماء عالي النقاوة في قارورة ثقافة حيرة ل 2، وكاب مع رقائق الألومنيوم.
      ملاحظة: غلة النموذجية هي البروتين 60-100 مغ/لتر من وسائط التعبير.
    3. تحميل كاتب يعقم في حاضنة تهز 37 درجة مئوية قبل دافئة، واحتضان دون إثارة الشغب.
    4. إضافة 250 ميليلتر العقيمة تصفية المخزون الأمبيسلّين (0.22 ميكرون فلتر) (100 ملغ/مل في الماء عالي النقاوة) لثقافة كاتب لتركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل. تبدأ على الفور التحريض ثقافة كاتب 250 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: يستخدم فقط لاختيار مستعمرة على لوحات أجار الكلورامفينيكول ولا يتم تضمين للثقافات السائل.
    5. تلقيح ثقافة كاتب بإضافة مستعمرة كولاي المحتوية على بلازميد تبدأ واحدة من لوحة ستريكيد وتسمح ثقافة كاتب لهزة في 37 درجة مئوية ح 16.
    6. وضع وسائل الإعلام ثقافة التعبير قوارير إلى قبل تسخينها، 37 درجة مئوية تهز حاضنات واحتضان بين عشية وضحاها دون الانفعالات حيث تكون قوارير جاهزة تلقيح في صباح اليوم التالي.
  3. يوم 3: حمل التعبير البروتين في كولاي
    1. جعل الأسهم الأمبيسلّين الطازجة والعقيمة التي تمت تصفيتها (100 ملغ/مل في الماء عالي النقاوة). أضف 1 مل أسهم الأمبيسلّين لكل قارورة من وسائط التعبير عن تركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل.
    2. يبدأ التحريض في وسائل الإعلام التعبير 250 لفة في الدقيقة.
    3. يأخذ عينة 2 مل من وسائل الإعلام من أي قارورة التعبير وإضافة إلى ومبومو فارغة لكثافة بصرية القراءة في 600 نانومتر (OD600).
    4. بعد انتهاء احتضان ثقافة كاتب ح 16، تطعيم كل قارورة التعبير بنقل 20 مل ثقافة كاتب لكل قارورة التعبير عن طريق ماصة مصلية.
    5. بعد انتهاء الانفعالات ح 1، قياس OD600 واحد من قوارير التعبير. وفي أعقاب هذه الخطوة، قياس OD600 كل 20 دقيقة، التحقق من قارورة مختلفة في كل مرة.
    6. OD600 من 0.6، خفض درجة حرارة الهزازات التي تحتوي على قوارير التعبير إلى 32 درجة مئوية.
    7. تحقق OD600 كل 10 دقيقة. OD600 من 0.8، الحث التعبير بإضافة 1 مل من 1 م، ثيوجالاكتوسيدي β-الأيزوبروبيل العقيمة التي تمت تصفيتها (إيبتج) في المياه عالي النقاوة لكل قارورة التعبير.
    8. تسمح كولاي في قوارير التعبير عن على ح 7.
    9. 20 دقيقة قبل نهاية التعبير، بارد مسبقاً الطرد مركزي الكلمة كبيرة إلى 4 درجات مئوية.
    10. جمع جميع ل 12 من وسائط التعبير في حاويات الطرد الفردي والتوازن.
    11. الطرد المركزي وسائط التعبير في > ز س 12,000 لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية باستخدام أجهزة الطرد مركزي في الطابق.
    12. من أجل إيقاف المادة طافية من كل حاوية أجهزة الطرد المركزي. باستخدام ملعقة، جمع الكريات خلية داخل كيس قفل الرمز بريدي قبل موزون.
    13. إعادة تعليق بيليه في المخزن عشر العقيمة التي تمت تصفيتها (100 مل من المخزن المؤقت كل 25 جرام بيليه) وإزالة أي فقاعات الهواء الزائدة بتلفيق بيليه. 1 لتر من المخزن المؤقت لعشر، لإضافة 5.8 غ كلوريد الصوديوم وز 1.21 من قاعدة تريس 0.37 ز من الإيثيلنديامين tetraacetic acid (يدتا) ثنائية الصوديوم ملح ثنائي هيدرات إلى 900 مل من الماء عالي النقاوة. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 وتقديمهم للأم 1 لهذه الخطوة، تكفي شرائح الأس الهيدروجيني.
    14. ضع الرمز البريدي قفل كيس يحتوي على بيليه إعادة تعليق خلية في حاوية ثانوية وتجميد في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. يوم 4-6: يمزق جدار الخلية البكتيرية عن طريق دورات تجميد أذاب
    1. إزالة بيليه المجمدة من الثلاجة والسماح له بالتحسن ببطء في 4 درجات مئوية بالانفعالات لطيف باستخدام شاكر مداري.
    2. تسمح بيليه لذوبان الجليد حتى بعض سائل موجود. إضافة ~ 30-40 ملغ من ديوكسيريبونوكليسي الأول (الدناز) لإذابة ليستي. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 1 مل فلوريد فينيلميثيلسولفونيل 100 مم (بمسف؛ مثبط البروتياز) في الايزوبروبانول في 100 مل خلية ليستي. تسمح يهز بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: إضافة الدناز وبمسف اللازمة لتجميد أذاب الدورة الأولى فقط.
      تنبيه: بمسف السمية إذا استنشق. وينبغي استخدام قناع لوجه عند التعامل مع مسحوق بمسف.
    3. حالما يتم إذابة الخلية ليستي تماما، تجميد في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو حتى تجمد تماما.
    4. كرر هذا الإجراء تجميد أذاب لما مجموعة ثلاث دورات. ترك مذاب في 4 درجات مئوية بعد التجميد أذاب الأخير. تخزين 100 ميليلتر من الخام للصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide جل التحليل الكهربي (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) في ختام تنقية.
    5. بعد ذوبان الماضي، ضبط الأس الهيدروجيني المذابة ليساتي إلى 9.0 استخدام هيدروكسيد الصوديوم م 1. لهذه الخطوة، تكفي شرائح الأس الهيدروجيني. احتضانها في 4 درجات مئوية على الأقل 1 ح (بين عشية وضحاها هو ملائم) على شاكر مداري.
  5. يوم 7-9: تنقية برنامج القانون البيئي عن طريق ركوب الدراجات الحرارية تدور الباردة والساخنة
    1. بارد النابذة الكلمة إلى 4 درجة مئوية 20 دقيقة قبل استخدام الطرد المركزي.
    2. قاسمة والتوازن المذابة في حاويات أجهزة الطرد المركزي.
    3. الطرد المركزي في العينات > س 15,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل بعد انتهاء تنقية.
      ملاحظة: بعد سينتريفوجينج، البروتين برنامج القانون البيئي ينبغي أن تظل في المادة طافية سبب إمكانية ذوبانه المرتفعة في الماء عند درجات حرارة أقل في لكست (< 32 درجة مئوية).
    4. نقل المادة طافية على حاويات أجهزة الطرد المركزي الجديدة والتوازن على نحو ملائم.
    5. إضافة كلوريد الصوديوم (NaCl) في ثلاثة أجزاء لتركيز نهائي 1 م (5.84 غ من كلوريد الصوديوم لكل 100 مل من المادة طافية). ضمان أن يتم إضافة كلوريد الصوديوم في ثلاثة أجزاء للسماح لانحلال كافية.
    6. تحرض على ح 3 في 37 درجة مئوية في 250 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز.
    7. ح 1 قبل نهاية الانفعالات، قبل الحارة الطرد مركزي الكلمة إلى 37 درجة مئوية.
    8. الطرد المركزي في > س 15,000 ز ح 1 في 37 درجة مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل بعد انتهاء تنقية وتجاهل المادة طافية المتبقية.
      ملاحظة: بعد سينتريفوجينج، البروتين برنامج القانون البيئي ينبغي أن يكون القريبون سبب في انخفاض معدلي الذوبان في الماء في درجة حرارة تزيد عن لكست (> 32 درجة مئوية).
    9. إعادة تعليق بيليه بإضافة 10 مل الماء عالي النقاوة، ويعقم كل 1 غرام بيليه. تستخدم ملعقة معدنية الهريس بيليه للمساعدة في حل البروتين.
    10. ضبط الأس الهيدروجيني المذابة إلى 9.0 استخدام هيدروكسيد الصوديوم م 1. لهذه الخطوة، تكفي شرائح الأس الهيدروجيني.
    11. تحرض بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
    12. كرر الإجراء الدراجات الحرارية تدور الباردة والساخنة لما مجموعة ثلاث دورات (أي.، كرر الخطوات 1.5.1 عن طريق 1.5.11 لثلاث دورات الكلية).
  6. 10-15 يوم: تبدأ الغسيل الكلوي وليوفيليزيشن
    1. الطرد المركزي بيليه إعادة معلقة في أجهزة الطرد مركزي مبردة مسبقاً في > س 15,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية للحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل بعد انتهاء تنقية.
    2. تحلية الحل البروتين التي دياليزينج المادة طافية المتبقية في غشاء الديال كاتشين 3.5 ضد 4 لتر ماء عالي النقاوة مبردة مسبقاً عند 4 درجة مئوية. تغيير مياه الغسيل الكلوي مرتين يوميا لما مجموعة 6 مرات ما يزيد على 3 أيام.
      ملاحظة: وحدات التخزين طافية النموذجية بين 5 و 30 مل.
    3. الطرد المركزي الحل دياليزيد في أجهزة الطرد مركزي قبل تبريد في > س 15,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية. تخزين 100 ميليلتر من المادة طافية لتحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة في نهاية التنقية.
    4. تجميد الناتجة طافية في-80 درجة مئوية في الأنابيب المخروطية قبل موزون.
    5. ليوفيليزي الحل مجمدة لمدة 3 أيام وكتلة المنتج النهائي لتحديد العائد البروتين.
    6. بارافيلم الأنابيب التي تحتوي على النهائي المجففة بالتبريد المنتج برنامج القانون البيئي ومخزن في 4 درجات مئوية.
    7. قم بتشغيل الصفحة الحزب الديمقراطي الصربي لتحديد نقاء البروتين.
      ملاحظة: تتنوع البروتوكولات للحزب الديمقراطي الصربي صفحة استناداً إلى شروط محددة [اغروس] هلام. لتجاربنا، حلت بتركيز 0.5 ملغ/مل في المياه. البروتين المجففة بالتبريد النهائي وتشغيلها في 140 الخامس لدقيقة 70-100 في هلام اكريلاميد 12% (w/v) تحت ظروف يشوه.

2-خلية التغليف في 3D الايلاستين مثل البروتين الهلاميات المائية

  1. إعداد قوالب السيليكون
    1. استخدام لكمه خزعة مع القطر المطلوب لخلق ثقوب في ورقة سيليكون سميك 0.5 مم وقطع مربعا حول كل فتحه. كرر هذه العملية لعدد قوالب المرجوة.
      ملاحظة: يمكن تعديل قطر وسمك قوالب لتطبيق معين وظروف ثقافة الخلية. في الممارسة العملية، للثقافات الخلية من 50 106 خلايا/مل، قوالب 0.5 مم سميكة مع 4 ملم و 5 ملم بأقطار ينصح للحمض النووي كافية/الجيش الملكي النيبالي واستخراج البروتين، على التوالي. إيمونوستينينج، يمكن استخدام لكمه خزعة 2 مم بدلاً من ذلك إنشاء ثلاثة ثقوب متجاورة كل قالب مربع بحيث يمكن الملون replicates ثلاثة كل بئر.
    2. قم بإزالة غلاف بلاستيكي على كل جانب من العفن الفردية مع ملاقط.
      ملاحظة: تجنب الاتصال مع سطح السيليكون مكشوفة كما يمكنك تقليل تلوث بلازما المستقبل الترابط والكفاءة.
    3. استخدام الملقط، ترتيب نفس العدد من قوالب السيليكون العارية والزجاج كوفيرسليبس (رقم 1)، قطرها 12 مم) في الصفوف على غطاء المقلوب للوحة 48-جيدا بالتناوب. وبمجرد الانتهاء، تغطي غطاء لوحة 48-جيدا لتجنب التلوث.
    4. بلازما الأوكسجين علاج غطاء كامل 48-كذلك لوحة (أي.، قوالب والشرائح الزجاجية). مباشرة بعد استخدام الملقط لعكس العفن سيليكون على ساترة زجاجية المتاخمة. اضغط بحزم على القالب لضمان الترابط. تسمح قوالب احتضانها في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      ملاحظة: سوف تختلف مدة العلاج البلازما الأكسجين تبعاً للأداة المستخدمة. الشروط النموذجية لأداتنا نافذة ضغط تشغيل بغاز بين 0.3-4 [مبر]، تدفق غاز الأكسجين في 20 سم3دور/دقيقة، وتعرض العينة للبلازما ل s 10-20.
    5. تعقيم في القوالب من التعقيم. تخزين القوالب في درجة حرارة الغرفة في بيئة معقمة حتى الاستخدام.
      ملاحظة: القوالب يمكن تخزينها في هذه المرحلة إلى أجل غير مسمى.
  2. إعداد الحل بروتين الايلاستين مثل الأسهم
    1. إزالة برنامج القانون البيئي المجففة بالتبريد من مخزن 4 درجات مئوية. الحارة البروتين إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح أنبوب لضمان لا التكثيف يبني على البروتين على مدى الاستخدام المتكرر.
    2. حل برنامج القانون البيئي في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) في 4 درجات مئوية مع التحريض المستمر (أي.، الغزل) بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: تبدأ حل الأسهم التركيز سوف كذلك إضعاف بالإضافة إلى حل كروسلينكير بنسبة حجمية المعرفة من قبل المستخدم. على سبيل المثال، لتركيز برنامج القانون البيئي نهائي 3% (w/v)، إعداد برنامج القانون البيئي 3.75% (w/v) حل أسهم التي سوف تضعف بنسبة 4:1 حجمي للحل الحل: كروسلينكير برنامج القانون البيئي. ضبط تركيز اللازمة للتطبيق المطلوب.
    3. تصفية العقيمة حل مخزون برنامج القانون البيئي باستخدام عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر. تخزين برنامج القانون البيئي على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
  3. في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، نقل قوالب عقيمة باستخدام ملاقط معقمة لصفيحة 24-جيدا-زراعة أنسجة.
  4. إعداد تهبك الحل الأسهم
    1. تمييع تهبك في دببس السابقة فقط لاستخدام. ضبط تركيز تهبك الحل وفقا لتركيز برنامج القانون البيئي النهائي ونسبة crosslinking المرجوة.
      ملاحظة: للبروتوكول، سيجري تركيز برنامج القانون البيئي نهائي 3% (w/v) بمزج الحل تبدأ الأسهم مع الحل تهبك حجمي بنسبة 4:1. ضبط حسب الضرورة.
    2. إضافة 2.6 ميليلتر من محلول تهبك (80% في الماء) إلى 997.4 ميليلتر من دببس.
      ملاحظة: هذا التركيز تهبك يناظر نسبة 1:1 المقايسة مجموعات الميثيل هيدروكسي على تهبك والامينات الأولية على البروتين تبدأ عند خلط الحلول في وصف نسبة 4:1 الحجمي لنهائي 3% (w/v) ELP المائية. تهبك الحل لزج وقد عصا قطرات حل إلى الجانب من طرف ماصة. للتركيزات الدقيقة، تجنب مثل هذه القطرات عند تمييع في دببس. إزالة الحاوية تهبك الأسهم مع غاز النيتروجين لمنع أكسدة الفوسفين والمنظمة من كروسلينكير.
    3. دوامة الحل لخلط والحفاظ على الجليد.
    4. الأسهم تصفية العقيمة تهبك الحل باستخدام عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر. تمييع تهبك الأسهم الحل كذلك مع دببس العقيمة لتحقيق نسب crosslinking المقايسة أقل (على سبيل المثال-، 0.5:1 أو 0.75:1).
      ملاحظة: تهبك حساسة للأكسجين، وينبغي أن تستخدم الحل المخفف في غضون ساعات قليلة بعد إعداد.
  5. فصل الخلايا بالحضانة مع التربسين أدتا إلى تعليق خلية واحدة وبيليه الخلايا عد الخلايا إعادة علقت في المتوسطة باستخدام هيموسيتوميتير.
    ملاحظة: البروتوكولات الدقيق لهذه الخطوة سوف تعتمد على نوع من الخلايا المطلوبة والتطبيق. وأجرى للخلايا العصبية السلف المستخدمة في جميع أنحاء هذا البروتوكول، حضانة يدتا التربسين 0.025% عند درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة 1.5. كانت القريبون الخلايا في 200 غ س ل 2 دقيقة. لبقاء الخلية زيادة، ينبغي تعليق الخلايا في ظروف عادية متوسطة. كثافة الخلية النموذجية المستخدمة للخلية تغليف تتراوح بين 1-50 106 خلايا/مل من الحجم النهائي المائية. ضبط حسب الضرورة.
  6. قاسمة العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب معقم 1.5 مل أجهزة الطرد مركزي.
  7. الطرد المركزي الخلايا في ز ~ 200 x للحد الأدنى 3 بعناية ونضح المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية على الجليد.
    ملاحظة: من المهم لنضح تماما جميع المادة طافية للتخفيف من زيادة إضعاف crosslinker برنامج القانون البيئي وتهبك. وسوف تختلف سرعة الطرد المركزي الخاصة مع نوع الخلية.
  8. إعادة تعليق بيليه الخلية في حل الأسهم برنامج القانون البيئي أن وحدة التخزين هي 80 في المائة حجم النهائي (على افتراض نسبة 4:1 لبرنامج القانون البيئي الحل: تهبك الحل). "الماصة؛" ميكس 20-25 مرة لإنتاج خليط متجانس من الخلايا وبرنامج القانون البيئي.
    ملاحظة: تجنب تجتاح الجزء السفلي من أنبوب للتخفيف من ارتفاع درجة الحرارة وانتقال المرحلة اللاحقة من برنامج القانون البيئي. يتطلب كل العفن 2 مم مع ثلاثة replicates ميليلتر 7.5 من الحجم النهائي (أي.، 6 ميليلتر حل مخزون برنامج القانون البيئي وميليلتر 1.5 تهبك الحل الأسهم) التساوي في الثقوب 3 (أي.، 2.5 ميليلتر الحجم النهائي لثقب). لقوالب مم 4 و 5، وحدة تخزين نهائي ميليلتر 7.5 وميليلتر 15.5 مطلوب، على التوالي.
  9. إضافة حل تهبك الأسهم إلى تعليق خلية/برنامج القانون البيئي لوحدة التخزين النهائي 20 في المائة المتبقية. "الماصة؛" ميكس 20-25 مرة لإنتاج خليط متجانس.
  10. فورا "الماصة؛" وحدات التخزين النهائي المقابلة الخليط خلية/برنامج القانون البيئي/تهبك إلى كل العفن بحركة دائرية. كرر كافة قوالب.
  11. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، متبوعاً حضانة إضافية في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: فترة الحضانة الأولى سيساعد في تسهيل كروسلينكينج الأولية للمائية قبل زيادة درجة الحرارة إلى أن أعلاه لكست لبرنامج القانون البيئي وتحريض، العزل الحراري المرحلة.
  12. أضف ببطء 750 ميليلتر من مستنبت الخلية الحارة لكل بئر من لوحة 24-جيدا، وتجنب الإخلال بالمواد الهلامية.
  13. احتضان الهلاميات المائية في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
    ملاحظة: كامل المتوسطة تغييرات ينصح كل 1-2 أيام تبعاً لنوع الخلية. للحد من الضغط على الهلام، استخدام زجاج ماصة باستور الملصقة مع 200 ميليلتر ماصة تلميح عندما يسفط المتوسطة من البئر.

3-إيمونوسيتوتشيميستري خلايا في الهلاميات المائية 3D برنامج القانون البيئي

  1. تحضير تثبيت الحل بخلط 10 مل 16% (w/v) بارافورمالدهيد (PFA) في 30 مل دببس. الحارة الحل إلى 37 درجة مئوية.
  2. نضح المتوسطة من لوحة 24-جيدا وتغسل برفق مع 1 مل دببس.
  3. إضافة 750 ميليلتر لتثبيت الحل لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لا تستخدم حاضنة زراعة الأنسجة لتفادي تلوث ثقافات الأخرى مع بخار منهاج عمل بيجين.
  4. نضح الحل التثبيت من كل بئر، تجاهل منهاج عمل بيجين إلى حاوية نفايات الخطرة مناسبة بعناية.
    تحذير: يمكن أن يسبب التعرض لمنهاج عمل بيجين تهيج الجلد والعيون. ارتداء قفازات/سلامة النظارات والعمل في غطاء الأبخرة كيميائية.
  5. أضف 1 مل دببس لكل عينة. نضح دببس على الفور وتجاهل في حاوية النفايات في منهاج عمل بيجين.
  6. تغسل العينات مرتين مع 1 مل دببس لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في دببس عند 4 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع بعد إغلاق اللوحة مع بارافيلم.
  7. بيرميبيليزي كل عينة مع 750 ميليلتر لحل بيرميبيليزيشن (100 مل دببس و 0.25 مل من Triton X-100؛ ببست) ح 1 في درجة حرارة الغرفة على الروك 15 لفة في الدقيقة.
  8. نضح في ببست وإضافة 750 ميليلتر من عرقلة الحل (مل 95 من برنامج تلفزيوني و 5 غ من ألبومين المصل البقري (BSA)، 5 مل من المصل و 0.5 مل من Triton X-100) لكل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 3 عن الروك 15 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: ينبغي أن يتضمن الحل حظر المصل من الأنواع المضيفة التي أثيرت فيها الأجسام المضادة الثانوية (مثلاً.، الماعز، والحمير) والعقيمة تصفيتها عن طريق 0.22 ميكرومتر تصفية قبل الاستخدام.
  9. إعداد الحل تمييع جسم (97 مل دببس و 2.5 g لجيش صرب البوسنة، 2.5 مل من المصل (من الأنواع المضيفة نفسها كما في الخطوة 3، 8) و 0.5 مل من Triton X-100). تضعف جسم الأولية باستخدام الحل تمييع جسم وإضافة 500 ميليلتر من الحل لكل عينة. ختم اللوحة مع بارافيلم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على الروك.
    ملاحظة: نيستين والأجسام المضادة Sox2 الأولية كانت المخفف 1: 400 في جسم تمييع الحل من تركيز الشركات المصنعة الأصلية.
  10. نضح الحل الضد من كل عينة وغسل العينات مع ببست لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك 15 لفة في الدقيقة. كرر الخطوة يغسل 3 مرات.
  11. تمييع الأسهم الأجسام المضادة و 5 ملغ/مل الثانوية DAPI (1:2، 000) باستخدام الحل تمييع جسم وإضافة 500 ميليلتر من الحل لكل عينة. تغطية لوحة 24-جيدا مع رقائق الألومنيوم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على الروك.
    ملاحظة: كما الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء، ويجب حماية العينات من فوتوبليتشينج لجميع الخطوات اللاحقة. كانت الماعز الماوس المضادة والماعز الأرنب المضادة أضداد الثانوي المخفف 1: 500 في جسم تمييع الحل من تركيز الشركات المصنعة الأصلية.
  12. نضح الحل الضد من كل عينة وغسل العينات مع ببست مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك. كرر الخطوة يغسل 3 مرات.
  13. ضع قطره من تصاعد هاردسيت المتوسطة على سطح شريحة زجاجية. استخدام الملقط، إزالة الحل الزائدة من العفن باستخفاف النشاف على حافة القالب على منشفة ورقية. بدقة مكان العفن رأسا إلى المتوسطة المتصاعدة وتجنب إدخال فقاعات.
  14. تسمح المتوسطة المتصاعدة لتصلّب على 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. تسمح المتوسطة المتصاعدة لتعيين الكامل لح 48 قبل التصوير كما سيتم تغيير الانكسار المتوسطة على مدى تصلب. ختم العينات للشريحة غطاء الزجاج مع طلاء الأظافر واضحة للتخفيف من التلوث أو نموذج حركة.
  15. صورة العينات باستخدام مجهر [كنفوكل].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ELPs المستخدمة في هذا البروتوكول وتتكون من خمس مناطق: علامة T7، العلامة His6، انتيروكيناسي (EK) الانقسام الموقع ومنطقة الحيوية النشطة ومنطقة مثل الايلاستين (الشكل 1). علامات T7 و His6 تسمح للكشف بسهولة عن طريق التقنيات القياسية لطخة غربية. مقدمة موقع الانقسام كرونة إستونية يسمح لإزالة الانزيمية المنطقة العلامة، إذا لزم الأمر. ترميز المنطقة الحيوية النشطة الموسعة، والمستمدة من فيبرونيكتين خلية لاصقة ('رجدس') أو تسلسلات غير لاصقة ('ردجس'). وأخيراً، تكرار وسط ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعبير البروتين المؤتلف وتنقية أداة قوية لتجميع المواد الحيوية مع إمكانية تكرار نتائج عالية. يرجع ذلك إلى حد كبير إلى ظهور الاستنساخ الجزيئي تجارياً، والبلازميدات المؤتلف مخصصة يمكن شراؤها من عدة موردين، مما يقلل كثيرا من الوقت للعمل مع مواد مثل ELPs. وبالمثل، يمكن طلب والبلازميدات مباشرة من المعمل الأصلي عندما أيد اتحادية عقد العمل الأصلي والأعمال المقبلة ستكون للاستخدام غير ربحية. تسلسل الأحماض الأمينية ELP الكاملة نشرت سابقا لعدة متغيرات تبدأ31. ومع ذلك، تنطوي العملية على من التعبير لتنقية البرو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون "بالمر ت." ويستخدم أبو حاء (جراحة الأعصاب في جامعة ستانفورد) لتوفير مورين الشخصيات. ناقل الفن في الشكل 4 ومقتبسة من الفن الطبي Servier تحت "الإبداعي العزو 3.0 Unported الترخيص" (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). جزء من هذا العمل قد أنجز في ستانفورد نانو تقاسم مرافق (سنسف)، التي تدعمها "مؤسسة العلوم الوطنية" تحت جائزة ECCS-1542152. تسلم N.A.S. بدعم من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" (32 جنرال موتورز 008412). وتسلم C.M.M. الدعم من المعاهد الوطنية للصحة الفيدرالية زمالة الدكتوراه قبل (F31 EB020502) و "برنامج الباحثين سيبيل". تسلم S.C.H. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (AI116484 آسيا تحت 19 عاماً و R21 EB018407) والمؤسسة الوطنية للعلوم (1508006 هيئة الهجرة واللاجئين)، ومعهد كاليفورنيا "الطب التجديدي" (RT3-07948). هذا البحث وتلقى تمويل من التحالف من أجل التجدد التأهيل الأبحاث والتدريب (ع3تي)، الذي يدعمه "يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل" والتنمية البشرية (NICHD)، المعهد الوطني الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS)، والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية (نيبيب) من المعاهد الوطنية للصحة بموجب قرار التحكيم رقم P2CHD086843. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة آراء "المعاهد الوطنية للصحة".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > يشبه الإيلاستين التعبير عن البروتين وتنقية< / قوي>
10 سم أطباق بتروريثيرمو فيشر العلميFB0875713
70٪ إيثانولريكا كيمايكال2546.70-1
كبريتات الأمونيومسيجما-ألدريتشA3920-500G
أمبيسلينثيرمو فيشر العلميBP1760-25G
باكتو أجارثيرمو فيشر العلمي9002-18-0 
BL21 (DE3) pLysS الخلايا المختصةInvitrogenC606003
ChloramphenicolAmresco0230-100G & nbsp ؛
ديوكسيربونوكلياز I من البنكرياس البقريSigma-AldrichDN25
EDTA ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي هيدراتثيرمو فيشر ScientificO2793-500
الجلسرينالحراري فيشر ScientificBP229-4
IsopropanolThermo Fisher ScientificA451-4
Isopropyl & beta ؛ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)   ؛ثيرمو فيشر العلميBP1755-10G
لوريا مرقEMD Millipore1.10285.5007
ParafilmVWR52858-000
فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF)MP Biomedicals195381
كلوريد الصوديومالحراري فيشر العلميBP358-212
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتشS 8045-1KG
(0.22 & mu ؛ م)ميليبورSLGP033RB
مرق رائعMillipore71754-4
تريس بيسثيرمو فيشر العلميBP152-1
<قوي > تغليف الخلية في 3D ELP Hydrogels < / قوي >
0.22 & مرشحات الحقنة mMilliporeSLGV004SL
ورقة سيليكون سميكة 0.5 ممعلم المجهر الإلكتروني70338-05
ألواح زراعة الأنسجة 24 بئر   ؛كورنينج353047
لكمة يمكن التخلص منها (2 مم)Integra Miltex33-31
لكمة خزعة يمكن التخلص منها (4 مم)Integra Miltex33-34
لكمة خزعة يمكن التخلص منها (5 مم)Integra Miltex33-35
Dulbecco s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)  كورنينج21-031-سم
رقم 1 12 مم غطاء زجاجيThermo Fisher Scientific12-545-80
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chloride (THPC)Sigma-Aldrich404861-100ML
0.5٪ Tryspin / EDTAThermo Fisher   ؛15400054
<قوي>الكيمياء الخلوية المناعية للخلايا في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد ELP< / قوي>
16٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد (PFA)علوم المجهر الإلكتروني15701
ألبومين مصل الأبقار (BSA)روش3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, ثنائي هيدروكلوريد) المجساتالجزيئيةD1306 
حمير مصللامباير البيولوجية7332100
الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر (AF488)المجسات الجزيئيةA-11017
الماعز المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانوي (AF546)المجسات الجزيئيةA-11071
مصل الماعزجيبكو16210-072
الفأر نيستين الجسم المضاد الأساسيBD Pharmingen556309
Mouse Sox2 تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة الأولية23064S
علوم المجهر الإلكتروني لطلاء الأظافر72180
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium Vector LabsH-1400 
وحدة تصفية حقنة خزعة مختبرات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178(2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin like ProteinHydrogel FormationCell EncapsulationImmunofluorescent StainingProtein PurificationConfocal MicroscopySDS PAGE AnalysisWestern BlotNeural Progenitor CellsExtracellular Matrix

Related Articles