وصف منهجية كوانتيتاتي الجينات 96 وأعرب 18 البروتينات السطحية من خلايا مفردة فيفو السابقين، مما يسمح للتعرف على خلطات الجينات والبروتينات في الخلايا المصابة بالفيروس بالنسبة للخلايا مصابة. نقوم بتطبيق نهج لدراسة CD4 المصابة بسيف+ تي الخلايا المعزولة من macaques الريسوسي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"+ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحليل خلية واحدة أداة هامة لتشريح السكان غير متجانسة من الخلايا. تحديد وعزل خلايا نادرة يمكن أن يكون صعباً. للتغلب على هذا التحدي، الجمع بين منهجية فهرسة التدفق الخلوي والفائق متعدد الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر). يهدف إلى تحديد وتوصيف فيروس نقص المناعة القردي (سيف)-إصابة خلايا موجودة داخل macaques الريسوسي. الخلايا المصابة بالفيروس من خلال كوانتيتيشن من البروتين السطحي بالأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ومرناً ب qPCR، يتم تحديدها بواسطة التعبير الجيني الفيروسي، الذي هو جنبا إلى جنب مع قياسات مضيف الجينات والبروتين لإنشاء ملف تعريف متعدد الأبعاد . نحن مصطلح نهج، وتقييم خلية واحدة بروتو النسخي المستهدفة، أو تسسيبتري. لتنفيذ هذه الطريقة، ملطخة خلايا قابلة للحياة مع الأجسام المضادة الفلورسنت محددة للعلامات السطحية المستخدمة لعزل نظام مراقبة الأصول الميدانية خلية فرعية و/أو تحليل المظهرية المتلقين للمعلومات. يتم فرز الخلايا المفردة تليها متعدد النسخ العكسي (RT) وبكر قبل التضخيم، تحلل فورا و qPCR إنتاجية عالية تصل إلى 96 من النصوص. سجلت في وقت الفرز قياسات نظام مراقبة الأصول الميدانية وبعد ذلك ترتبط بالبيانات التعبير الجيني بالموقف جيدا لخلق البروتين مجتمعة والنسخي الشخصية. دراسة المصابين بسيف الخلايا مباشرة فيفو السابقين، وحدد الخلايا الكشف qPCR متعددة الأنواع الرنا الفيروسي. الجمع بين النصوص الفيروسية وكمية كل منها توفير إطار لتصنيف الخلايا في مراحل متميزة من دورة الحياة الفيروسية (مثلالإنتاجية مقابل غير منتجة). وعلاوة على ذلك، كانت تسسيبتري سيف+ الخلايا مصابة بالمقارنة خلايا معزولة من العينة نفسها لتقييم المضيف الأثران عن الجينات والبروتينات. وكشف التحليل مقدر سابقا الجيش الملكي النيبالي الفيروسية التعبير عدم التجانس بين الخلايا المصابة، وكذلك في فيفو تنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال سيف بوساطة مع القرار خلية واحدة. طريقة تسسيبتري ذات الصلة لتحليل أي السكان خلية قابلة لتحديد الهوية بواسطة التعبير marker(s) البروتين السطحية، gene(s) المضيف أو الممرض، أو مزيج منها.
المقدمة
العديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا تعتمد على إليه الخلية المضيفة للنسخ المتماثل، غالباً ما تغيير بيولوجيا الخلية المضيف أو استهداف الفئات السكانية الفرعية محددة جداً للخلايا المضيفة تحقيق أقصى قدر من الفرص لنشر. نتيجة لذلك خلية العمليات البيولوجية تعطلت عادة، مع عواقب ضارة على الصحة العامة للبلد المضيف. فهم التفاعلات بين الفيروسات والخلايا المضيفة التي النسخ المتماثل سيتم توضيح آليات المرض يمكن أن يساعد في تطوير علاجات محسنة واستراتيجيات للوقاية من العدوى. الأدوات التحليلية المباشرة التي تمكن من دراسة التفاعلات بين المضيف الممرض ضرورية نحو تحقيق هذه الغاية. تحليل خلية واحدة يوفر الوسيلة الوحيدة للسمة لا لبس فيه النمط الظاهري خلوية الوراثي خاصة، أو الإصابة بالحالة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تخطيطي لسير العمل البروتوكول ويرد في الشكل 1. وهو يتألف من ثلاث خطوات رئيسية: نظام مراقبة الأصول الميدانية، الرايت وكدنا قبل التضخيم، و qPCR ليصل إلى 96 من الجينات في وقت واحد. يتم وصف إصدارين من البروتوكول، وفرز الخلايا في الحد من تخفيف وفرز الخلايا المفردة، بمزيد من التفصيل في الخطوة 5 والخطوه 6، على التوالي. هذه الاستراتيجيات ومعالجة مسائل بحثية مختلفة لكن اتباع إجراءات مماثلة.
1-المتطلبات المسبقة أو قبل تحليلات
- التحقق من صحة جميع فحوصات التعبير الجيني لاستخدامها كما هو موضح سابقا6.
ملاحظة: تتم هذه الخطوة قبل موعد التجربة. التحقق من صحة جميع فحوصات، التجارية والعر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
سير العمل للبروتوكول بأكمله هو مبين في الشكل 1. وهو يتألف من الاختلافات بين تعريف عدد من الخلايا التي تم فرزها: أما تمييع الحد أو كواحدة من الخلايا، كما هو موضح في النص. وترد أمثلة للتحقيق التمهيدي المؤهل التحليلات على إضعاف تخفيف الحمض النووي الريبي المسلسل في الشكل 2. ويرد في الشكل 3الاستراتيجية النابضة لتحديد خلايا سيف+ محتملة. وترد قبكر الفاشلة بنجاح ودون المستوى الأمثل في مجال مراقبة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البروتوكول هو موضح هنا، يسمى تسسيبتري، يدمج كوانتيتيشن البروتين وحيد الخلية السطحية بتدفق مولتيباراميتير الخلوي مع خلية واحدة مرناً التعبير الكمي ب qPCR RT كبير متعدد. تمكن الاتحاد من هذه التقنيات اثنين لقطات عالية المحتوى لمجموع النسخي والشخصية البروتين من الخلايا المفردة في شكل الفائق. نحن استخدام الأسلوب تحديد بعيد المنال حتى الآن الخلايا المصابة مع سيف في فيفو، ووصف المضيف الأثران عن الجينات والبروتينات. البروتوكول يمكن تكييفها لدراسة أي سكان الخلية من الفائدة يمكن تمييزها بالتعبير عن protein(s) السطحية، ومر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأيد هذا العمل (W81XWH-07-2-0067) اتفاق تعاون بين مؤسسة هنري م. جاكسون للنهوض بالطب العسكري, Inc.، وإدارة الولايات المتحدة للدفاع (DOD). الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي أن تفسر بتمثيل مواقف الجيش الأميركي أو وزارة الدفاع. بحوث أجريت في إطار بروتوكول المعتمد استخدام حيوانات في منشأة آآلاسي المعتمدة عملا "قانون رعاية الحيوان" وغيرها من القوانين الاتحادية واللوائح المتعلقة بالحيوانات وتجارب الحيوانات التي تنطوي وتتمسك بالمبادئ وذكر في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، نشر المجلس النرويجي للاجئين، طبعة 2011.
شكر وتقدير
المؤلف يود أن يشكر نييد فكتوريا التدفق الخلوي الأساسية والمرافق مهرب التدفق الخلوي الأساسية لصيانة وتشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية أدوات ومعدات الفرز؛ ماريا مونتيرو، هرشيني شارما، أغنية كيمي لخبراء المساعدة التقنية؛ مايكل بيتك، الابن (متوفى) للحصول على المساعدة مع سيف qPCR المقايسة التصميم؛ وكيلي براندون، وماثيو سكارلوتا لسيف عزل تسلسل. الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين ولا ينبغي أن تفسر بتمثيل مواقف الجيش الأميركي أو وزارة الدفاع. بحوث أجريت في إطار بروتوكول المعتمد استخدام حيوانات في منشأة آآلاك المعتمدة عملا "قانون رعاية الحيوان" وغيرها من القوانين الاتحادية واللوائح المتعلقة بالحيوانات وتجارب الحيوانات التي تنطوي وتتمسك بالمبادئ وذكر في دليل لرعاية واستخد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| < ص >< قوي > RNA الكواشف والمواد الاستهلاكية < / قوي >< / ص > | |||
| < ص > Genemate 96 جيدا شبه التنورة لوحة PCR < / ص > | < ص > BioExpress / VWR < / p > | < p>T-3060-1 < / p > | |
| < p> لاصق لوحة PCR الأختام < / p > | < p > ThermoFisher < / p > | < p>AB0558 < / p> | |
| < ص > Armadillo 384 بئر PCR Plate < / p > | < p > ThermoFisher < / p > | < p >AB2384 < / p > | |
| < p >MicroAmp فيلم لاصق بصري < / ص >< | ص > الأنظمة الحيوية التطبيقية / ThermoFisher < / p > | < p >4311971< / p >< | |
| p >DEPC Water < / p > | < p > الجودة البيولوجية < / ص > | < ص > 351-068-101 < / ص > | |
| الماء المقطر الزجاجي< / p> | Teknova< / p> | W3345< / p> | |
| Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit< / p> | Invitrogen / ThermoFisher< / p> | 11732088< / p> | |
| SUPERase-In Rnase Inhibitor< / p> | Invitrogen / ThermoFisher< / p> | AM2696< / p> | |
| < ص > البلاتين Taq < / p > | < p > Invitrogen / ThermoFisher < / p > | < p >10966034< / p > | |
| < p>dNTP Mix< / p> | < p>Invitrogen / ThermoFisher < / p> | < p >18427088< / p > | |
| < p>ROX Reference Dye (إذا كانت منفصلة عن المجموعة) < / ص | > < ص > Invitrogen / ThermoFisher < / ص > | < ص >12223012< / ص> | |
| DNA Suspension Buffer< / p> | Teknova< / p> | T0223< / p> | |
| RNAqueous kit< / p> | Invitrogen / ThermoFisher< / p> | AM1931< / p> | |
| TaqMan مقايسات التعبير الجيني غير مدرجة في الجدول 2< / strong>< / p> | |||
| CD6 < / p > | < p> Applied Biosystems / ThermoFisher < / p > | < p >Hs00198752_m1< / p > | |
| < p>TLR3 < / p > | < p> Applied Biosystems / ThermoFisher < / p >< | p >Hs1551078_m1< / p > | |
| < p >< strong > Biomark recodes < / strong >< / p > | |||
| < p > Control Line Fluid Kit < / p > | < p>Fluidigm< / p> | 89000021< / p> | |
| TaqMan Universal PCR Mix< / p> | Applied Biosystems / ThermoFisher< / p> | 4304437< / p> | |
| كاشف تحميل الفحص< / p> | Fluidigm< / p> | 85000736< p> | |
| كاشف تحميل العينة< / p> | Fluidigm< / ص > | < ص >85000735< / ص > | |
| < ص > مصفوفة ديناميكية 96.96 (رقاقة) < / ص > | < ص > Fluidigm < / ص >< | ص > BMK-M - 96.96 < / ص > | |
| < ص >< قوي > FACS كواشف < / قوي >< / ص > | |||
| < ص > SPHERO COMPtrol الماعز المضادة للفأر (لامدا) < / ص >< | ص > Spherotech Inc. < / ص > | < ص>CMIgP-30-5H< / ص > | |
| < ص > كومبيدز المضادة للفأر IG ، ك < / ص > | < ص >BD Biosciences < / ص | > < ص > 51-90-9001229 < / ص > | |
| < ص >5 مل أنبوب البوليسترين مع غطاء مصفاة < / ص > | < ص > فالكون < / ص > | < ص >352235< / ص > | |
| < ص > أكوا لايف / وصمة عار ميتة < / ص > | < ص > Invitrogen / ThermoFisher < / ص > | < ص>L34976 < / p> | < p> تخفيف 1: 800 < / p> |
| فأر مضاد للإنسان CD3 BV650 استنساخ SP34-2< / p> | BD Biosciences< / p> | 563916< / p> | تخفيف 1: 40< / p> |
| الفأر المضاد للإنسان CD4 BV786 استنساخ L200< / p> | BD Biosciences< / p> | 563914< / p> | < ص > تخفيف 1: 20 < / ص > |
| < ص > استنساخ الفأر المضاد للإنسان CD8 BUV496 RPA-T8 < / p > | BD Biosciences< / p> | 564804< / p> | تخفيف 1:10< / p> |
| الفأر المضاد للإنسان CD28 BV711 استنساخ CD28.2< / p> | Biolegend< / p> | 302948< / p> | تخفيف 1:20 |
| < ص> الفأر المضاد للبشر CD95 BUV737 استنساخ DX2 < / p> | BD Biosciences< / p> | 564710< / p> | تخفيف 1: 10< / p> |
| Mouse Anti-Human CD14 BV510 استنساخ M5E2< / p> | Biolegend< / p> | 301842< p> | تخفيف 1: 83< / p> |
| Mouse استنساخ CD16 BV510 المضاد للإنسان 3G8 < / p > | Biolegend < / p > | < p>302048< / p> | تخفيف 1: 167 < / p> |
| Mouse Anti-Human CD20 BV510 استنساخ 2H7 < / p > | Biolegend < / p> | 302340 < / p> | < p> تخفيف 1: 37 < / p> |
| Anti-CD38-R PE استنساخ OKT10< / p> | < ص>NHP كاشف < / ص > | < ص > N / A < / p > | < p> تخفيف 1: 100 < / ص > |
| < p> فأر مضاد للإنسان CD69 BUV395 استنساخ FN50 < / p > | < p >BD Biosciences < / p > | < p >564364< / p > | < p > تخفيف 1: 10 < / p |
| > فأر مضاد للإنسان HLA-DR APC-H7 استنساخ G46-6 < / ص > | < ص > دينار بحريني العلوم البيولوجية< / ص> | 561358< / p> | تخفيف 1:20< / p> |
| فأر مضاد للإنسان ICOS Alexa Fluor 700 استنساخ C398.4A< / p> | Biolegend< / p> | 313528< / p> | تخفيف 1: 80< / p> |
| Instruments< / strong>< / p> | |||
| BioPrptect Containment Enclosure | <ص>بيكر< ع> | ||
| <ص> ب فاكس أريا< ص> | <ص>BD Biosciences< ص> | ||
| <ص>ProtoFlex نظام PCR مزدوج 96 بئر< / ص> | <ص> الأنظمة الحيوية التطبيقية / ThermoFisher< / p> | 4484076< / p> | |
| Quant Studio 6 qPCR instrument< / p> | Applied Biosystems/ThermoFisher< p> | < ص >4485694< / ص > | |
| < ص > وحدة تحكم IFC HX < / p > | < p > Fluidigm < / p >< | p >IFC-HX < / p >< | |
| p>Biomark HD< / p > | Fluidigm< / p> | BMKHD-BMKHD< / p> |
المراجع
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
