مقالة منهجية

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

DOI:

10.3791/57755

⸱

أكتوبر 20, 2018

 , 
1Fox Chase Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تظهر كيفية استخدام مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي) لتصور هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 في الخلايا الثابتة مع حساسية عالية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاعلات البروتين البروتين ينظم مبدأ توجيهيا لإحداث إشارات كثيرة، والكشف عن مثل هذه الأحداث عنصر هام في فهم كيفية تنظيم هذه المسارات وكيفية عملها. هناك العديد من الطرق للكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا، ولكن عدد قليل نسبيا يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات الذاتية. أحد هذه الأساليب، مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي)، له العديد من المزايا التوصية باستخدامها. مقارنة بالأساليب الأخرى الشائعة لتحليل التفاعل البروتين-بروتين، جيش التحرير الشعبي الصيني لديه حساسية عالية نسبيا وخصوصية، يمكن أن يؤديها بالتلاعب بالخلية الحد الأدنى، وفي البروتوكول الموضحة هنا، يتطلب اثنين فقط محددة الهدف الأجسام المضادة المستمدة من مختلف الأنواع (مثلاً.، من الماوس والارنب) وكاشف المتخصصة واحد: مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية التي هي النوكليوتيد مرتبط تساهميا محددة، عندما جلبت على مقربة من بعضها البعض، إنشاء منهاج أمبليفيابل في الموقع PCR أو المتداول دائرة التضخيم. في هذا العرض التقديمي، نعرض كيفية تطبيق تقنية جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التغييرات في قرب MST1 و MST2 في الخلايا الثابتة. الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة ينطبق خاصة لتحليل الخلايا مما يشير إلى دراسات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم ربط تعطل إشارات MST1/فرس النهر إلى اضطرابات النمو والتسرطن1. في الثدييات، وتنشيط مؤنزم MST1 و MST2 (فوسفوريلاتي) MOB1 و LATS1/2، هذه الأخيرة التي ثم فوسفوريلاتيس ويحللها المنشط المشارك النسخي البروتين المرتبط بنعم (ياب)2. في شكله النشط (أونفوسفوريلاتيد)، وقد ياب النمطان النشاط، تعزيز النسخ من خلية انتشار الجينات؛ على العكس من ذلك، عندما يتم إلغاء تنشيطه ياب بالمسار فرس النهر، ويتم منع انتشار الخلايا وشجعت المبرمج3. في الأنسجة، MST1 و MST2 موجودة أساسا ك homodimers النشطة، ولكن النمطان المحفزات يمكن أن تزيد من مستويات heterodimers MST1/MST2، وهذه هيتيروديميرس هي غير نشط4. ولكن كيف ينظم هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 ما زالت غير مفهومة. كل إنسان-وهيتيروديميرس بالوساطة عن طريق التفاعلات بين مناطق لفائف ملفوف ج-الطرفية MST1 و MST2 المعروفة باسم سارة المجالات5. استخدام في الموقع أثبت جيش التحرير الشعبي الصيني في هذه المقالة، نحن إظهار وجود heterodimers MST1/MST2 في الخلايا خلايا شوان البشرية (HSC) و "الكلي الجنينية البشرية" (HEK-293). جيش التحرير الشعبي الصيني لديه ميزة على أخرى أساليب الكشف عن التفاعل البروتين/البروتين لأنه يسمح بالكشف عن تفاعلات البروتين البروتين الذاتية، التي يمكن تحديدها وقياسها كمياً دون الحاجة للتعبير التحوير أو استخدام العلامات حانمه 6.

إرسال الإشارات تنبيغ مسارات هي تسيطر إلى حد كبير في الرابطة الشرطية من البروتينات المكون. على سبيل المثال، يؤدي تنشيط مستقبلات معظم تيروسين مؤنزم ثنائي هومو أو المتغايرة ورابطة اللاحقة مع إضافية البروتينات الإشارات داخل الخلايا، وهي نفسها شكل مجمعات أخرى. وغرض أسلوب جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التقارب بين البروتينات في الخلايا، شريطة أن البروتينات أقل من 30-40 نانومتر وبصرف النظر. عادة ما يتم الكشف عن قرب البروتين بأول حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة التي أثيرت في الأنواع المختلفة (على سبيل المثال. وارنب وفار) ضد كل من البروتين المتفاعلة، ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية إبلاغها، يسبر الحمض النووي قبل المقرونة بالقصير. إذا المسابير الحمض النووي على مقربة، في نفس الوقت ربط اليغنوكليوتيد الحمض النووي محددة تربط بين كلا من هذه التحقيقات، تشكل منبرا للتضخيم في الموقع PCR أو المتداول إليه دائرة. تسمح العلامات الفلورية إضافة إلى رد فعل التضخيم التصور البروتينات المتفاعلة، والتي تظهر كنيون النقاط التي يمكن قياسها كمياً والمترجمة إلى مناطق معينة في الخلية7،8، سهولة 9 , 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الحلول

  1. إعداد حل مثبت: بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x. 10 مل، تأخذ 2.5 مل من 16% منهاج عمل بيجين وإضافة 7.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني.
    المخاطر: منهاج عمل بيجين المسببة للسرطان في الجرعات المنخفضة. الأدخنة وتماس الجلد تعتبر خطرة. مخزن في-20 درجة مئوية.
  2. إعداد حل permeabilization: 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x. 100 مل من محلول، إضافة 100 ميليلتر من Triton X-100 إلى 100 مل من 1 x PBS. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي: 1 x تبسة. للأم 1، تأخذ 100 مل من 10 x TBS ومل 890 درهم2س 10 مل من 20 توين (10%).
  4. إعداد حل حظر كما تم توفيره بواسطة كيت. وبدلاً من ذلك، استخدم x 1 برنامج تلفزيوني الحل الذي يحتوي على 2% جيش صرب البوسنة.
  5. إعداد مخفف جسم كما تم توفيره بواسطة كيت. وبدلاً من ذلك، استخدم x 1 برنامج تلفزيوني الحل الذي يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة.

2-طلاء الخلايا

ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمنا "خلايا شوان" مخلدة البشرية (إيهسك) والخلايا البشرية 293 الكلي الجنينية (HEK 293)؛ ومع ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لأنواع عديدة من الخلايا ملتصقة.

  1. الثقافة 293 HEK في دميم وتستكمل مع 10% FBS، 0.2% جلوكوز، مم 2 لتر-الجلوتامين، 100 يو/مليلتر البنسلين G وستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل على ألواح المعالجة بزراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية في شركة 5%2. الحفاظ على إيسك في 10% FBS/دميم وتستكمل مع القلم/بكتيريا و 2 ميكرومتر فورسكولين. اختبار الخلايا مفطورة بشكل روتيني. وأجرى لا مصادقة خط الخلية.
  2. معطف شريحة دائرة 16-جيدا مع 50 ميليلتر من الماوس الطبيعية ميكروغرام/مل 10 لامينين أو 0.01 ٪ الحل بولي-L-يسين واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2. تقسيم الخلايا باستخدام 0.04% التربسين-يدتا.
  3. لوحة إيهسك و HEK-293 في 100 ميليلتر من المتوسطة في التقاء 80% (15,000-25,000 الخلايا/جيد).
  4. احتضان الخلايا ل 12-24 ساعة عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد، 5% CO2 حاضنة.

3-التثبيت وبيرميبيليزيشن

  1. إزالة المتوسطة من الآبار وتغسل مع 100 ميليلتر من 1 x PBS. نضح مع ميكروبيبيتي التقليل من مخاطر إزالة العينة.
  2. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة ميليلتر 50% 4 منهاج العمل الواحد جيدا، واحتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت، دون إثارة الشغب. الخلايا حساسة لمفرزة، لذا تجنب بيبيتينج الحلول مباشرة على الخلايا.
  3. تغسل في الخلايا التي تحتوي على 0.05% تبسة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. نضح مع ميكروبيبيتي التقليل من مخاطر إزالة العينة.
  4. علاج الخلايا مع الحل بيرميبيليزيشن (0.1% Triton x-100 في برنامج تلفزيوني x 1) لمدة 10 دقائق دون التحريض على الرايت
  5. تغسل الخلايا مع تبسة ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع الانفعالات.

4-حظر

  1. انقر فوق إيقاف تبسة (جداً برفق مع ميكروبيبيتي). تصور الشريحة في مجهر لمعرفة إذا كانت الخلايا لا تزال تعلق.
  2. أضف قطره واحدة (50-60 ميليلتر) 1 × الحل Blocking لكل عينة.
  3. قبل الحرارة دائرة رطوبة (مربع تلميح فارغة مع الماء) عند 37 درجة مئوية، واحتضان الشرائح الموجودة في العرض من أجل ح 1 في 37 درجة مئوية.

5-الابتدائي الأجسام المضادة

  1. تمييع الأجسام الأولية (1: 100) في "مادة جسم" (انظر الجدول للمواد). إعداد 40 ميكروليتر جسم حل كل بئر.
  2. إزالة الحل حظر من الشرائح بالتنصت على إيقاف السائل. لا تسمح للخلايا الجافة.
  3. دوامة وإضافة 40 ميليلتر من الحلول الأجسام المضادة لكل بئر.
  4. احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية في دائرة رطوبة مسخن.

6-القرب من ربط المقايسة المسابر

ملاحظة: يتم توفير تحقيقات جيش التحرير الشعبي الصيني كجزء من مجموعة (انظر الجدول للمواد). اختيار المسابر سيعتمد على هذه الأنواع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة للكشف عن البروتينات ذات الاهتمام.

  1. تمييع تحقيقات جيش التحرير الشعبي الصيني اثنين (ناقص المضادة الماوس والارنب المضادة بالإضافة إلى) 1:5 في "مادة الأجسام المضادة". لكل عينة، وإعداد ميليلتر 40 المسبار جيش التحرير الشعبي الصيني. احتضان هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في الرايت
  2. انقر فوق إيقاف الحل جسم أساسي من الشرائح. يغسل الشرائح مرتين لمدة كل 5 دقائق مع "المخزن المؤقت ليغسل" في الرايت
  3. بلطف الاستفادة من "المخزن المؤقت" الذي يغسل من الشرائح وإضافة مادة جيش التحرير الشعبي الصيني مسبار الحل إلى الآبار (40 ميليلتر في البئر).
  4. احتضان الشرائح في دائرة رطوبة ساخنة قبل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.

7-ربط

ملاحظة: في الموقع "كشف الكواشف الأحمر" ليجاسى وربط حل تقدم كجزء من مجموعة (انظر الجدول للمواد).

  1. استخدام في الموقع "كشف الكواشف الأحمر".
  2. استخدام فورا من قبل، ودوامه وتمييع أحجام 5 × ربط الأوراق المالية 1:5 درجة نقاء عالية في المياه المطلوبة.
    ملاحظة: لا تقم بتخزين الكواشف المخفف.
  3. انقر فوق إيقاف الحل مسبار جيش التحرير الشعبي الصيني من الشرائح. يغسل الشرائح في 1 × العازلة يغسل مرتين لمدة كل 5 دقائق في الرايت
  4. قبل مباشرة، بالإضافة إلى أن العينات ودوامه، وإضافة ليجاسى إلى ربط الحل في 01:40 تمييع ودوامه مرة أخرى.
  5. انقر فوق إيقاف تشغيل "المخزن المؤقت يغسل" من الشرائح وإضافة حل ربط/ليجاسى لكل بئر (40 ميليلتر في البئر).
  6. احتضان الشرائح الموجودة في دائرة رطوبة ساخن مسبقاً لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

8-التضخيم

ملاحظة: يتم توفير المخزون التضخيم كجزء من مجموعة (انظر الجدول للمواد). الكواشف حساسة للضوء؛ وبالتالي تجنب تعريض الشرائح للضوء.

  1. دوامة وتمييع وحدات التخزين المطلوبة من 5 × التضخيم الأسهم 1:5 في المياه عالية النقاء ومزيج.
  2. انقر فوق إيقاف الحل ربط/ليجاسى من الشرائح. يغسل الشرائح في 1 × العازلة يغسل مرتين لكل دقيقتين في الرايت
  3. دوامة وإضافة بوليميريز إلى الحل التضخيم في تخفيف 1:80 ودوامه مرة أخرى.
  4. انقر فوق إيقاف تشغيل "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي" من الشرائح وإضافة الحل التضخيم/بوليميريز لكل بئر (40 ميليلتر في البئر). احتضان الشرائح الموجودة في دائرة رطوبة قبل ساخنة لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

9-التحضير للتصوير

ملاحظة: هذه هي الكواشف الحساسة الخفيفة. الاحتفاظ بالشرائح محمية من الضوء.

  1. انقر فوق إيقاف الحل بوليميريز التضخيم من الشرائح ويغسل مرتين لمدة 10 دقائق كل 1 في x المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في الرايت
  2. إزالة الدوائر وسيليكون حول الآبار من الشريحة تماما. كشط قبالة البتات المتبقية من السيليكون مع الشفرة. رسم شبكة على الشريحة تفصل كل جيدا.
  3. إضافة ميليلتر ~ 40 المتوسط المتصاعدة مع DAPI. كن حذراً لتجنب تصيد فقاعات الهواء تحت بكشف الغطاء. يمكن أن تكون مختومة حواف بكشف الغطاء بطلاء الأظافر.
  4. الانتظار لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل القيام بتحليل الصور باستخدام مجهر [كنفوكل].
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  5. وبعد التصوير، تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية في الظلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا باستخدام مقايسة جيش التحرير الشعبي الصيني لاختبار التفاعل بين MST1 و MST2 في HEK-293 وإيهسك. الخلايا الثابتة، بيرميبيليزيد، وملطخة بالأجسام المضادة المختلفة، تليها التضخيم في الموقع وفقا للبروتوكول بجيش التحرير الشعبي الصيني (الشكل 1). لتوثيق مستوى هيتيروديميريزيشن MST1/MST2، كانت ملطخة خلايا أجسام MST1 و MST2 (الشكل 1A، ج 1، و 1 ز). كعنصر إيجابي، كنا أيضا إيرك وتغطرس من الأجسام المضادة التي من المت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجدنا أنه من المفيد استخدام الشرائح الزجاجية الدائرة لهذه التجربة، كما أنها مريحة جداً لإجراء التجربة مع العديد من خطوط الخلايا (14-16)، وليس هناك حاجة تغيير النموذج كل مرة أثناء التحليل المجهري. قد تنشأ مضاعفات قليلة، مثل خطر متزايد للتلوث عبر مع الأجسام المضادة. ولذلك، فإننا نقترح الغسيل كل بئر على حدة بدلاً من استخدام جرة كوبلين، على الرغم من زيادة مدة التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، إزالة السيليكون إدراج قضية حساسة ويجب أن يتم بعناية وصبر. حتى مع تقنية دقيقة، ومن الممكن في بعض الأحيان لمعرفة كميات صغيرة من السيليكون الحط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر المختبر تشيرنوف كامل للمساهمة في التحسين والتحقق من هذا البروتوكول، لا سيما رادو ماريا وغالينا سيمينوفا. ونشكر أيضا أندري افيموف مرفق التصوير الخلية في مركز فوكس تشيس للسرطان. وأيد هذا العمل بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (R01 CA148805) إلى جيمي كارتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شرائح الغرفةThermo Fisher Scientific17859916 جيدا ،
مسبار زجاجي مضاد للفأر ناقصSigma-Aldrichيحتوي DUO92004على محلول حجب 1x ، 1x مسبار مخفف
PLA مضاد للأرانب PLUSSigma-AldrichيحتويDUO92002 على محلول حجب 1x ، ومخازن غسيل مخففة للجسم المضاد
، FlurescenceSigma-Aldrichيحتوي DUO82049على وسيط تركيب عازل الغسيل A ومخزن الغسيل B
DUO82040DAPISigma-Aldrich
RedDUO92008يحتوي على 5x ربط ، 1x Ligase ، 5x Amlification Red ، 1x Polymerase
p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) إشارات خلية الأجسام المضادة9102s
Phospho-p44 / 42 MAPK (Erk1) (Tyr204) / (Erk2) (Tyr187)خلية إشارات5726spERK الأجسام المضادة
MST2إشارات الخلية3952s
Krs-2 (RJ-5) سانتاكروزsc-100449MST1 الجسم المضاد
16٪ بارافورمالديهايدعلوم المجهر الإلكتروني15710تمييع إلى 4٪ PFA في PBS لتثبيت
الحل Triton x100Fisher BioRecodesBP 151-500لتحضير 0.1٪ Triton x-100 في 1xPBS لمحلول النفاذية
المجهر متحد البؤرLeica TCS SP8 ، تحليل الصور 63xباستخدام برنامج ImageJ
مع كواشف الكشف عن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
  2. Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
  3. Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
  4. Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
  5. Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
  6. Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
  7. Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  8. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  9. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MST1 MST2 PLA

مقالات ذات صلة