يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

17.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57782

⸱

يونيو 20, 2018

 ,  , 
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

في هذه المقالة

ملخص

وهنا، نحن نناقش سلسلة من البروتوكولات لتحريض والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا المستزرعة. نركز على مختلف المحفزات الذي يحفز الشيخوخة ووصف التحديد الكمي للعلامات الشائعة المرتبطة بالشيخوخة. نحن نقدم التفاصيل التقنية باستخدام الخلايا الليفية كنموذج، ولكن البروتوكولات يمكن أن تتكيف مع مختلف النماذج الخلوية.

الملخص

الشيخوخة الخلوية حالة توقيف دورة الخلية الدائمة المنشط في الاستجابة للمحفزات الضارة المختلفة. التنشيط للشيخوخة الخلوية السمة مميزة لمختلف الظروف الفيزيولوجية المرضية بما في ذلك قمع الورم، الأنسجة يعيد البناء والشيخوخة. مستحثات للشيخوخة الخلوية في فيفو تتميز لا يزال ضعيفا. ومع ذلك، يمكن استخدام عدد من المحفزات لتعزيز الشيخوخة الخلوية السابقين فيفو. فيما بينها، هي مستحثات الشيخوخة الأكثر شيوعاً استنفاد replicative الإشعاعات المؤينة وغير المؤينة، وسمية جينية، والأكسدة، وديميثيلاتينج والمخدرات أسيتيلاتينج وكلاء. هنا، سوف نقدم إرشادات مفصلة حول كيفية استخدام هذه المحفزات لحمل الليفية في الشيخوخة. هذا البروتوكول يمكن بسهولة تكييف لأنواع مختلفة من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا، بما في ذلك الخلايا السرطانية. ونحن أيضا وصف أساليب مختلفة للتحقق من صحة الاستقراء الشيخوخة. على وجه الخصوص، نحن نركز على قياس نشاط الإنزيم الليزوزومية المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال)، معدل تركيب الدنا باستخدام 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو) إدماج التحليل، مستويات التعبير عن دورة الخلية مثبطات p16 و p21، والتعبير وإفراز أفراد من النمط الظاهري الافرازية سينيسسينسياسوسياتيد (ساسب). وأخيراً، نحن نقدم نتائج المثال ومناقشة المزيد من التطبيقات لهذه البروتوكولات.

المقدمة

وأفادت هايفليك ومورهيد في عام 1961، أن الخلايا الليفية الأولية في الثقافة تفقد إمكانياتها التكاثري بعد مقاطع متتالية1. هذه العملية بسبب تقصير التيلومير متسلسلة بعد كل انقسام الخلية. عندما يصل التيلومير إلى مدة قصيرة جداً، يتم التعرف على أنها استجابة تلف الحمض النووي (DDR) التي ينشط فيها القبض لا رجعة فيه من انتشار – كما يعرف الشيخوخة ريبليكاتيفي. الشيخوخة replicative حاليا واحدة من العديد من المحفزات التي هي معروفة لحمل دولة القبض عليه دورة الخلية الدائمة أن يجعل خلايا حساسة إلى ميتوجينس وإلى إشارات apoptotic2،3. برنامج الشيخوخة ويتسم عادة بميزات إضافية بما في ذلك النشاط الليزوزومية عالية وخلل mitochondrial والتغيرات النووية، الكروماتين ترتيبات جديدة، الإجهاد هيولى، أضرار الحمض النووي والمرتبطة الشيخوخة النمط الظاهري الافرازية (ساسب)3،4. مسن الخلايا لها وظائف متعددة في الجسم: التنمية، والجرح الشفاء والورم قمع2. وبالمثل، كانت معروفة لتلعب دوراً هاما في الشيخوخة، ومن المفارقات أنه في تطور الورم5. آثار الشيخوخة سلبية، ومتناقضة جزئيا، وكثيراً ما يعزى إلى ساسب6.

في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن القضاء على الخلايا مسن من الفئران يؤدي إلى تمديد عمر وإلى القضاء على العديد من الشيخوخة ميزات7،،من89،10،11، 12. بنفس الطريقة، تم تطوير أدوية متعددة أما القضاء على الخلايا مسن (سينوليتيكس) أو لاستهداف ال13،ساسب14. إمكانات العلاج المضادة للشيخوخة اجتذبت مؤخرا المزيد من الاهتمام إلى الميدان.

دراسة الآليات المرتبطة بالشيخوخة الخلوية والعروض للتدخلات الدوائية تعتمد بشدة على السابقين فيفو النماذج، لا سيما في الخلايا الليفية الأولية البشرية. بينما هناك بعض السمات المشتركة تنشيطه بواسطة مستحثات الشيخوخة المتنوعة، التقلبات كبيرة في النمط الظاهري الشيخوخة الملاحظة وتعتمد على عوامل مختلفة بما في ذلك الخلية نوع والتحفيز والوقت النقطة3،15، ،من 1617. لا بد من النظر إلى التباين لدراسة واستهداف الخلايا مسن. ولذلك، هذا البروتوكول يهدف إلى توفير مجموعة من الأساليب المستخدمة للحث على الشيخوخة في الخلايا الليفية الأولية باستخدام العلاجات المختلفة. كما سيتم شرح ذلك، يمكن بسهولة أن الأساليب تكييف أنواع الخلايا الأخرى.

وبصرف النظر عن الشيخوخة replicative، يصف لنا خمسة علاجات أخرى يحفز الشيخوخة: الإشعاعات المؤينة الإشعاع والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الإشعاع، ميتوتريكسات، والأكسدة وتغييرات جينية (إلا وهي تعزيز acetylation هيستون أو DNA demethylation) . على حد سواء، من الإشعاع المؤين والإشعاع فوق البنفسجي يسبب ضرر مباشر على الحمض النووي، وفي الجرعة المناسبة، تؤدي إلى الشيخوخة18،19. ميتوتريكسات أيضا لأسباب الشيخوخة أساسا عن طريق الحمض النووي الأضرار التي إينتيركالاتينج في الحمض النووي، وتعطيل وظيفة الثاني توبويسوميراسي، وهكذا وقف الحمض النووي إصلاح آليات20. عادة تسيطر الجينات الأساسية للشيخوخة هيستون acetylation ومثلايشن الحمض النووي. نتيجة لذلك، مثبطات deacetylase هيستون (مثلاً، بوتيرات الصوديوم وساها) والحمض النووي ديميثيلاتينج (مثلاً، 5-عزة) عوامل تؤدي إلى الشيخوخة في الخلايا الطبيعية وإلا21،22.

وأخيراً، سيتم شرح أربعة من العلامات الأكثر شيوعاً المرتبطة بالخلايا مسن: النشاط الشيخوخة المرتبطة-β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال)، المعدل لتركيب الدنا من إيدو إدماج المقايسة، overexpression المنظمين دورة الخلية و كيناز cyclin تعتمد على مثبطات p16 و p21، وأوفيريكسبريشن وإفراز أعضاء ساسب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد معلومات عامة

  1. إعداد متوسطة D10. تكملة دميم المتوسطة-جلوتاماكس مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين (التركيز النهائي: 100 يو/مليلتر).
  2. إعداد برنامج تلفزيوني العقيمة. حل على أقراص في المياه وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعقيم اﻷوتوكﻻف.
  3. إعداد 1 x التربسين. تمييع 5 مل من التربسين-فيرسيني يدتا/10 × 01:10 في 45 مل PBS العقيمة.
    ملاحظة: في جميع أنحاء البروتوكول، نستخدم شروط ثقافة الخلية التي أقرب إلى فسيولوجية شروط الليفية الأولية. وهذا يعني أننا احتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 كما عادة القيام به لكن باستخدام 5% O2 بدلاً من 20 ٪ س "ستاندارد"2-
  4. التعامل مع جميع العينات في ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س2 (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.

2-تنظيم دورات تعريفية للشيخوخة

  1. الشيخوخة ريبليكاتيفي
    1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ) العمل تحت ظروف معقمة، باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س2 (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
    2. البذور 7 × 105 الليفية الأولية قابلة للتطبيق في عدد سكان منخفضة في T75 قارورة (~9.3 x 103 خلايا/سم2) التي تحتوي على 10 مل D10 مضاعفة (PD).
    3. تنمو الخلايا في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2 حتى تصل إلى 70 – 80% التقاء (3 – 4 أيام للثقافات المنتشرة في PD منخفضة).
    4. فصل الخلايا باستخدام 3 مل 1 × التربسين وتفرخ ~ 5 – 7 دقيقة في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2. رصد الخلايا بانتظام مع مجهر ثقافة خلية للتحقق من عملية ديتاتشينج.
    5. عندما تكون الخلايا كروية، التوقف عن رد فعل التربسين بإضافة 9 مل D10. عدم احتضان أطول من 10 دقائق.
    6. تدور الخلايا في 300 x ز لخلايا دقيقة 5 ستشكل بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب، بينما تبقى الحطام والجزيئات الصغيرة في المادة طافية.
    7. إزالة المادة طافية وحل بيليه الخلية في 1 مل D10 وأداء عدد خلايا استخدام عداد الآلي خلية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة أو دائرة نيوباور للعد اليدوي. حين العد، وتشمل فحص للتحقق من صلاحية الخلايا (مثلاً، تريبان الأزرق استبعاد23).
    8. حساب PD التراكمي باستخدام هذه الصيغة:
      شعبة البرامجالجديدة = 3.32* (LOG(cell number total)-(سجل (عدد الخلايا المصنف)) + بدولد
      خلية العدد الإجمالي = كافة الخلايا التي تم عدها: ميتة وعلى قيد الحياة.
      خلية رقم المصنف = عدد خلايا قابلة للحياة المصنف (8 × 105 خلايا).
      PDالقديم = السكان مضاعفة في هذه اللحظة من البذر.
      شعبة البرامجالجديدة = السكان مضاعفة في هذه اللحظة من العد (بعد الحضانة).
      ملاحظة: إذا كان المصنف 7 × 105 الليفية الأولية (PD 35.2) في قارورة T-75، وبعد 4 أيام التوصل إلى التقاء 80%، ويتم تقسيم مرة أخرى، عد الآن 1.3 × 106 مجموع الخلايا (الميت + على قيد الحياة).
      شعبة البرامجالجديدة = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35.2
      شعبة البرامجالجديدة = 36.1
    9. ريسيد 8 × 105 خلايا في T75 جديدة، تكرار الخطوات 2.1.2–2.1.8.
      ملاحظة: بعد عدة فقرات متتالية، الثقافة سيستغرق وقتاً أطول للحصول على المتلاقية حتى خلايا وقف تقسيم على الإطلاق. وقف تقسيم الخلايا مرة واحدة، اختبار لعلامات الشيخوخة و/أو الحصاد للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
    10. نعتبر أن حجم أكبر من الخلايا مسن قد تتسبب في الثقافة تظهر كاملة ولكن عدد خلايا منخفضة. وهكذا، يمكن افتراض الشيخوخة عند PD مستقرة وأخرى علامات الشيخوخة تظهر في الثقافة (انظر بروتوكولات 3.1-3.5).
      ملاحظة: استخدم تكاثر الخلايا الليفية الأولية كعنصر التحكم.
  2. الشيخوخة التي يسببها الإشعاع المؤين
    1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ)، العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س2 (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
    2. البذور 7 × 105 قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 103 خلايا/سم2) التي تحتوي على 10 مل D10.
    3. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    4. تعرض الخلايا إلى رمادي 10 من إشعاع غاما وفقا لتعليمات الجهاز قيد الاستخدام.
    5. نضح المتوسطة من الخلايا، واستبدال مع 10 مل D10.
    6. احتضان الخلايا في 10 مل D10 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2 لمدة 10 أيام استبدال المتوسطة بانتظام، وتقريبا كل 3 أيام.
    7. وبعد عشرة أيام، اختبار لعلامات الشيخوخة و/أو استخدام الخلايا للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
      ملاحظة: استخدم تكاثر الخلايا الليفية الأولية من PD نفسه (قبل التشعيع) كعنصر التحكم.
  3. الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الإشعاع الشيخوخة
    1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ)، العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س2 (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
    2. بذور 1.5 – 2 × 105 الليفية الأولية قابلة للتطبيق في PD منخفضة في بئر واحدة للوحة 6-جيدا (1.5 – 2.0 × 104 خلايا/سم2)، أضف 2 مل متوسطة D10.
    3. وضع الخلايا في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2 والسماح لهم بالتمسك بالبلاستيك على الأقل 5 ح.
    4. تقلع في المتوسط من الخلايا. ضع لوحة 6-جيدا في منتصف الدائرة الإشعاع فوق البنفسجي وخلع غطاء بلاستيكي. تشعيع مع الأشعة فوق البنفسجية، 20-30 مللي جول/سم2.
    5. إضافة 2 مل متوسطة كل بئر.
    6. احتضان الخلايا في 2 مل D10 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2 لآخر 7 أيام استبدال المتوسطة بانتظام، وتقريبا كل 3 أيام.
      ملاحظة: بعد 7 أيام، خلايا يمكن اختبارها لعلامات الشيخوخة ويستخدم للتطبيقات المتلقين للمعلومات. تستخدم الخلايا الليفية الأولية المتكاثرة من PD نفسه (قبل التشعيع) كعنصر التحكم.
  4. الشيخوخة التي يسببها ميتوتريكسات
    1. إعداد 1,000 x ميتوتريكسات الأسهم الحل: جعل مخزون 250 ميكرون من ميتوتريكسات في برنامج تلفزيوني 1 x، تصفية تعقيم الحل وقاسمه في 500 ميليلتر في أنبوب عقيم. تخزين المخزون ميتوتريكسات في-80 درجة مئوية.
    2. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ)، العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س2 (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
    3. البذور 7 × 105 قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 103 خلايا/سم2) التي تحتوي على 10 مل D10.
    4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    5. ميليلتر 11 1000 × الحل ميتوتريكسات الأسهم في 11 مل D10 إلى تركيز نهائي لتمييع 250 نيوتن متر.
    6. نضح المتوسطة من الخلايا، واستبدال مع 10 مل D10 + ميتوتريكسات.
    7. احتضان الخلايا الخاصة بالضبط 24 ح في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    8. نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل بعناية مرة واحدة مع 10 مل D10.
    9. احتضان الخلايا في 10 مل D10 لمدة 6 أيام استبدال المتوسطة بانتظام، وتقريبا كل 3 أيام.
    10. في يوم 7، اختبار لعلامات الشيخوخة و/أو استخدام لتطبيقات المتلقين للمعلومات.
      ملاحظة: كمراقبة، استخدام تكاثر الخلايا الليفية الأولية من PD نفس العلاج 24 ساعة بالسيارة (PBS) 1:1,000 في D10.
  5. الشيخوخة الناجمة عن الإجهاد التأكسدي
    1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ) العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س2 (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
    2. البذور 7 × 105 قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 103 خلايا/سم2) التي تحتوي على 10 مل D10.
    3. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    4. تعد حلاً بيروكسيد الهيدروجين ~ 200 ميكرومتر في المتوسط D10 بإضافة 22.6 ميكروليتر من بيروكسيد الهيدروجين 30% في 11 مل D10.
      ملاحظة: تحسين العلاج لنوع الخلية من اهتمام بجعل منحنى جرعة واﻻستجابة لتقييم السمية.
    5. نضح المتوسطة من الخلايا، وإضافة 10 مل من الطازجة D10 متوسطة + فوق أكسيد الهيدروجين. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و 5% س2.
    6. نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل مرة واحدة مع D10 الطازجة دون بيروكسيد الهيدروجين.
    7. أضف 10 مل من D10 دون بيروكسيد الهيدروجين.
    8. احتضانها ح 48 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    9. كرر الخطوات 2.5.4–2.5.8 مرتين أكثر لما مجموعة ثلاثة علاجات.
    10. التحقق من وجود علامات الشيخوخة أو الحصاد للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
      ملاحظة: مراقبة، استخدام الخلايا المتكاثرة من PD نفس تعامل مع 22.6 ميليلتر من الماء المعقم في D10 ح 2.
  6. الشيخوخة التي يسببها ابيجينيتيكالي
    1. إعداد المخزون وعمل الحلول molecule(s) الصغيرة استخدامها وفقا الجدول 1. عامل التصفية-تعقيم الحلول. قاسمة في أنابيب معقمة. مخزن في-20 درجة مئوية.
    2. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ) العمل تحت ظروف معقمة، على سبيل المثال، باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س2 (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
    3. البذور 7 × 105 قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 103 خلايا/سم2) التي تحتوي على 10 مل D10.
    4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    5. إعداد 11 مل من المتوسطة D10 + حل عملي للعلاج المطلوب. تمييع الدقيقة الواحدة المعاملة يتبين في الجدول 1.
      1. إعداد ميليلتر 11 مم 1 ساها العامل الحل في 11 مل D10.
      2. إعداد ميليلتر 44 م 1 الصوديوم butyrate العامل الحل في 11 مل D10.
      3. إعداد ميليلتر 11 مم 10 5-عزة عمل حل في 11 مل D10.
        ملاحظة: تحسين العلاجات للخلية نوع من الاهتمام بها، وعلى سبيل المثال، مما يجعل منحنى جرعة واﻻستجابة لتقييم السمية.
    6. إضافة D10 المتوسطة + حل عملي للعلاج المطلوب للثقافة.
    7. احتضانها ح 24 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    8. كرر الخطوات 2.6.4–2.6.6 مرتين أكثر من ذلك، لما مجموعة ثلاثة علاجات.
    9. تغيير المتوسطة ل D10 بسيطة دون المخدرات.
    10. وبعد 3 أيام أكثر، تصبح الخلايا مسن وجاهز للاختبار من علامات الشيخوخة وتطبيقات المتلقين للمعلومات.
      ملاحظة: كمراقبة، استخدام تكاثر الخلايا الليفية الأولية من PD نفس معاملة لمدة ثلاثة أيام مع D10 متوسطة + مركبة. D10 متوسطة + السيارة تحتاج إلى تحديث كل 24 ساعة خلال تلك الأيام الثلاثة. السيارة يعتمد على العلاج المستخدمة: 1:1,000 [دمس] للماء المعقم ساها وعزة 5 و 1: 250 "الصوديوم بوتيرات".

3-علامات الشيخوخة

  1. إعداد
    1. إعداد 20 ملغ/مل غال X: حل 20 ملغ من X-غال في 1 مل من ديميثيلفورماميدي أو [دمس]. تخزين في-20 درجة مئوية محمية من الضوء.
    2. إعداد 0.1 M حمض الستريك الحل: حل غ 2.1 من مونوهيدرات حامض الستريك في 100 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد الحل فوسفات الصوديوم 0.2 M: 3.56 غرام من فوسفات الصوديوم مائي أو ز حل 2.84 من فوسفات الصوديوم مائي يذوي في 100 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    4. إعداد 0.2 M حمض الستريك/صوديوم فوسفات pH 6.0: حل مل 36.85 حل حمض الستريك 0.1 م ومل 63.15 من فوسفات الصوديوم 0.2 متر. ضبط بالضبط على درجة الحموضة 6.0. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    5. إعداد فيروسيانيد البوتاسيوم 100 مم: حل غ 2.1 من فيروسيانيد البوتاسيوم في 50 مل الماء. تخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    6. تحضير سيانيد البوتاسيوم 100 مم: حل ز 1.7 من سيانيد البوتاسيوم في 50 مل الماء. تخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    7. تحضير كلوريد الصوديوم 5 م: حل ز 14.6 من كلوريد الصوديوم في 50 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    8. يعد كلوريد المغنيسيوم م 1: حل ز 4.8 من كلوريد المغنيسيوم في 50 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    9. إعداد 2% فورمالدهايد + 0.2 ٪ glutaraldehyde في برنامج تلفزيوني: حل 800 ميليلتر من جلوتارالديهيدي 25% و 12.5 ميليلتر من فورمالدهايد 16% في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني. تخزين في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
    10. إعداد الحل المصبوغة جديدة استناداً إلى الجدول 2-
  2. تلوين المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي
    1. لكل عينة، البذور 1 × 104 خلايا في بئر واحدة على الأقل من جيدا 24 لوحة (5.2 × 103 خلايا/سم2) تحتوي على 500 ميليلتر من D10 حيث تكون الخلايا المتفرقة. يمكن إجراء العلاج (أن وجد) مباشرة على هذه اللوحة، أو بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الخلايا تعامل فعلا إعادة المصنف في لوحة 24-جيدا.
    2. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    3. تغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
    4. إصلاح 3 – 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام من 2% فورمالدهايد + 0.2 ٪ glutaraldehyde 500 ميكروليتر/جيدا في برنامج تلفزيوني.
    5. تغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
    6. إعداد الطازجة تلطيخ الحل، وفقا لعدد العينات وصمة عار.
    7. إضافة حل المصبوغة (500 ميليلتر في البئر) وختم اللوحة مع بارافيلم لتجنب التبخر.
      ملاحظة: قد تسبب البلورات بشكل التبخر وتعوق الملاحظة تحت المجهر.
    8. احتضان خلايا في الظلام (مثلاً المشمولة في رقائق الألومنيوم) عند 37 درجة مئوية في حاضنة جافة (دون CO2) ح 12 – 16.
      ملاحظة: قد يؤثر على درجة الحموضة CO2 وذلك تعديل النتائج. قد تتطلب بعض أنواع الخلايا حضانة أقصر.
    9. تغسل مرتين مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
    10. تقييم النتائج. تعرض الخلايا إيجابية أزرق (في الغالب) بيرينوكلير تلطيخ تحت مجهر ضوء عادي (الشكل 1A).
    11. للتحديد الكمي، نلاحظ خلايا على الأقل 100 كل عينة وحساب عدد الخلايا إيجابية. منذ خلايا مسن تغيير الشكل، غالباً ما يصعب تحديد حدود الخلية وحساب الخلايا. كونتيرستاين مع DAPI تيسيرا للتصور والتقدير الكمي للخلايا المفردة (الشكل 1B). التحديد الكمي لهذه العينات (النسبة المئوية للخلايا إيجابية مقابل مبلغ إجمالي قدرة الخلايا) باستخدام مجهر فلوري (الشكل 1). أن صور متعددة من نفس العينة حتى نهاية يمكنك عد الخلايا واحد على الأقل 100 وتقييم النسبة المئوية للخلايا سا-β-غال الإيجابية في نفوسهم.
    12. مقارنة نتائج الخلايا مسن مقابل سيطرتها المناسبة للمعالجة المستخدمة.
      ملاحظة: تلطيخ يشترك مع إيدو على نفس العينة من الممكن. نعتبر أن الخلايا ثم يجب أن يكون المصنف في كوفيرسليبس.
  3. إيدو إدماج التحليل
    1. وضع بئر ساترة في لوحة 24-جيدا وفقا لعدد العينات لتقييم.
    2. البذور 1 × 104 خلايا في بئر واحدة على الأقل من صفيحة 24-جيدا (5.2 × 103 خلايا/سم2) كل شرط يتضمن 500 ميليلتر من D10 حيث تكون الخلايا المتفرقة. يمكن إجراء العلاج (أن وجد) مباشرة على هذه اللوحة، أو بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الخلايا المعالجة مسبقاً إعادة المصنف في لوحة 24-جيدا.
    3. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2 و % 5 س2.
    4. جعل حلاً 20 ميكرون من إيدو في D10 (1: 250) وفقا لعدد العينات لعلاج (250 ميكروليتر كل عينة).
    5. إزالة نصف المتوسط (250 ميكروليتر) من كل بئر لعلاج واستبدله مع D10 + إيدو الحل الذي أعد فقط. النهائي إيدو تركيز من 10 ميكرون.
    6. احتضان ح 18 – 24 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 و 5% O2. استخدم في نفس الوقت حضانة في خلايا مسن والتحكم.
    7. أغسل x 2 مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
    8. إصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق مع 500 ميكروليتر من 4% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني.
    9. احتضان 5 دقيقة في 500 ميكروليتر من 100 ملم تريس (درجة الحموضة 7.6).
    10. بيرميبيليزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 500 ميكروليتر 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
    11. أغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني.
    12. إعداد 50 ميكروليتر من مزيج التسمية لكل ساترة، إضافة المكونات بالترتيب التالي: 44.45 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، 0.5 ميليلتر من النحاس (II) هكذا4ميليلتر 0.05 من سالفو-Cy3-أزيد، 5 ميليلتر من اسكوربات الصوديوم.
    13. وضع 50 ميكروليتر من مزيج التسمية على قطعة من بارافيلم. رفع ساترة مع المعونة من زوج من ملاقط وابرة والسماح لها بالراحة على رأس هذا المزيج التسمية، مع السطح الذي يحتوي على الخلايا التي تواجه أسفل. التأكد من أن هناك لا فقاعات وأنه لمس السطح كله ساترة ميكس التسمية. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    14. وضع الخلايا في الآبار التي بليت 24-جيدا وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    15. جبل مع تركيب وسائل الإعلام (بما في ذلك DAPI لتصور نوى) على الشرائح الزجاجية والسماح لهم الجافة بين عشية وضحاها.
    16. تصور إدماج إيدو استخدام مجهر فلوري. استخدام عامل تصفية مناسب Cy3 (الإثارة/الانبعاثات: 552/570 نانومتر).
    17. التقاط صور متعددة من الخلايا بعد التقدير الكمي للخلايا على الأقل 100 كل شرط (Cy3 و DAPI).
    18. تقدير النسبة المئوية للخلايا التي أدرجت إيدو باستخدام الصيغة التالية:
      الخلايا إيجابية إيدو (%) = (عدد الخلايا إيجابية إيدو (Cy3)/إجمالي عدد الخلايا (DAPI)) * 100
    19. مقارنة نتائج الخلايا مسن مقابل سيطرتها المناسبة للمعالجة المستخدمة.
      ملاحظة: تلطيخ يشترك مع سا-β-غال على نفس العينة من الممكن. نعتبر أن الخلايا لا يزال يجب أن يكون المصنف في كوفيرسليبس.
  4. التعبير الجيني p16، p21، وساسب
    1. إعداد مجموعات التمهيدي "الجينات للفائدة" (التمهيدي كل 50 ميكرومتر).
      ملاحظة: qPCR p16، p21، وبعض العوامل ساسب ذات الصلة مفيدة لحالة الشيخوخة. البروتوكول الموصوفة هنا يجعل استخدام نظام المكتبة التحقيق العالمي (الأسعار) للتحديد الكمي النسبي باستخدام الوقت الحقيقي-PCR. ويبين الجدول 3 لمحة عامة عن أجهزة الإشعال المستخدمة للكشف عن CDK مثبطات p16 و p21 وأعضاء ساسب الأكثر صلة بالموضوع، فضلا عن Tubulin واكتين، والتي تكون بمثابة مرجع الجينات للفحص. وتنتقي العمود الأخير من الجدول 3 المسبار الأسعار خاصة لاستخدامها لكل فحص.
    2. إعداد مزيج رد فعل qPCR منفصلة لفحوصات المرجوة. وتشمل دائماً الجين المرجعية، وكذلك وفقا الجدول 4.
    3. تشغيل جميع العينات في تكرار أو ثلاث نسخ.
    4. تحميل 7.5 ميليلتر/جيدا من هذا المزيج رد فعل قبكر على لوحة 384-جيدا.
    5. إضافة ~ 5 نانوغرام كدنا حله في 2.5 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
      ملاحظة: من الأفضل أن تحتوي على كميات مماثلة من كدنا لجميع العينات بالمقارنة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام كميات متساوية من الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي.
    6. تغطية اللوحة مع ختم وتأكد من أنه عصي تغطي جميع الآبار بالتساوي على اللوحة بشكل صحيح.
    7. تدور اللوحة في 2,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
    8. تشغيل اللوحة في لايتسيكلير لدورات 40 استخدام بروتوكول التالية:
      95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق
      دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 5 s و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
      37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
    9. لتحليل النتائج، استخدم الأسلوب المقترح ليفاك والزملاء لتحليل البيانات قبكر24. استخدام توبولين أو أكتين الجينات المرجعية لحساب ΔCt القيمة واستخدام عنصر التحكم المناسب لحساب القيمة ΔΔCt للعلاج الذي يحفز الشيخوخة محددة.
  5. تعبير البروتين وإفراز IL6
    1. البذور 5 – 10 × 104 خلايا في بئر واحدة على الأقل من لوحة 6-جيدا (5.2 – 10.5 × 103 خلايا/سم2) كل شرط يتضمن 2 مل D10. يمكن إجراء العلاج (أن وجد) مباشرة على هذه اللوحة، أو بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الخلايا تعامل فعلا إعادة المصنف في لوحة 24-جيدا. فلنقف بين عشية وضحاها بعد البذر.
    2. إزالة المتوسطة واستبدال لمل 2 من دميم المتوسط دون FBS. احتضان في ظروف عادية ح 24.
    3. جمع المتوسطة في أنبوب 15 مل.
    4. يمكن تخزين أجهزة الطرد المركزي العينة في 300 x ز لأدنى 5 المتوسطة في-80 درجة مئوية حتى تتم معالجتها.
    5. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لأداء ELISA.
    6. مقارنة نتائج الخلايا مسن مقابل عنصر التحكم المناسب لعلاج الشيخوخة المسببة محددة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تخصيب اليورانيوم لتلطيخ سا-β-غال في الخلايا الليفية مسن

باء-جالاكتوسيداسي (β-غال) هو الإنزيمات الليزوزومية التي تتجلى في كافة الخلايا ويحتوي على درجة حموضة أمثل 4.0،من25إلى26. بيد أثناء الشيخوخة، ليسوسوميس زيادة في حجم، ونتيجة لذلك، تتراكم مسن الخلايا β-غال. المبالغ المتزايدة لهذا الإنزيم يجعل من الممكن الكشف عن نشاطها حتى في الرقم الهيدروجيني الأمثل 6.025...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

البروتوكولات وأوضح هنا هي الأمثل للبشرية الليفية الأولية، لا سيما الخلايا BJ وأي-38. بروتوكولات للشيخوخة ريبليكاتيفي والإشعاع المؤين وميتوتريكسات، قد طبقت بنجاح إلى أنواع أخرى من الخلايا الليفية (HCA2 و IMR90)، وفي أنواع أخرى من الخلايا (الخلايا الصباغية هي المواليد والخلايا الكيراتينيه أو cardiomyocytes المستمدة من اللجنة التوجيهية) في المختبر. ومع ذلك، يمكن أن يكون الأمثل تكييفات لأنواع الخلايا الإضافية عن طريق ضبط بعض التفاصيل مثل عدد خلايا المصنف، والأساليب والمواد الكيميائية لمساعدة الخلايا لإرفاق/فصل ليدعم البلاستي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

ونشكر أعضاء المختبر Demaria لمناقشات مثمرة، وليت van ثيجمين لتقاسم البيانات وبروتوكول بشأن الشيخوخة المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM Media - GlutaMAXGibco31966-047
هيكلونمصل الأبقار الجنينيSV30160.03
البنسلين الستربتومايسين (P / S ؛ 10,000 U / ml)LonzaDE17-602E
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-AldrichSC-202581
مياه خالية من النوتاز (غير معالج ب DEPC)AmbionAM9937
قارورة T75Sarstedt833911002
Trypsin / EDTA SolutionLonzaCC-5012
أقراص PBSGibco18912-014
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة Sigma-AldrichT9661-1000EA
Corning   ؛ أنابيب الطرد المركزي سعة 15 ملSigma-AldrichCLS430791
لوحة 6 آبارSarstedt83.3920
لوحة 24 بئرSarstedt83.3922
أغطية مستديرة 13 ممSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
Cesium137-sourceIBL 637 Cesium-137&جاما ؛ آلة الأشعة
فوق البنفسجية غرفةOpsytec ، د. Gö بيل BS-02
دوكسوروبيسين ثنائي هيدروكلوريد BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
محلول بيروكسيد الهيدروجينSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2'-deoxycytidineSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
زبدات الصوديوم  سيجما ألدريتشB5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)فيشر Scientific7240-90-6
حامض الستريك أحادي الهيدراتSigma-Aldrich5949-29-1
فوسفات ثنائي القاعدة الصوديومAcros organics7782-85-6
فيروسيانيد البوتاسيوم فيشر ساينتفيك14459-95-1
فيريسيانيد البوتاسيومفيشر ساینتفيك13746-66-2
كلوريد الصوديومميرك ميليبور7647-14-5
كلوريد المغنيسيومفيشر كيماويات7791-18-6
25٪ جلوتارالديهايدفيشر ساینتفيك111-30-8،7732-18-5
16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم)ثيرمو فيشر العلمي28908
EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)Lumiprobe10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)LumiprobeD1330
أسكوربات الصوديومسيجما-ألدريتشA4034
كبريتات النحاس (II) خماسي هيدرات (Cu (II) SO4< / sub>.5H2< / sub>O)سيجما ألدريتش209198
Triton X-100Acros organics215682500
قاعدة TRISRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384 ، أبيض & nbsp ؛Roche4729749001
Lightcycler 480 رقائق مانعة للتسرب  Roche4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit BiolineBIO-84020
UPL مكتبة مسبارSigma-Aldrichمختلف
Human IL-6 DuoSet ELISAR & DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Counting SlidesBio-Rad145-0017
حاضنة جافةThermo-Fisher ScientificHeratherm
DimethylformamideMerck Millipore1.10983
Parafilm 'M' فيلم مختبرBemis & nbsp ؛#PM992
ملاقط الإبر
الأشعة فوق البنفسجية

المراجع

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997(2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34(2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188(2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SA beta gal EdU p16 p21 SASP
التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.